我们描述了一种用于在组织样本中直接绘制能够生成烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NAD(P)H）+ H+ 的酶类其酶活性空间分布的实验方案。
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本文内容
摘要
摘要
在空间和时间上定位酶活性对于理解正常组织和疾病状态下细胞行为的分子基础至关重要。原位代谢活性检测可提供有关组织内代谢活性空间分布的信息。本文提供了一种在组织样本中直接监测乳酸脱氢酶活性的详细实验方案。乳酸脱氢酶是决定摄入的葡萄糖通过有氧还是无氧糖酵解途径转化为能量的关键因素。将含有乳酸和NAD的溶液加入冷冻组织切片中。具有高乳酸脱氢酶活性的细胞会将提供的乳酸转化为丙酮酸，同时将提供的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）转化为NADH并释放一个质子；该反应可通过硝基四氮唑蓝还原为甲臜而被检测，甲臜呈现为蓝色沉淀物。我们描述了在小鼠皮肤中监测乳酸脱氢酶活性的详细步骤。应用此方案，我们发现皮肤中静息态毛囊干细胞的乳酸脱氢酶活性较高。将该方案应用于培养的小鼠胚胎干细胞时，结果显示胚胎干细胞的染色强度高于小鼠胚胎成纤维细胞。对新鲜分离的小鼠主动脉进行分析，发现染色主要出现在垂直于主动脉走向的平滑肌细胞中。本方法可用于在冷冻或新鲜组织中对产生质子的酶活性进行空间定位分析。
引言
了解酶在组织中哪些位置具有高或低活性，对于理解发育和生理过程至关重要。转录本或蛋白质水平常被用作酶活性的替代指标。尽管此类研究可能提供一定信息，但它们无法提供对确定酶活性至关重要的信息，例如翻译后修饰、蛋白质复合物的存在，或酶的亚细胞定位。当直接测量酶活性时，通常是在匀浆化的蛋白裂解液中进行监测，而此类样本已不再包含混合物中单个细胞的信息，也无法反映组织内具有高或低活性的细胞的空间分布情况。
我们在此提供一种详细的实验方案，用于绘制组织样本中酶活性空间分布图。该方法基于早期研究，证明四唑盐可用于定位冷冻组织中脱氢酶、还原酶和氧化酶的活性。1采用这些方法时，当质子转移至四氮唑盐后，会形成一种水不溶性的甲臜。2,3葡萄糖-6-磷酸脱氢酶可生成NADPH和一个质子，并可通过四唑盐活性检测。该酶的活性已在欧洲鲽肝细胞中进行监测。4肺泡Ⅱ型细胞中5 肾脏的肾单位5四氮唑盐也已被用于监测冻存组织中转酮醇酶的活性6最近采用了一种类似的方法 用于在相邻切片上监测同一组织中多种脱氢酶的活性7
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方案
所描述的所有实验均经加州大学洛杉矶分校动物护理委员会批准。
1. 制备小鼠冷冻皮肤切片
- 根据机构政策对小鼠实施安乐死。
注意：遵循机构关于防护服的规定。所有涉及动物的实验方案必须经过机构动物护理委员会批准。 - 使用动物毛发修剪器去除小鼠体表毛发。
- 使用剪刀在皮肤上做切口。用镊子将皮肤提起并脱离小鼠躯体，再用剪刀将皮肤组织剪下。
- 用冷冻剂化合物填充冷冻模具（参见材料表）。
- 用尖头镊子将皮肤组织放入已填充的冷冻模具中。调整皮肤方向，使后续切片可获得从表皮至真皮、皮下组织及肌肉的完整横截面（图2）。
注意：如有可能，将实验组和对照组小鼠的组织置于同一冷冻模具中包埋，以便后续切片至同一载玻片并同时处理。注意避免产生气泡。 - 将冷冻模具置于装有干冰的冰桶内金属平板上，使其冷冻。持续观察皮肤组织的方向，必要时进行调整。
注意：操作干冰时应佩戴低温防护手套。 - 将冷冻模具转移至 -80 °C 超低温冰箱中保存。样本可在冰箱中保存约3个月，而不会显著丧失酶活性。切勿让冷冻切片干燥。
- 在 -20 °C 条件下使用冷冻切片机进行切片，制备厚度为 7 - 10 µm 的组织切片，以获得最佳皮肤形态结构
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结果
我们此前已报道过相关结果 原位 小鼠皮肤中的活性检测20如图所示 图3我们观察到，按照上述步骤操作时，毛囊基底部的毛囊干细胞表现出高水平的乳酸脱氢酶活性。这些结果通过皮肤毛囊干细胞的荧光激活细胞分选得到验证，并对分选后的细胞进行活性检测，进一步确认了干细胞区室中乳酸脱氢酶的高活性。
根据我们发现毛囊干细胞具有高乳酸脱氢酶活性的结果，我们进一步拓展了对培养的胚胎干细胞的研究。作为饲养层的小鼠胚胎成纤维细胞被单独分析，或在与胚胎干细胞共培养的条件下进行分析。为分析培养的细胞，吸除培养基后，细胞经短暂固定，随后按照上述方法与乳酸脱氢酶染色液孵育。我们观察到胚胎干细胞中的乳酸脱氢酶活性显著高于小鼠胚胎成纤维细胞（图4）。
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讨论
本文所述方法可用于监测组织内不同细胞类型或组织不同区域中乳酸脱氢酶或其他产生NADH或NADPH的代谢酶在时间进程中的活性。乳酸脱氢酶是理解干细胞和肿瘤生物学的重要酶，能够在单个细胞水平上监测其酶活性，有望为该酶的功能提供重要见解。
与其它方法相比，本方案的一个重要优势在于能够监测酶活性而不仅仅是蛋白质丰度，从而不仅可以获知乳酸脱氢酶存在的位置，还能明确其实际发挥功能的位置，提供更具结论性的信息。此处描述的方法可与免疫组织化学相结合，以便在同一组织样本中同时检测选定蛋白质（例如细胞谱系标志物）的表达水平和乳酸脱氢酶活性。与基于磁共振成像（MRI）的乳酸脱氢酶活性监测方法相比，本方案具有更高的空间分辨率，有助于确定组织中哪些特定细胞具有较高的酶活性。与基于荧光底物的代谢定位方法相比，本方案的信号检测不受自发荧光的限制1。Miller 及其合作者通过监测向甲臜的转化，对五种不同酶的时间依赖性和底物依赖性进行了类似分析7。研究发现这些反应遵循酶动力学的化学计量原理。Miller 及其合作者通过.......
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披露
作者无任何竞争利益需要披露。
致谢
HAC 是丽塔·艾伦基金会（http://www.ritaallenfoundation.org）的米尔顿·E·卡塞尔学者。本研究由以下基金资助：美国国立普通医学科学研究所 R01 GM081686、R01 AR070245、美国国立普通医学科学研究所 R01 GM0866465 以及伊莱 & 埃迪丝·布罗德再生医学中心 & 干细胞研究（Rose Hills 和 Hal Gaba 奖项）、Iris Cantor 女性健康中心/UCLA CTSI 美国国立卫生研究院资助号 UL1TR000124、白血病与淋巴瘤学会、Jonsson 综合癌症中心授予 WEL 和 HAC 的 Impact 奖项。本出版物所报告的研究由美国国立卫生研究院国家癌症研究所资助奖项编号 P50CA092131 支持。资助方在研究设计、数据收集与分析、发表决定或稿件撰写过程中均未发挥任何作用。HAC 是 Eli & 埃迪丝·布罗德再生医学中心 &；干细胞研究，加州大学洛杉矶分校分子生物学研究所，以及加州大学洛杉矶分校生物信息学跨系项目。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 手术器械 | 用于采集安乐死小鼠的皮肤组织 | ||
| Tissue-tek 冷冻模具 25 mm x 20 mm x 5 mm | Fisher Scientific | NC9511236 | 用于冷冻小鼠皮肤 |
| Tissue-Tek O.C.T. 包埋剂 | Fisher Scientific | NC9638938 | 用于固定冷冻模具 |
| 冰桶 | Fisher Scientific | 07-210-106 | |
| 干冰 | |||
| Polysine 黏附载玻片 | Fisher Scientific | 12-545-78 | |
| 4% 甲醛 | Fisher Scientific | 23-245-684 | 用水稀释 |
| 磷酸盐缓冲液，pH 7.4 | |||
| 涡旋振荡器 | |||
| Tris 碱 | Fisher Scientific | 23-245-684 | |
| NAD | Sigma-Aldrich | N7004 | |
| 吩嗪甲基硫酸盐 | Sigma-Aldrich | P9625 | |
| 硝基四氮唑蓝氯化物 | Sigma-Aldrich | N6876 | |
| L-乳酸锂 | Sigma-Aldrich | L2250 | 底物 |
| 37°C 培养箱（或组织培养箱） | |||
| Braziliant! 复染剂 | Anatech | 861 | 复染剂 |
| 封片介质 | Vector Laboratories | H-5000 | |
| 载玻片盖玻片 | Fisher Scientific | 12-544D | |
| 光学显微镜 |
参考文献
- Boonacker, E., Van Noorden, C. J. Enzyme cytochemical techniques for metabolic mapping in living cells, with special reference to proteolysis. J Histochem Cytochem. 49, 1473-1486 (2001).
- Seidler, E. The tetrazolium-formazan syste....
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