突触处的FM染料循环：高钾去极化、电刺激与光敏通道蛋白刺激的比较

摘要

突触小泡（SV）循环是神经元突触处细胞间通讯的核心机制。FM染料的摄取与释放是定量检测SV内吞和外吐的主要方法。本文中，我们比较了在果蝇（Drosophila）神经肌肉接头（NMJ）模型突触上驱动FM1-43循环的所有刺激方法。

摘要

FM染料被用于研究突触囊泡（SV）循环。这些两亲性探针具有亲水头部和疏水尾部，使其既可溶于水，又能可逆地插入和脱离膜脂双层。这类苯乙烯基染料在水相环境中荧光较弱，但当其插入质膜的外小叶时，会引发荧光增强 >荧光信号增强40倍。在神经元突触中，FM染料在突触小泡内吞过程中被摄入，可在突触小泡池内及不同池之间转运，并随突触小泡的外吐作用而释放，从而为观察神经递质传递的突触前阶段提供了有力工具。谷氨酸能突触发育与功能的主要遗传模型是 果蝇 神经肌肉接头（NMJ），其中FM染料成像已被广泛用于在多种突变条件下定量分析突触小泡（SV）动态。NMJ的突触终末易于接近，具有排列美观且体积较大的突触膨体，非常适合成像应用。在此，我们比较和对比三种刺激方式 果蝇 神经肌肉接头处诱导活动依赖性FM1-43染料摄取/释放：1）高[K⁺]浴液灌流⁺] 去极化神经肌肉组织，2) 吸引电极刺激运动神经以去极化突触前神经末梢，以及 3) 靶向转基因表达通道视紫红质变体，实现光刺激下对去极化的空间精确控制。这些方法在研究基因突变对突触囊泡循环影响时各有优势与局限性 果蝇 NMJ。我们将讨论这些优点和缺点，以帮助选择刺激方法，并介绍每种策略特有的方法学。除了荧光成像外，FM染料还可通过光转化产生可在透射电子显微镜（TEM）下观察的电子致密信号，从而在超微结构水平上研究突触小泡循环机制。我们提供了不同方法在共聚焦显微镜和电子显微镜成像之间的比较 果蝇 神经肌肉接头刺激，以帮助指导未来实验范式的选取。

引言

特征清晰的 果蝇 幼虫神经肌肉接头（NMJ）谷氨酸能突触模型已被用于研究突触形成与功能，并广泛应用于多种遗传学干扰实验¹运动神经元末梢由多条轴突分支构成，每条分支上均有多个膨大的突触小结。这些膨大的曲张体（直径可达5 µm）含有完整的神经递质传递装置，包括细胞质储备池和易释放池中的均一谷氨酸能突触囊泡（SVs；直径约40 nm）。²这些囊泡停靠在突触前质膜的融合位点——活性区（AZs），通过胞吐作用介导谷氨酸神经递质的释放。 转-突触间通讯。随后，突触小泡通过“亲吻-逃跑”型再循环或网格蛋白介导的内吞作用（CME）从质膜上回收，以进行多次胞吐/胞吞循环。 果蝇 神经肌肉接头易于获取，非常适合用于分离和鉴定突触囊泡循环突变体。通过正向遗传学筛选，新发现的突变已促成多个对突触囊泡循环至关重要的新基因的鉴定³此外，从已知基因出发的反向遗传学方法，通过细致描述突变体的循环表型，揭示了新的SV循环机制。⁴。该 果蝇 NMJ 几乎是通过光学追踪神经递质传递过程中囊泡循环的方法来解析突触小泡内吞和外排机制的理想实验性突触模型。

多种荧光标记物可用于在囊泡循环动态过程中进行可视化追踪，其中用途最广的是FM染料类似物，该染料最初由Ma....

方案

1. 幼虫胶腺解剖

1. 从弹性体试剂盒中将10份硅酮弹性体基础剂与1份硅酮弹性体固化剂充分混合（材料表）。
2. 用该弹性体涂覆22 × 22 mm的玻璃盖玻片，并在75 ˚C的加热板上固化数小时（直至触摸不再发黏）。
3. 将一片涂有弹性体的玻璃盖玻片放入定制的聚甲基丙烯酸甲酯（plexi glass）解剖室（图1，底部），以备幼虫解剖使用。
4. 使用标准微电极拉制仪，将硼硅酸盐玻璃毛细管拉制成所需锥度和尖端尺寸的胶水移液管。
5. 轻轻折断微移液管尖端，并在另一端连接一段2英尺长的柔性塑料管（内径1/32英寸，ID；外径3/32英寸，OD；管壁厚1/32英寸；材料表），并配备吹嘴（P2移液器吸头）。
6. 准备一个小容器（0.6 mL离心管盖），加入少量胶水（约20 µL）（材料表），以备幼虫解剖使用。
7. 向解剖室中加入生理盐水（单位：mM）：128 NaCl、2 KCl、4 MgCl₂、1 CaCl₂、70 蔗糖和5 2-[4-(2-羟乙基)哌嗪-1-基]乙磺酸（HEPES），pH调至7.2。
8. 加入与Alexa Fluor 647偶联的抗辣根过氧化物酶（HRP）抗体（anti-HRP:647；从....

结果

图1 展示了活动依赖性FM染料成像实验方案的工作流程。无论后续采用何种刺激方法，实验均以相同的幼虫胶固定解剖步骤开始。 图1a 是解剖后幼虫的示意图，显示腹神经索（VNC）、辐射状神经及重复的半节段肌肉模式。移除腹神经索后，将标本置于浴液中 4 µM FM1-43 溶液图1b，粉红色）。随后，在存在FM染料的情况下，通过以下三种可能方式之一刺激样品，以经由活动依赖性突触小泡内吞作用加载染料图1cI-III。接着，使用 Ca 终止 FM 染料循环²⁺无钙生理盐水灌流后，使用共聚焦显微镜对已加载FM染料的特定神经肌肉接头终末进行成像（“加载后图像”； 图1d）。在此情况下，选择肌肉4的NMJ，示意图显示了神经的位置、NMJ末端.......

讨论

高[K⁺]盐水去极化刺激是目前三种活动依赖性FM染料循环方法中最简单的，但生理相关性可能最低²⁹。这种简单方法会使整个动物体内所有可及的细胞发生去极化，因此无法进行定向研究。虽然有可能通过微移液管局部施加高[K⁺]盐水，但这仍会导致突触前/突触后细胞以及可能的突触相关胶质细胞去极化¹。另一个主要问题是，高[K⁺]去极化会驱动大量大胞饮体（bulk endosomes）的快速形成，而这类结构在未受刺激的突触小体中极为罕见。然而，大胞饮体的形成是一种可被突变阻断的主动机制²⁹，表明其代表真实的生理过程。因此，结合高[K⁺]去极化进行FM1-43成像可用于选择性研究突触处的大胞饮作用。通过吸吮电极对运动神经进行电刺激是一种更为可控的方法。其优势在于仅刺激单个轴突束，且仅直接使突触前终末去极化（当然，随后神经递质作用会使肌纤维去极化）。因此，该方法可在同一动物内提供未受刺激的神经肌肉接头（NMJ）作为良好的内部对照。.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
SylGard 184 硅酮弹性体试剂盒	Fisher Scientific	NC9644388	用于解剖时覆盖盖玻片
显微镜盖玻片 22x22-1	Fisherbrand	12-542-B	用于承载 SylGard 以进行解剖
铝制顶板加热板 Type 2200	Thermolyne	HPA2235M	用于固化 SylGard
聚甲基丙烯酸甲酯（有机玻璃）解剖室	N/A	N/A	手工制作
硼硅酸盐玻璃毛细管	WPI	1B100F-4	用于制作吸管和胶合微电极
激光微电极拉制仪	Sutter Instrument	P-2000	用于制作吸管和胶合微电极
Tygon E-3603 实验室软管	Component Supply Co.	TET-031A	用于口吸管和吸液微电极
P2 移液器吸头	USA Scientific	1111-3700	用于口吸管
0.6 mL Eppendorf 管盖	Fisher Scientific	05-408-120	用于盛放解剖用胶
Vetbond 3M	WPI	vetbond	用于解剖的胶水
氯化钾	Fisher Scientific	P-217	用于生理盐水配制
氯化钠	Millipore Sigma	S5886	用于生理盐水配制
氯化镁	Fisher Scientific	M35-500	用于生理盐水配制
二水合氯化钙	Millipore Sigma	C7902	用于生理盐水配制
蔗糖	Fisher Scientific	S5-3	用于生理盐水配制
HEPES	Millipore Sigma	H3375	用于生理盐水配制
HRP:Alexa Fluor 647	Jackson ImmunoResearch	123-605-021	用于标记神经元膜
画笔	Winsor & Newton	94376864793	用于操作幼虫
Dumont Dumostar 镊子 #5	WPI	500233	解剖过程中使用
7 cm McPherson-Vannas 显微剪刀（刀片 3 mm）	WPI	14177	解剖过程中使用
FM1-43	Fisher Scientific	T35356	荧光苯乙烯染料
数字计时器	VWR	62344-641	用于 FM 染料加载/卸载的定时
LSM 510 META 激光扫描共聚焦显微镜	Zeiss		用于荧光标记物成像
Zen 2009 SP2 版本 6.0	Zeiss		共聚焦成像软件
HeNe 633 nm 激光器	Lasos		成像时激发 HRP:647
氩离子 488 nm 激光器	Lasos		成像时激发 FM 染料
微电极抛光仪	WPI	MF200	用于烧制抛光玻璃微电极
20 mL 滑动式针筒	BD	301625	用于吸取轴突以进行电刺激
微操纵器（磁性底座）	Narishige	MMN-9	用于控制电刺激用的吸电极
刺激器	Grass	S48	用于控制 LED 和电刺激
Zeiss Axioskop 显微镜	Zeiss		电刺激过程中使用
40X Achroplan 水浸物镜	Zeiss		用于电刺激和共聚焦成像
全反式视黄醛	Millipore Sigma	R2500	ChR2 所需的辅因子
带相机接口的 Zeiss Stemi 显微镜	Zeiss	2000-C	用于视蛋白通道刺激
470 nm LED	ThorLabs	M470L2	用于激活 ChR
T-Cube LED 驱动器	ThorLabs	LEDD1B	用于控制 LED
LED 电源	Cincon Electronics Co.	TR15RA150	为 LED 供电
光功率和能量计	ThorLabs	PM100D	用于测量 LED 强度