突触处的FM染料循环：高钾去极化、电刺激与光敏通道蛋白刺激的比较

摘要

突触小泡（SV）循环是神经元突触处细胞间通讯的核心机制。FM染料的摄取与释放是定量检测SV内吞和外吐的主要方法。本文中，我们比较了在果蝇（Drosophila）神经肌肉接头（NMJ）模型突触上驱动FM1-43循环的所有刺激方法。

摘要

FM染料被用于研究突触囊泡（SV）循环。这些两亲性探针具有亲水头部和疏水尾部，使其既可溶于水，又能可逆地插入和脱离膜脂双层。这类苯乙烯基染料在水相环境中荧光较弱，但当其插入质膜的外小叶时，会引发荧光增强 >荧光信号增强40倍。在神经元突触中，FM染料在突触小泡内吞过程中被摄入，可在突触小泡池内及不同池之间转运，并随突触小泡的外吐作用而释放，从而为观察神经递质传递的突触前阶段提供了有力工具。谷氨酸能突触发育与功能的主要遗传模型是 果蝇 神经肌肉接头（NMJ），其中FM染料成像已被广泛用于在多种突变条件下定量分析突触小泡（SV）动态。NMJ的突触终末易于接近，具有排列美观且体积较大的突触膨体，非常适合成像应用。在此，我们比较和对比三种刺激方式 果蝇 神经肌肉接头处诱导活动依赖性FM1-43染料摄取/释放：1）高[K⁺]浴液灌流⁺] 去极化神经肌肉组织，2) 吸引电极刺激运动神经以去极化突触前神经末梢，以及 3) 靶向转基因表达通道视紫红质变体，实现光刺激下对去极化的空间精确控制。这些方法在研究基因突变对突触囊泡循环影响时各有优势与局限性 果蝇 NMJ。我们将讨论这些优点和缺点，以帮助选择刺激方法，并介绍每种策略特有的方法学。除了荧光成像外，FM染料还可通过光转化产生可在透射电子显微镜（TEM）下观察的电子致密信号，从而在超微结构水平上研究突触小泡循环机制。我们提供了不同方法在共聚焦显微镜和电子显微镜成像之间的比较 果蝇 神经肌肉接头刺激，以帮助指导未来实验范式的选取。

引言

特征清晰的 果蝇 幼虫神经肌肉接头（NMJ）谷氨酸能突触模型已被用于研究突触形成与功能，并广泛应用于多种遗传学干扰实验¹运动神经元末梢由多条轴突分支构成，每条分支上均有多个膨大的突触小结。这些膨大的曲张体（直径可达5 µm）含有完整的神经递质传递装置，包括细胞质储备池和易释放池中的均一谷氨酸能突触囊泡（SVs；直径约40 nm）。²这些囊泡停靠在突触前质膜的融合位点——活性区（AZs），通过胞吐作用介导谷氨酸神经递质的释放。 转-突触间通讯。随后，突触小泡通过“亲吻-逃跑”型再循环或网格蛋白介导的内吞作用（CME）从质膜上回收，以进行多次胞吐/胞吞循环。 果蝇 神经肌肉接头易于获取，非常适合用于分离和鉴定突触囊泡循环突变体。通过正向遗传学筛选，新发现的突变已促成多个对突触囊泡循环至关重要的新基因的鉴定³此外，从已知基因出发的反向遗传学方法，通过细致描述突变体的循环表型，揭示了新的SV循环机制。⁴。该 果蝇 NMJ 几乎是通过光学追踪神经递质传递过程中囊泡循环的方法来解析突触小泡内吞和外排机制的理想实验性突触模型。

多种荧光标记物可用于在囊泡循环动态过程中进行可视化追踪，其中用途最广的是FM染料类似物，该染料最初由Mao, F., et al.⁵ 合成。从结构上看，FM染料包含一个亲水性头部和一个通过芳香环连接的疏水性尾部，其中央区域赋予其光谱特性。这类苯乙烯基染料可逆地插入膜中，不会在膜双层小叶之间“翻转”，因此从不游离于细胞质中，且在膜中的荧光强度远高于在水中⁵。可逆插入脂双层可使荧光强度提高40倍⁶。在神经元突触处，经典的FM染料标记实验包括在去极化刺激期间将突触标本浸入染料中，通过突触囊泡（SV）的内吞作用加载染料。随后洗去外部染料，并将突触循环阻断于无钙任氏液中，以成像已加载染料的突触⁷。在无染料溶液中进行第二轮刺激可触发FM染料通过胞吐作用释放，该过程可通过检测荧光强度的下降进行追踪。从单个囊泡到包含数百个囊泡的池，不同规模的突触囊泡群体均可被定量监测^6,7。FM染料已被用于解析活动依赖性的功能异质性突触囊泡池的动员机制，并比较“吻即走”（kiss-and-run）与网格蛋白介导的内吞（CME）循环模式^8,9。该方法已被改进，可用于分别检测诱发性、自发性和微小突触循环活动（需使用高灵敏度设备以检测极微小的荧光变化并减少光漂白）¹⁰。通过将荧光FM信号光转化成电镜下可见的致密标记物，该检测方法还可拓展至超微结构水平，用于透射电子显微镜分析^11,12,13,14。

传统上，将突触制备物浸泡在高浓度钾离子溶液中（下文简称为"高 [K⁺]"）是诱导突触小泡（SV）循环的首选去极化刺激方法，该方法已广泛应用于多种模型系统，包括蛙类的胆碱能神经肌肉接头（NMJ）⁵、培养的大鼠脑海马神经元¹⁵，以及果蝇（Drosophila）的谷氨酸能神经肌肉接头模型^16,17。高 [K⁺] 方法操作简便，无需特殊设备，因此大多数实验室均可实施，但在应用和数据解读方面存在一定局限性。一种更为符合生理条件的方法是采用吸吮电极对神经进行电刺激^4,5,12。该方法通过诱发动作电位传播，直接刺激突触前神经末梢，所得结果可与神经递质释放功能的电生理检测结果直接比较^13,14,15，但需要专用设备，技术难度也显著更高。随着光遗传学的发展，利用通道视紫红质（channelrhodopsin）进行神经元刺激展现出额外优势，例如可通过二元 Gal4/UAS 系统实现通道表达的精确时空控制²⁰。该方法在技术上远比吸吮电极刺激简便，仅需一个成本极低的LED光源即可实现。本文中，我们采用FM1-43（N-(3-三乙基铵丙基)-4-(4-(二丁基氨基)苯乙烯基)吡啶二溴化物）成像技术，对果蝇（Drosophila）神经肌肉接头处这三种不同的刺激方法——简单的高 [K⁺] 刺激、技术难度较高的电刺激以及新兴的通道视紫红质刺激方法——进行比较与分析。

方案

1. 幼虫胶腺解剖

1. 从弹性体试剂盒中将10份硅酮弹性体基础剂与1份硅酮弹性体固化剂充分混合（材料表）。
2. 用该弹性体涂覆22 × 22 mm的玻璃盖玻片，并在75 ˚C的加热板上固化数小时（直至触摸不再发黏）。
3. 将一片涂有弹性体的玻璃盖玻片放入定制的聚甲基丙烯酸甲酯（plexi glass）解剖室（图1，底部），以备幼虫解剖使用。
4. 使用标准微电极拉制仪，将硼硅酸盐玻璃毛细管拉制成所需锥度和尖端尺寸的胶水移液管。
5. 轻轻折断微移液管尖端，并在另一端连接一段2英尺长的柔性塑料管（内径1/32英寸，ID；外径3/32英寸，OD；管壁厚1/32英寸；材料表），并配备吹嘴（P2移液器吸头）。
6. 准备一个小容器（0.6 mL离心管盖），加入少量胶水（约20 µL）（材料表），以备幼虫解剖使用。
7. 向解剖室中加入生理盐水（单位：mM）：128 NaCl、2 KCl、4 MgCl₂、1 CaCl₂、70 蔗糖和5 2-[4-(2-羟乙基)哌嗪-1-基]乙磺酸（HEPES），pH调至7.2。
8. 加入与Alexa Fluor 647偶联的抗辣根过氧化物酶（HRP）抗体（anti-HRP:647；从1 mg/mL原液稀释1:10），用于在解剖过程中标记NMJ的突触前终末^21,22。
9. 使用细毛刷（2号），从食物瓶中取出一只爬行的三龄幼虫，放置于涂有弹性体的盖玻片上。
10. 通过连接吹嘴（步骤1.5）用口部产生负压，将少量胶水吸入玻璃微移液管尖端。
11. 用镊子将幼虫背面向上固定，并通过口部施加正压，用一小滴胶水将头部粘附在涂有弹性体的盖玻片上。
12. 对幼虫后端重复此操作，确保动物在两个胶点之间被拉直绷紧。
13. 使用剪刀（刀片长3 mm；材料表），在后端做一横向切口（约1 mm），并沿背侧中线做一纵向切口。
14. 使用精细镊子（#5，材料表），轻柔地移除覆盖肌肉组织的背侧气管、肠道、脂肪体及其他内脏器官。
15. 对四个体壁瓣重复粘贴操作，确保体壁在水平和垂直方向均被轻柔拉伸。
16. 用镊子提起腹神经索（VNC），小心用剪刀切断运动神经，然后完全移除腹神经索。
17. 用无Ca²⁺生理盐水（成分同上述解剖用生理盐水，但不含CaCl₂）替换原有解剖液，以终止突触小泡循环。

2. 选项一：高[K⁺] FM染料负载

1. 从 FM1-43 储存液（4 mM）中取 1 µL，加入 1 mL 的 90 mM KCl 溶液（含高浓度 [K⁺] 的解剖生理盐水）中，终浓度为 4 µM。
2. 使用移液器将成像 chamber 中的无 Ca²⁺ 生理盐水更换为高 [K⁺] FM 染料溶液，以刺激突触小泡内吞过程中的染料摄取。
3. 立即启动数字计时器，持续时间为预先确定的高 [K⁺] 去极化刺激时间（例如，5 分钟；图 2）。
4. 为确认幼虫样本处于健康状态，应观察到在整个高 [K⁺] 去极化期间肌肉组织出现强烈收缩。
5. 当计时结束时，迅速移除高 [K⁺] FM 染料溶液，并替换为无 Ca²⁺ 生理盐水，以终止突触小泡循环。
6. 用无 Ca²⁺ 生理盐水快速连续洗涤（5 次，每次 1 分钟），确保完全去除高 [K⁺] FM 染料溶液。
7. 将幼虫样本维持在新鲜的无 Ca²⁺ 生理盐水中，立即进行共聚焦显微镜成像。

3. 成像：共聚焦显微镜

1. 使用配备40倍水浸物镜的直立共聚焦显微镜对NMJ染料荧光进行成像（也可使用其他显微镜）。
2. 对腹部第2–4节段的肌肉4 NMJ进行成像（也可成像其他NMJ），并使用适当的软件（材料表）采集图像。
3. 使用HeNe 633 nm激光激发HRP:647（配备长通滤光片 > 635 nm），使用Ar 488 nm激光激发FM1-43（配备带通滤光片530–600 nm）。
4. 操作上确定两个通道的最佳增益和偏移值。
   注意：这些设置将在后续整个实验中保持不变。
5. 对选定的NMJ从HRP标记的突触末端顶部到底部进行完整的共聚焦Z轴扫描。
6. 仔细记录所成像的NMJ（节段、侧别和肌肉），以确保在FM染料卸载后能准确定位到完全相同的NMJ。

4. 高 [K⁺] 刺激：FM 染料卸载

1. 用高 [K⁺] 生理盐水（不含 FM1-43 染料）替换无 Ca²⁺ 的生理盐水，以诱导去极化、突触小泡（SV）胞吐及染料释放。
2. 立即启动数字计时器，持续时间为预先确定的高 [K⁺] 刺激时间（例如，2 分钟；图 2）。
3. 计时结束后，立即移除高 [K⁺] 生理盐水，并替换为无 Ca²⁺ 的生理盐水，以终止突触小泡循环。
4. 连续快速用无 Ca²⁺ 生理盐水洗涤（每次 1 分钟，共 5 次），确保完全去除高 [K⁺] 生理盐水。
5. 将幼虫标本保持在新鲜的无 Ca²⁺ 生理盐水中，立即进行共聚焦显微镜成像。
6. 务必使用相同的共聚焦设置，在上述相同的神经肌肉接头（NMJ）位置检测 FM1-43 染料荧光。

5. 选项2：电刺激FM染料加载

1. 使用微电极拉制仪制备一根吸吮电极（材料表）以获得所需的拉锥形状和尖端尺寸。
2. 使用微电极拉制仪将微电极尖端进行火焰抛光，直至能够紧密地吸入单根运动神经。
3. 将吸液移液管滑入显微操作器上的电极夹持器中，并连接至长的柔性塑料管和注射器。
4. 设置刺激器参数（例如，15 V，20 Hz 频率，20 ms 持续时间，持续 5 分钟（图2）或 1 分钟（图3)).
5. 替换 Ca²⁺用上述含 FM1-43 的生理盐水替换幼虫制备物中的无 FM1-43 生理盐水（4 µM；1 mM CaCl₂在电生理实验装置上。
6. 将样本置于显微镜载物台上，升高载物台直至幼虫和吸管在视野中清晰对焦（使用40倍水浸物镜）。
7. 用注射器产生的负压将支配所选半节段的切断运动神经环吸入吸电极中。
8. 在选定的半体节中，通过短暂的刺激脉冲测试吸吮电极功能，同时肉眼观察肌肉收缩情况。
9. 使用选定的参数（步骤 5.4）刺激运动神经，以驱动突触小泡内吞和 FM1-43 染料摄取（图2).
10. 用 Ca 迅速连续洗涤²⁺无染料生理盐水（每次1分钟，共5次）以确保完全去除FM1-43染料溶液。
11. 将幼虫标本保存于新鲜的 Ca²⁺- 立即使用上述共聚焦成像方案进行成像的无钙盐溶液。
12. 仔细记录所成像的神经肌肉接头（NMJ）位置（体节、侧别和肌肉），以确保在FM染料卸载后能够准确定位到同一个NMJ。

6. 电刺激：FM 染料卸载

1. 替换 Ca²⁺用不含FM1-43染料的正常生理盐水替换无钙盐水，并将标本重新放回电生理记录装置的载物台上。
2. 设置刺激器参数以进行卸载（例如，15 V，20 Hz 频率，20 ms 持续时间，持续时间为 2 分钟（图2）或 20 秒（图3)).
3. 将同一运动神经吸入上述同一电极中，然后进行刺激以激活突触小泡胞吐及FM1-43染料释放。
4. 用 Ca 迅速连续洗涤²⁺无染料生理盐水（每次1分钟，共5次）以确保完全去除外部染料。
5. 将幼虫标本保存于新鲜的 Ca²⁺无钙盐溶液，用于共聚焦显微镜的即时成像。
6. 使用相同的共聚焦设置，对上述同一神经肌肉接头处的FM1-43染料荧光进行成像。

7. 选项3：通道视紫红质刺激FM染料加载

1. 将表达 ChR2 的幼虫饲养在含有 ChR2 辅因子全反式视黄醛（溶于乙醇；100）的食物上 µM 终浓度）
2. 将幼虫标本置于配备有相机接口的解剖显微镜载物台上的聚甲基丙烯酸甲酯腔室中。
3. 连接一个蓝色LED（470 nm； 材料清单) 使用同轴电缆连接至可编程刺激器，并将LED放入相机端口。
4. 使用显微镜的变焦功能，将蓝色LED光束聚焦到解剖后的幼虫组织上。
5. 替换 Ca²⁺用上述含 FM1-43 的生理盐水替换幼虫制备物中的无染料生理盐水（4 µM；1 mM CaCl₂) 在光遗传学实验阶段。
6. 使用刺激器设置LED参数（例如，15 V，20 Hz 频率，20 ms 持续时间，持续时间为 5 分钟（图2)).
7. 启动光刺激，并使用计时器跟踪预设的光遗传刺激持续时间（例如，5 分钟； 图2).
8. 当计时器停止时，迅速移除FM染料溶液，并替换为Ca²⁺用无钙生理盐水终止突触小泡循环。
9. 用 Ca 连续快速洗涤²⁺无染料生理盐水（5次，每次1分钟），以确保完全去除FM染料溶液。
10. 将幼虫标本保存于新鲜的 Ca²⁺- 立即使用上述成像方案，以无钙盐溶液进行共聚焦显微镜成像。
11. 仔细记录所成像的神经肌肉接头（NMJ）位置（体节、侧别及肌肉），以确保在FM染料卸载后能够准确定位到同一NMJ。

8. 通道视紫红质刺激：FM 染料卸载

1. 替换 Ca²⁺在解剖显微镜载物台上，用不含 FM1-43 染料的正常生理盐水替换无钙盐水，同时将相机端 LED 聚焦于幼虫。
2. 设置刺激器参数以进行卸载（例如， 15 V，20 Hz 频率，20 ms 持续时间，持续 2 分钟图2)).
3. 启动光刺激，并使用计时器跟踪预先设定的光遗传刺激持续时间（例如， 2 分钟； 图2).
4. 当计时器时段结束时，迅速移除 FM 染料溶液，并替换为 Ca²⁺用无钙生理盐水终止突触小泡循环。
5. 用 Ca 迅速连续洗涤²⁺无染料生理盐水（每次1分钟，共5次）以确保完全去除外部染料。
6. 将幼虫标本保存于新鲜的 Ca²⁺无钙盐溶液，立即用于共聚焦显微镜成像。
7. 确保使用相同的共聚焦设置，在上述同一神经肌肉接头处成像FM1-43染料的荧光。

9. 荧光定量

1. 在 Image J（NIH 开源软件）中加载图像，通过点击 图像 | 堆栈 | Z 投影，创建最大强度投影。
2. 使用抗 HRP:647 通道，进入 图像 | 调整 | 阈值，滑动顶部工具栏，直至仅突触部位被高亮显示。
3. 使用魔棒工具，点击突触部位。如果突触部位不连续，按住 Shift 键并选择所有部分。
4. 将图像切换至 FM1-43 染料通道，进入 分析 | 测量，以获取荧光强度值。
5. 对同一突触部位（已识别的区段、侧边和肌肉）的“未加载”图像重复步骤 9.1–9.4。
6. 为计算染料卸载的百分比，取未加载与加载荧光强度的比值。
   注意：本流程可进行修改，使用“椭圆”或“自由手绘”选择工具，实现按单个突触小泡逐一分析荧光强度。可通过采集肌肉区域的荧光信号来扣除背景荧光，也可添加试剂以降低背景信号。

结果

图1展示了基于活动依赖的FM染料成像实验流程。无论后续采用何种刺激方法，实验均始于相同的幼虫胶固定解剖步骤。图1a为解剖后幼虫的示意图，显示腹神经索（VNC）、辐射状神经及重复的半节段肌肉排列。去除腹神经索后，将样本浸入4 µM的FM1-43溶液中（图1b，粉色）。随后在FM染料存在下，采用三种可能方式之一对样本进行刺激，通过活动依赖的突触小泡（SV）内吞作用将染料载入（图1cI-III）。接着使用无Ca²⁺的人工脑脊液终止FM染料循环，并利用共聚焦显微镜对已载入FM染料的特定神经肌肉接头（NMJ）终末进行成像（“载入图像”；图1d）。本例中选择肌肉4的NMJ，示意图显示了神经位置、NMJ终末分支结构以及载有FM染料的突触...

讨论

高[K⁺]盐水去极化刺激是目前三种活动依赖性FM染料循环方法中最简单的，但生理相关性可能最低²⁹。这种简单方法会使整个动物体内所有可及的细胞发生去极化，因此无法进行定向研究。虽然有可能通过微移液管局部施加高[K⁺]盐水，但这仍会导致突触前/突触后细胞以及可能的突触相关胶质细胞去极化¹。另一个主要问题是，高[K⁺]去极化会驱动大量大胞饮体（bulk endosomes）的快速形成，而这类结构在未受刺激的突触小体中极为罕见。然而，大胞饮体的形成是一种可被突变阻断的主动机制²⁹，表明其代表真实的生理过程。因此，结合高[K⁺]去极化进行FM1-43成像可用于选择性研究突触处的大胞饮作用。通过吸吮电极对运动神经进行电刺激是一种更为可控的方法。其优势在于仅刺激单个轴突束，且仅直接使突触前终末去极化（当然，随后神经递质作用会使肌纤维去极化）。因此，该方法可在同一动物内提供未受刺激的神经肌肉接头（NMJ）作为良好的内部对照。...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
SylGard 184 硅酮弹性体试剂盒	Fisher Scientific	NC9644388	用于解剖时覆盖盖玻片
显微镜盖玻片 22x22-1	Fisherbrand	12-542-B	用于承载 SylGard 以进行解剖
铝制顶板加热板 Type 2200	Thermolyne	HPA2235M	用于固化 SylGard
聚甲基丙烯酸甲酯（有机玻璃）解剖室	N/A	N/A	手工制作
硼硅酸盐玻璃毛细管	WPI	1B100F-4	用于制作吸管和胶合微电极
激光微电极拉制仪	Sutter Instrument	P-2000	用于制作吸管和胶合微电极
Tygon E-3603 实验室软管	Component Supply Co.	TET-031A	用于口吸管和吸液微电极
P2 移液器吸头	USA Scientific	1111-3700	用于口吸管
0.6 mL Eppendorf 管盖	Fisher Scientific	05-408-120	用于盛放解剖用胶
Vetbond 3M	WPI	vetbond	用于解剖的胶水
氯化钾	Fisher Scientific	P-217	用于生理盐水配制
氯化钠	Millipore Sigma	S5886	用于生理盐水配制
氯化镁	Fisher Scientific	M35-500	用于生理盐水配制
二水合氯化钙	Millipore Sigma	C7902	用于生理盐水配制
蔗糖	Fisher Scientific	S5-3	用于生理盐水配制
HEPES	Millipore Sigma	H3375	用于生理盐水配制
HRP:Alexa Fluor 647	Jackson ImmunoResearch	123-605-021	用于标记神经元膜
画笔	Winsor & Newton	94376864793	用于操作幼虫
Dumont Dumostar 镊子 #5	WPI	500233	解剖过程中使用
7 cm McPherson-Vannas 显微剪刀（刀片 3 mm）	WPI	14177	解剖过程中使用
FM1-43	Fisher Scientific	T35356	荧光苯乙烯染料
数字计时器	VWR	62344-641	用于 FM 染料加载/卸载的定时
LSM 510 META 激光扫描共聚焦显微镜	Zeiss		用于荧光标记物成像
Zen 2009 SP2 版本 6.0	Zeiss		共聚焦成像软件
HeNe 633 nm 激光器	Lasos		成像时激发 HRP:647
氩离子 488 nm 激光器	Lasos		成像时激发 FM 染料
微电极抛光仪	WPI	MF200	用于烧制抛光玻璃微电极
20 mL 滑动式针筒	BD	301625	用于吸取轴突以进行电刺激
微操纵器（磁性底座）	Narishige	MMN-9	用于控制电刺激用的吸电极
刺激器	Grass	S48	用于控制 LED 和电刺激
Zeiss Axioskop 显微镜	Zeiss		电刺激过程中使用
40X Achroplan 水浸物镜	Zeiss		用于电刺激和共聚焦成像
全反式视黄醛	Millipore Sigma	R2500	ChR2 所需的辅因子
带相机接口的 Zeiss Stemi 显微镜	Zeiss	2000-C	用于视蛋白通道刺激
470 nm LED	ThorLabs	M470L2	用于激活 ChR
T-Cube LED 驱动器	ThorLabs	LEDD1B	用于控制 LED
LED 电源	Cincon Electronics Co.	TR15RA150	为 LED 供电
光功率和能量计	ThorLabs	PM100D	用于测量 LED 强度