绘制代谢图谱：在组织中直接监测乳酸脱氢酶活性

摘要

我们描述了一种用于在组织样本中直接绘制能够生成烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NAD(P)H）+ H+ 的酶类其酶活性空间分布的实验方案。

摘要

在空间和时间上定位酶活性对于理解正常组织和疾病状态下细胞行为的分子基础至关重要。原位代谢活性检测可提供有关组织内代谢活性空间分布的信息。本文提供了一种在组织样本中直接监测乳酸脱氢酶活性的详细实验方案。乳酸脱氢酶是决定摄入的葡萄糖通过有氧还是无氧糖酵解途径转化为能量的关键因素。将含有乳酸和NAD的溶液加入冷冻组织切片中。具有高乳酸脱氢酶活性的细胞会将提供的乳酸转化为丙酮酸，同时将提供的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）转化为NADH并释放一个质子；该反应可通过硝基四氮唑蓝还原为甲臜而被检测，甲臜呈现为蓝色沉淀物。我们描述了在小鼠皮肤中监测乳酸脱氢酶活性的详细步骤。应用此方案，我们发现皮肤中静息态毛囊干细胞的乳酸脱氢酶活性较高。将该方案应用于培养的小鼠胚胎干细胞时，结果显示胚胎干细胞的染色强度高于小鼠胚胎成纤维细胞。对新鲜分离的小鼠主动脉进行分析，发现染色主要出现在垂直于主动脉走向的平滑肌细胞中。本方法可用于在冷冻或新鲜组织中对产生质子的酶活性进行空间定位分析。

引言

了解酶在组织中哪些位置具有高或低活性，对于理解发育和生理过程至关重要。转录本或蛋白质水平常被用作酶活性的替代指标。尽管此类研究可能提供一定信息，但它们无法提供对确定酶活性至关重要的信息，例如翻译后修饰、蛋白质复合物的存在，或酶的亚细胞定位。当直接测量酶活性时，通常是在匀浆化的蛋白裂解液中进行监测，而此类样本已不再包含混合物中单个细胞的信息，也无法反映组织内具有高或低活性的细胞的空间分布情况。

我们在此提供一种详细的实验方案，用于绘制组织样本中酶活性空间分布图。该方法基于早期研究，证明四唑盐可用于定位冷冻组织中脱氢酶、还原酶和氧化酶的活性。¹采用这些方法时，当质子转移至四氮唑盐后，会形成一种水不溶性的甲臜。^2,3葡萄糖-6-磷酸脱氢酶可生成NADPH和一个质子，并可通过四唑盐活性检测。该酶的活性已在欧洲鲽肝细胞中进行监测。⁴肺泡Ⅱ型细胞中⁵ 肾脏的肾单位⁵四氮唑盐也已被用于监测冻存组织中转酮醇酶的活性⁶最近采用了一种类似的方法 用于在相邻切片上监测同一组织中多种脱氢酶的活性⁷.

本文介绍了一种利用四氮唑盐来监测乳酸脱氢酶活性空间分布的方法（图1）。乳酸脱氢酶能够将糖酵解产生的丙酮酸转化为乳酸，也可催化其逆向反应。因此，乳酸脱氢酶的活性是决定丙酮酸进入三羧酸循环还是以乳酸形式分泌的关键因素之一。血液中的乳酸水平常用于诊断多种疾病，包括癌症^8,9,10，因为乳酸升高可能提示机体存在疾病或损伤导致细胞受损，酶被释放。

乳酸脱氢酶基因有四种：LDHA、LDHB、LDHC 和 LDHD¹¹。LDHA 和 LDHB 被认为是由早期 LDHA 基因复制而来¹²。乳酸脱氢酶以四聚体形式发挥活性，LDHA 和 LDHB 可各自形成同源四聚体，也可相互结合形成异源四聚体。据报道，LDHA 对丙酮酸具有更高的亲和力，而 LDHB 对乳酸具有更高的亲和力，并倾向于将乳酸转化为丙酮酸¹³。LDHA 启动子区域含有 HIF1α、cMYC 和 FOXM1 转录因子的结合位点¹¹。此外，与其他多种糖酵解酶类似^14,15，LDH 可发生翻译后修饰。成纤维细胞生长因子受体 1 可在 Y10 位点磷酸化 LDHA，促进四聚体形成；或在 Y83 位点磷酸化，促进 NADH 底物结合¹⁶。LDHA 还可发生乙酰化修饰¹⁷。因此，要全面理解 LDH 的活性，不仅需要监测 LDH 蛋白的表达水平，还需同时检测其酶活性。

除了本文介绍的方法外，已有其他方法用于监测乳酸脱氢酶活性。乳酸脱氢酶活性可通过分光光度法在均质化的蛋白裂解液中进行检测。当乳酸转化为丙酮酸时，可依据在340 nm处的吸光度测定NADH的生成；而当丙酮酸转化为乳酸时，则可监测NADH的减少¹⁸。乳酸脱氢酶活性也可通过磁共振成像（MRI）进行监测。¹³C标记的丙酮酸可被施用，并通过监测[1-¹³C]乳酸/[1-¹³C]丙酮酸的比值来反映丙酮酸向乳酸的转化。在癌组织中已观察到[1-¹³C]乳酸/[1-¹³C]丙酮酸比值升高¹⁹。尽管基于MRI的方法可提供正常组织和病变组织中乳酸脱氢酶活性的信息，但这些方法缺乏确定特定细胞内酶活性水平所需的空间分辨率。本文所提供的方法则能够提供组织区域乃至单个细胞水平上的乳酸脱氢酶活性信息。

使用 原位 活性检测实验发现，小鼠皮肤毛囊干细胞中乳酸脱氢酶的活性较高²⁰我们还利用该方法检测了培养的胚胎干细胞中乳酸脱氢酶的活性，发现干细胞中的酶活性高于饲养层细胞。最后，我们检测了新鲜小鼠主动脉中乳酸脱氢酶的活性，观察到平滑肌细胞呈现染色阳性。本文详细描述了一种用于检测冷冻小鼠皮肤中乳酸脱氢酶活性的实验方案。

方案

所描述的所有实验均经加州大学洛杉矶分校动物护理委员会批准。

1. 制备小鼠冷冻皮肤切片

1. 根据机构政策对小鼠实施安乐死。
   注意：遵循机构关于防护服的规定。所有涉及动物的实验方案必须经过机构动物护理委员会批准。
2. 使用动物毛发修剪器去除小鼠体表毛发。
3. 使用剪刀在皮肤上做切口。用镊子将皮肤提起并脱离小鼠躯体，再用剪刀将皮肤组织剪下。
4. 用冷冻剂化合物填充冷冻模具（参见材料表）。
5. 用尖头镊子将皮肤组织放入已填充的冷冻模具中。调整皮肤方向，使后续切片可获得从表皮至真皮、皮下组织及肌肉的完整横截面（图2）。
   注意：如有可能，将实验组和对照组小鼠的组织置于同一冷冻模具中包埋，以便后续切片至同一载玻片并同时处理。注意避免产生气泡。
6. 将冷冻模具置于装有干冰的冰桶内金属平板上，使其冷冻。持续观察皮肤组织的方向，必要时进行调整。
   注意：操作干冰时应佩戴低温防护手套。
7. 将冷冻模具转移至 -80 °C 超低温冰箱中保存。样本可在冰箱中保存约3个月，而不会显著丧失酶活性。切勿让冷冻切片干燥。
8. 在 -20 °C 条件下使用冷冻切片机进行切片，制备厚度为 7 - 10 µm 的组织切片，以获得最佳皮肤形态结构²¹。

2. 染色用玻片的制备

1. 确定待检测的切片组。设置一个对照切片，不添加NAD；另设一个对照切片，不添加底物乳酸。同时包括一个来自先前研究过的冷冻组织包埋块的阳性对照切片。
2. 用4%甲醛对含有皮肤切片的玻片进行短暂固定，每张玻片加入1 mL 4%甲醛溶液，通过移液操作处理，或在处理多张玻片时，将玻片浸入盛有4%甲醛的容器中，固定5分钟。
   注意：固定可确保皮肤在后续操作中不会从玻片上脱落，并保持皮肤的形态结构。
   警示：甲醛为致癌物且具有危害性；操作时需佩戴手套，避免接触皮肤，并在化学通风橱中进行此步骤。
3. 每张玻片使用至少1 mL磷酸盐缓冲液（pH 7.4）进行洗涤，可通过移液或浸洗方式完成。

3. 配制染色液

1. 根据所需染色液的量，取适量试管，将乳酸脱氢酶活性染色试剂（50 mM Tris pH 7.4、750 µM NADP、80 µM phenazine methosulfate (PMS)、600 µM 硝基四氮唑蓝氯化物、30 mM 乳酸）混合后涡旋振荡。
   注意：1 mL 染色液足以完全覆盖一张载玻片。
2. 配制第二种溶液，其中包含除 NAD 外的所有试剂；再配制第三种溶液，其中包含除乳酸外的所有试剂。

4. 将切片在染色液中孵育

1. 轻轻将染色液或对照溶液加到已制备的载玻片上，确保完全覆盖组织切片（每张载玻片使用1 mL即可）。若同时处理多张载玻片，可将所有载玻片同时浸入染色液中（确保容器内有足够溶液完全覆盖组织切片）。
2. 将载玻片置于湿润环境中，37 °C 避光孵育。若染色液覆盖在载玻片上表面，需将载玻片置于湿润环境中，以防溶液蒸发。

5. 监测玻片

1. 通过目视观察染色液从无色变为蓝色的过程。当样本达到理想的蓝色程度后，移除染色液以终止反应。
   注意：对于皮肤组织，10 分钟已足够。染色时间需根据器官类型及酶活性进行调整。
2. 使用移液管滴加磷酸盐缓冲液（每张载玻片1 mL即可）或浸洗方式冲洗载玻片。
   注意：相互比较的样本必须在染色液中保持相同的时间。

6. 复染与封片

1. 当切片达到适当的蓝色程度时，向切片上滴加复染剂。
   注意：使细胞核呈现红色或绿色的复染剂可与甲臜沉淀产生的蓝色形成良好对比。
2. 使用水性或非水性封片介质封片²²。根据盖玻片的大小，滴加1至3滴（40 - 50 µL）封片介质即可。

7. 图像采集与定量分析

1. 在光学显微镜下观察载玻片，对实验样本、对照样本以及所有阴性对照样本分别在10X、20X和40X放大倍数下进行拍照。
2. 使用图像分析软件测定不同区域蓝色染色的强度。

结果

我们此前已报道过相关结果 原位 小鼠皮肤中的活性检测²⁰如图所示 图3我们观察到，按照上述步骤操作时，毛囊基底部的毛囊干细胞表现出高水平的乳酸脱氢酶活性。这些结果通过皮肤毛囊干细胞的荧光激活细胞分选得到验证，并对分选后的细胞进行活性检测，进一步确认了干细胞区室中乳酸脱氢酶的高活性。

根据我们发现毛囊干细胞具有高乳酸脱氢酶活性的结果，我们进一步拓展了对培养的胚胎干细胞的研究。作为饲养层的小鼠胚胎成纤维细胞被单独分析，或在与胚胎干细胞共培养的条件下进行分析。为分析培养的细胞，吸除培养基后，细胞经短暂固定，随后按照上述方法与乳酸脱氢酶染色液孵育。我们观察到胚胎干细胞中的乳酸脱氢酶活性显著高于小鼠胚胎成纤维细胞（图4）。

讨论

本文所述方法可用于监测组织内不同细胞类型或组织不同区域中乳酸脱氢酶或其他产生NADH或NADPH的代谢酶在时间进程中的活性。乳酸脱氢酶是理解干细胞和肿瘤生物学的重要酶，能够在单个细胞水平上监测其酶活性，有望为该酶的功能提供重要见解。

与其它方法相比，本方案的一个重要优势在于能够监测酶活性而不仅仅是蛋白质丰度，从而不仅可以获知乳酸脱氢酶存在的位置，还能明确其实际发挥功能的位置，提供更具结论性的信息。此处描述的方法可与免疫组织化学相结合，以便在同一组织样本中同时检测选定蛋白质（例如细胞谱系标志物）的表达水平和乳酸脱氢酶活性。与基于磁共振成像（MRI）的乳酸脱氢酶活性监测方法相比，本方案具有更高的空间分辨率，有助于确定组织中哪些特定细胞具有较高的酶活性。与基于荧光底物的代谢定位方法相比，本方案的信号检测不受自发荧光的限制¹。Miller 及其合作者通过监测向甲臜的转化，对五种不同酶的时间依赖性和底物依赖性进行了类似分析⁷。研究发现这些反应遵循酶动力学的化学计量原理。Miller 及其合作者通过...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
手术器械			用于采集安乐死小鼠的皮肤组织
Tissue-tek 冷冻模具 25 mm x 20 mm x 5 mm	Fisher Scientific	NC9511236	用于冷冻小鼠皮肤
Tissue-Tek O.C.T. 包埋剂	Fisher Scientific	NC9638938	用于固定冷冻模具
冰桶	Fisher Scientific	07-210-106
干冰
Polysine 黏附载玻片	Fisher Scientific	12-545-78
4% 甲醛	Fisher Scientific	23-245-684	用水稀释
磷酸盐缓冲液，pH 7.4
涡旋振荡器
Tris 碱	Fisher Scientific	23-245-684
NAD	Sigma-Aldrich	N7004
吩嗪甲基硫酸盐	Sigma-Aldrich	P9625
硝基四氮唑蓝氯化物	Sigma-Aldrich	N6876
L-乳酸锂	Sigma-Aldrich	L2250	底物
37°C 培养箱（或组织培养箱）
Braziliant! 复染剂	Anatech	861	复染剂
封片介质	Vector Laboratories	H-5000
载玻片盖玻片	Fisher Scientific	12-544D
光学显微镜