慢性淋巴细胞白血病中的免疫球蛋白基因序列分析：从患者样本到序列解读

摘要

本文介绍了一项基于欧洲慢性淋巴细胞白血病研究倡议组织（European Research initiative on CLL，ERIC）积累经验的实验方案，详细阐述了确保慢性淋巴细胞白血病（CLL）患者免疫球蛋白基因序列分析可靠性的技术要点和基本要求。

摘要

在B细胞成熟过程中，免疫球蛋白（IG）基因的V(D)J重排与体细胞高频突变（SHM）这一复杂过程，使得每个个体B细胞内产生独特的DNA序列。由于B细胞恶性肿瘤源于单个细胞的克隆性扩增，因此IG基因构成了同一患者所有恶性细胞共有的独特分子标志；因此，IG基因重排可作为克隆性标记物。除了作为重要的克隆标识外，IG基因序列还可充当“分子时间线”，因其与特定的发育阶段相关，从而反映了发生肿瘤转化的B细胞的演化历史。此外，对于某些恶性肿瘤，尤其是慢性淋巴细胞白血病（CLL），IG基因序列具有预后判断甚至潜在的预测价值。然而，若缺乏可靠的方法和工具来辅助分析，从IG基因序列分析中得出有意义的结论将是不可能的。本文借鉴欧洲慢性淋巴细胞白血病研究倡议组织（ERIC）的丰富经验，详细阐述了确保CLL患者IG基因序列分析结果可靠且可重复所需的技术要点和基本要求，该检测目前已被推荐用于所有CLL患者治疗前的评估。更具体而言，本文描述了从识别克隆型IG基因重排、确定核苷酸序列，到对IG基因序列数据进行准确临床解读的各个分析阶段。

引言

慢性淋巴细胞白血病（CLL）是西方国家成人中最常见的白血病类型，其特征是成熟的肿瘤性B细胞发生克隆性扩增¹。从临床角度来看，该疾病的病程差异极大：部分患者病情进展迅速，诊断后需尽早接受治疗，且常出现复发或对治疗耐药；而相比之下，相当一部分患者（约30%）表现为惰性病程，终生无需治疗，其预期寿命与健康同龄人相似²。这种临床异质性反映了CLL患者中存在多种多样的分子异常，这些异常最终驱动了该疾病的发病机制和疾病进展³。

慢性淋巴细胞白血病（CLL）的准确诊断通常较为直接，然而上述临床异质性可能阻碍对CLL患者的高效管理，并凸显了对预后和预测标志物的需求，这些标志物可辅助治疗决策²。大量研究致力于优化CLL的预后评估，最终提出了众多新的临床和生物学标志物⁴。克隆型免疫球蛋白重链可变区（IGHV）基因的突变状态是CLL中最可靠的预后标志物之一，主要原因在于：（i）该状态在疾病进展过程中及随时间推移保持稳定；（ii）其独立于其他临床和生物学参数⁵。尽管如此，目前在诊断时的临床常规实践中，极少有标志物（包括IGHV突变状态）被实际应用。

关于IGH基因测序在慢性淋巴细胞白血病（CLL）中临床应用的最初报道可追溯至1999年，当时两项独立研究报道，体细胞超突变（SHM）负荷为无或极低的患者（即未突变型CLL，U-CLL）预后较具有较高SHM负荷的患者（即突变型CLL，M-CLL）更差^6,7。更具体而言，U-CLL组包含克隆型IGHV基因中SHM极少或无的病例，因此其与最接近的种系IGHV基因序列的相似度很高（≥98%）；而M-CLL组则包含突变负荷较高的病例（与最接近的种系IGHV基因序列的相似度<98%）。自这些早期研究以来，持续有证据表明，与M-CLL相比，U-CLL患者的首次治疗时间间隔（TTFT）更短，总体生存期（OS）也更短。

回顾这些开创性研究，它们凸显了B细胞受体（BcR）IG在慢性淋巴细胞白血病（CLL）发病机制中的关键作用，从而为深入研究CLL与微环境之间的相互作用铺平了道路，进而加深了对该疾病生物学异质性的全面认识^8,9。近期的研究进一步证实了免疫遗传学分析在CLL中的重要性，发现个别病例因具有（近乎）相同的BcR IG基因序列而可聚类为特定亚群，这一现象被称为BcR IG序列的刻板化（stereotypy）^10,11,12,13。越来越多的证据表明，归属于同一刻板化亚群的患者具有相似的临床生物学特征，这些特征使其明显区别于同属相同SHM类别但IG基因序列不同的其他CLL患者；事实上已有报道指出，基于BcR IG刻板化的CLL患者分类可进一步细化将CLL患者总体划分为U-CLL或M-CLL的分组方式^{14,15,16,17,18,19,20}。

从临床角度来看，克隆型 IGHV 基因的体细胞超突变（SHM）状态似乎与对化学免疫治疗的特定反应相关。特别是接受氟达拉滨/环磷酰胺/利妥昔单抗（FCR）联合治疗的 M-CLL 患者，该方案是体能状态良好的、无特定并发症的 CLL 患者的标准治疗方案 TP53 基因缺陷的患者相比接受相同治疗的U-CLL患者，无进展生存期（PFS）和总生存期（OS）显著更长^21,22,23因此，确定体细胞超突变（SHM）状态对于辅助慢性淋巴细胞白血病（CLL）患者的治疗管理尤为重要 即， 一种预测性标志物，而非用于评估疾病的临床病程 即， 预后标志物。事实上，根据美国国家癌症研究所（NCI）资助的慢性淋巴细胞白血病国际工作组最新更新的指南，所有慢性淋巴细胞白血病（CLL）病例在开始治疗前，无论是在常规临床实践还是临床试验中，均应检测重排的 IGHV 基因的体细胞超突变（SHM）状态。²⁴此外，由于近期新型治疗药物的获批以及正处于临床试验阶段的药物数量不断增加，IG分子的体细胞超突变（SHM）状态可能在不久的将来对慢性淋巴细胞白血病（CLL）患者的治疗管理发挥更为重要的作用⁵.

本报告详细阐述了免疫球蛋白基因序列分析的各个方面，从选择合适的样本材料开始，到最终对测序结果进行临床解读。在诊断常规中，深入评估这些步骤对于获得可靠结果以及确保临床试验中患者的准确分层至关重要。本文提供了相关实验方案，以促进免疫球蛋白基因序列分析的标准化，从而确保不同实验室之间的结果具有可比性。

方案

该研究方案已获得意大利米兰圣拉斐尔科学研究所伦理委员会的批准。

1. 材料选择

1. 起始材料的选择
   注意：在大多数慢性淋巴细胞白血病（CLL）病例中，诊断时肿瘤细胞比例较高（>80–90%）。因此，通常无需对白血病细胞进行分选或富集。
   1. 若使用外周血（PB）——这是免疫球蛋白基因序列分析最常用的材料——采集血量应在10–20 mL之间。
   2. 对于CLL细胞负荷较低的情况，可选择对外周血样本进行细胞分选，或采用其他组织来源的材料，如骨髓（BM）或淋巴结（LN）。
2. 采样时间
   1. 由于免疫球蛋白体细胞超突变（IG SHM）状态在病程中保持稳定，因此采样时间通常并不关键；但应避免在某些特定时期采样，例如治疗期间或治疗刚结束后，因为此时CLL细胞数量可能过低，会增加分析难度并导致结果不可靠。
3. 材料采集与保存
   注意：起始材料的采集与保存方式在很大程度上取决于所选材料类型。
   1. 对于外周血或骨髓样本，应使用EDTA或CPT（柠檬酸盐-三羟甲基氨基甲烷-吡哆磷酸）抗凝采血管，以防止抑制PCR扩增过程；也可选用肝素抗凝管。
   2. 对于淋巴结样本，可选择细胞悬液、新鲜冷冻组织活检，或极少数情况下使用福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织。

2. 密度梯度分离

注意：如果选择外周血（PB）或骨髓（BM）作为起始材料（这是最常见的场景），建议使用密度梯度离心法分离单个核细胞。

1. 向一个50 mL无菌收集管中加入200 µL EDTA（0.5 M EDTA / pH 8.0）。加入20 mL PB和15 mL RPMI。用移液器吹打混合（2–3次即可）。
2. 向一个新的50 mL收集管中加入15 mL密度梯度介质。
   注意：如果PB体积少于20 mL，则应相应调整RPMI（前一步）和密度梯度介质的体积。
3. 缓慢将步骤2.1中的溶液叠加至密度梯度介质上，避免破坏梯度。关闭离心机制动，以800 × g离心20分钟。
4. 使用无菌巴斯德移液管收集位于上层血浆/血小板层与密度梯度介质层之间的单个核细胞环，并转移至一个无菌的15 mL收集管中。
5. 加入RPMI至终体积为12 mL并混匀。以750 × g离心8分钟。弃去上清液。
6. 用10 mL RPMI重悬细胞沉淀，并重复步骤2.5。
7. 将细胞沉淀溶解于1 mL PBS（DPBS，无钙、无镁）中。通过将20 µL样本与80 µL 1:10 Türk's溶液混合，使用Neubauer计数板进行细胞计数。
8. 如果样本的后续处理未安排在当天进行，则以750 × g离心8分钟。弃去上清液，并将细胞沉淀在-80^o C保存。

3. 核酸提取

1. 确定用于分析IG基因体细胞高频突变（SHM）状态的模板。基因组DNA（gDNA）是最常用的选择，因其无需进行逆转录步骤； alternatively，使用RNA/互补DNA（cDNA）可确保所检测的至少在转录水平上为具有功能性的、可读框完整的克隆重排IG序列 "首选的" 靶标
2. 使用多种市售试剂盒中的一种，适用于基因组DNA或总RNA提取及cDNA合成（参见 材料表).
3. 使用高灵敏度的核酸定量系统评估 DNA 或 RNA 的完整性。若使用 FFPE 样本进行分析，可通过已知看家基因的 PCR 扩增来评估所提取 gDNA/cDNA 的质量与数量。 例如 视黄酸受体α（retinoic acid receptor alpha (RARα)，β-actin， 等等。.

4. IGHV-IGHD-IGHJ 基因重排的扩增与测序

1. IGH PCR 引物选择
   1. 建议使用IGHV亚群特异性的5'引物和IGHJ基因特异性的3'引物进行多重PCR^25,26如果结果不理想，应使用单一的IGHV亚群特异性引物分别配制PCR反应体系。
   2. 使用与IG重排上游紧邻的 leader 区域或编码区域内结合的5'引物（例如 免疫球蛋白重链可变区基因（IGHV）的框架区1（FR1）。
      1. 使用能够扩增整个重排的 IGHV-IGHD-IGHJ 基因序列的 leader 引物，从而准确评估体细胞超突变（SHM）水平。因此，欧洲免疫介导性肾脏病研究网络（ERIC）在其更新的免疫球蛋白（IG）基因序列分析指南中推荐使用 IGHV leader 引物。²⁷.
      2. 在引物无法扩增出克隆型IG重排的情况下，使用IGHV FR1引物。然而，框架区引物不能扩增出完整的克隆型IG基因重排，可能导致体细胞超突变（SHM）水平的判断不准确。在此情况下，应在临床报告中明确说明：使用IGHV FR1引物可能会高估与最接近种系基因的真实同源性百分比。
   3. 对于3'端，根据模板的不同，使用靶向IGHJ基因的简并引物、IGHJ基因特异性引物的多重引物组合或亚型特异性引物。引物序列见表1，而 图1 展示了引物退火的不同位置。
2. IGHV-IGHD-IGHJ 基因重排的 PCR 扩增
   1. 使用每种亚组引物的等摩尔量制备引物混合物，以确保无偏倚的扩增。
      1. 例如，在使用引物前导序列时，需采用两种不同的引物来扩增属于IGHV1亚群的重排。因此，这两种引物（IGHV1L和IGHV1bL）的用量应为IGHV4L引物的一半，因为后者是扩增IGHV4亚群重排的唯一引物。
      2. 对于 IGHJ1-2 和 IGHJ4-5 引物，采用相反的策略。由于这些引物分别靶向两个不同的 IGHJ 基因亚群，其用量应为 IGHJ3 和 IGHJ6 引物的两倍。
      3. 使用 表1 以确定配制相关引物混合物时引物的精确用量。
   2. 按所列清单混合PCR试剂 表 2将所有PCR试剂加入PCR管后，添加0.5 µL Taq聚合酶和100 ng基因组DNA，或2 µL cDNA（cDNA应使用1 µg RNA制备）。
      注意：使用具有校对活性的Taq酶并非必需，因为扩增错误率极低，因此不会影响体细胞超突变（SHM）水平。
   3. 运行下述详细的热循环PCR程序 表3.
3. 克隆性评估
   注意：下一步关键步骤是评估PCR产物的克隆性模式。在评估慢性淋巴细胞白血病（CLL）患者克隆性时，最常见的结果为单一的单克隆峰/条带。
   1. 采用高灵敏度方法（如片段分析或异源双链分析）进行克隆性评估^28,29.
   2. 片段分析
      1. 使用5'-标记的IGHV前导序列或FR1亚群特异性PCR引物进行多重PCR扩增；所得PCR产物可通过毛细管电泳分离，从而根据IGHV互补决定区3（CDR3）的长度对IGH PCR产物进行克隆性分析。
      2. 使用与前述相同的引物、试剂和热循环条件（见表1-3）。定制的5´端标记引物是带有5'端染料标记的荧光寡核苷酸，可选择不同的荧光染料。常见的报告荧光染料包括6-FAM、HEX、NED或TET。因此，由于每轮反应使用三种不同的荧光染料，需进行两个独立的反应。
   3. 在6%聚丙烯酰胺凝胶上检测PCR产物的大小（该浓度可获得最佳分辨率），使用1×TBE作为电泳缓冲液，80 V恒压电泳45分钟。
      注意：建议让PCR产物在凝胶中充分迁移，以便将单克隆样品与多克隆背景分离，并使DNA大小标记物得到充分分辨。凝胶的大小和厚度等因素可能影响迁移效果，因此无法通过单一的电压和时间设置来保证获得最佳结果。尽管如此，以80 V电压电泳45分钟是一个良好的起始条件，可最大限度降低样品迁移过快而“跑出”凝胶的风险。
   4. 使用IGHV leader引物时，检测约500个碱基对的PCR产物；使用IGHV FR1引物混合物时，检测约350个碱基对的PCR产物。
      注意：在极少数情况下，慢性淋巴细胞白血病（CLL）病例可能携带双克隆性单克隆产物，而在更为罕见的情况下，病例可能呈现寡克隆模式。可使用嵌入剂（如溴化乙锭，EtBr）或商业化的、危害较小且更灵敏的DNA染料，通过紫外激发或蓝光照射来可视化聚丙烯酰胺凝胶上的DNA。
4. PCR产物纯化
   注意：为去除慢性淋巴细胞白血病（CLL）样本中正常B细胞可能产生的多克隆背景以及可能影响测序质量的引物二聚体，需对PCR产物进行纯化。可采用任何能够去除未掺入的dNTP和引物的方法进行PCR产物纯化，例如酶法处理。 例如， 虾碱性磷酸酶（Sap）/外切核酸酶I（Exo），或基于柱的纯化。
   1. 将PCR产物的总体积上样至3%低熔点琼脂糖凝胶中。
   2. 让PCR产物在凝胶中电泳至与背景分离。
   3. 切下清晰且明显的PCR条带，进行纯化和洗脱。若检测到两种重排，则应分别切下两条带并独立测序。
   4. 进行Sap/Exo纯化时，应遵循制造商关于具体使用体积的说明；但通常每5–10 µL PCR反应体系可加入1 µL Sap、0.5 µL Exo和2 µL 5×孵育缓冲液。轻轻涡旋混匀各样品，置于PCR仪中37 °C孵育30分钟。随后在85 °C加热15分钟以灭活酶。
   5. 在3%琼脂糖凝胶上加载少量PCR产物，以评估产物的纯度。

5. Sanger 测序

注意：存在多种测序策略，但无论采用何种具体方法，都必须对两条链进行直接测序，以确保结果可靠。

1. 通用测序方案
   1. 如果使用单一引物进行了扩增，则继续使用相应的IGHV和IGHJ或恒定区特异性引物进行测序。如果使用了多重荧光标记引物，并通过片段分析对PCR产物进行了检测，也可采用该方法（测序引物应 不 进行标记）。
   2. 如果使用了多重引物并在凝胶上评估了克隆性，则在测序的第一步使用下游引物 例如 一种共识性 IGHJ 引物，其序列为 5'-GTGACCAGGGTNCCTTGGCCCCAG-3'。或者，如果以 cDNA 作为模板，则可使用 CH 引物。接下来，在第二轮测序中使用亚群特异性的 IGHV 领导序列或 FR1 引物。
2. 示例测序方案
   注意：存在多种测序方案，以下详述其中一种示例方案。
   1. 使用，将 33 ng 的 PCR 产物稀释至总体积为 11.5 µL 例如， 无菌水。将PCR产物在95 °C加热5分钟以使其变性，随后立即置于冰上10分钟，以防止二级结构的形成。
   2. 向每根试管中加入8 µL主混合液和0.5 µL（相当于5 pmol）的引物。
   3. 作为对照，准备一个含有8 µL主混合液、0.5 µL pUC18对照模板、2 µL (-)47测序引物和9.5 µL无菌水的离心管。每个离心管中的最终总体积应为20 µL。
   4. 使用测序反应的热循环条件，具体如下所述： 表4.
   5. 通过混合2 µL 3M醋酸钠（pH 5.2）、2 µL 100 mM EDTA（pH 8.0）和1 µL糖原（浓度20 mg/mL）配制终止液，然后向每个样品中加入5 µL。将产物转移至新的微量离心管中。
   6. 加入60 µL 100%乙醇（-20 °C），轻轻混匀。在4 °C下以14,000 rpm离心15分钟。弃去上清液。
   7. 加入100 µL 70%乙醇（-20 °C），轻轻混匀。在4 °C下以14,000 rpm离心10分钟。弃去上清液。重复一次。
   8. 室温下将沉淀干燥90分钟。向每个样品中加入40 µL十二烷基硫酸钠（SDS）溶液。
   9. 将样品转移至测序板中，用条形帽或封口膜密封，装载到仪器上并进行Sanger测序。测序板通常为适用于测序仪的96孔、V型底、全裙边PCR板。根据测序是在本实验室、商业公司还是学术测序中心/平台进行，测序板可带有条形码。 关键词：测序板，Sanger测序，96孔板，V型底，全裙边PCR板，条形码
3. 测序完成后，将来自各个测序步骤产生的两条读段“拼接”起来，以形成完整的 IGHV 基因重排 即， 一致序列

6. 序列分析

注意：以下部分重点介绍使用 IMGT/V-QUEST 工具³⁰分析重排的免疫球蛋白（IG）序列时所获得的输出结果，以及 IMGT/JunctionAnalysis³¹，这两者在临床报告和研究中尤为重要。IMGT/V-QUEST 是一种比对工具，可将用户提交的 IG 序列与 IMGT 参考目录集进行比对³⁰。该工具的输出包含多个部分，用户可在其中定义特定参数。

1. 指定物种，例如，Homo sapiens（人）以及受体类型或位点（例如 IGH、IGK 或 IGL）。
2. 将待分析的序列以 FASTA 格式（包含标题行）粘贴至文本区域（每次运行最多 50 条序列）。或者，也可选择输入本地文件路径，该文件包含待分析的 FASTA 序列。
3. 从以下三种结果展示方式中选择其一：
   1. 详细视图：选择此选项可获得每条序列的单独分析结果。
   2. 汇总视图：选择此选项可生成按 IGHV 基因及等位基因名称或按输入序列顺序排列的汇总表格。该选项还提供序列比对结果，对同一批次中被归为同一 IGHV 基因和等位基因的序列进行对齐。
   3. Excel 文件：选择此选项可将所有输出文件整合为一个包含多个工作表的电子表格文件。所有查看选项均提供大量基础与高级参数供选择，但本文“代表性结果”部分仅讨论与 CLL IG 序列分析最相关的因素。

7. ARResT/AssignSubsets 工具

1. 为了研究慢性淋巴细胞白血病（CLL）中的 B 细胞受体免疫球蛋白（BcR IG）序列相似性（更多细节见下文“代表性结果”部分），请将 IGHV-IGHD-IGHJ FASTA 序列提交至 ARResT/AssignSubsets 工具³²。该工具将报告序列被分配至的主要 CLL 序列相似性亚组。该亚组分配工具及详细操作说明可在 ARResT/AssignSubsets 网站³² 获取，也可在 ERIC 网站的服务（services）标签页下找到。

结果

以下示例展示了按照上述步骤进行IG基因测序分析后获得的结果。尽管DNA和/或RNA提取对大多数临床/研究实验室而言是常规操作，但首要的关键步骤是使用分光光度计或其他高灵敏度的合适技术检测gDNA和/或RNA的质量和数量。下一步关键步骤是通过PCR扩增克隆型IGHV-IGHD-IGHJ基因重排。如上所述，只有使用IGHV前导区引物才能扩增出重排IGHV基因序列的全长，从而准确确定体细胞高频突变（SHM）负荷；因此，推荐选用IGHV前导区引物（图2）。在极少数情况下，若IGHV前导区引物无法扩增出克隆型IG重排，则可使用IGHV FR1区引物。如图3所示，可能会观察到多个PCR产物/条带，尤其是以gDNA为起始材料时；这些条带应被分别切下并独立测序。如果IGHV前导区引物和IGHV FR1区引物均未能获得结果，则应尽可能使用新的患者样本重复分析。测序前的最后一个质控步骤是通过片段分析确定样本的克隆性（图4）。

获得的序列应使用 IMGT/V-QUEST 工具进行分析³⁰用户可选参数包括物种、受体类型或位点、插入搜索以及缺失选项。 等等。 并列出了所分析序列的数量。每个FASTA序列均被展示，其中由IMGT/V-QUEST分析的V区结构域以绿色高亮显示。此外，如果输入序列为反向互补链（反义链），程序会自动提供其互补的反向序列，并在FASTA序列上方注明此情况。

结果摘要表位于FASTA序列正下方、“详细视图”结果页面的顶部，包含慢性淋巴细胞白血病（CLL）中IG基因序列分析临床报告所需的重要信息。下文将对表格中的每一行进行说明。

结果概述。 结果表格的第一行说明了输入序列的功能性：免疫球蛋白重排序列可分为有功能性和无功能性图5A & 5B）。如果在V-D-J区（VH）或V-J区（VL）内存在终止密码子，和/或由于插入/缺失导致重排移码，则该免疫球蛋白基因重排被视为非功能性。当无法确定其功能状态时，将提供第三种输出结果。 即， 如果无法识别IGHV-IGHD-IGHJ连接区，则结果摘要将显示为“未检测到重排”或“未检测到连接区”。需要注意的是，仅应进一步分析可读框内（productive）即具有功能性的重排。如果唯一扩增出的免疫球蛋白（IG）重排为非功能性（非可读框内或“未检测到重排”），应重复PCR扩增过程。若结果仍为阴性，则应重新采集患者样本。

V基因与等位基因。 “V基因与等位基因”行显示与提交序列最接近的种系IGHV基因及其等位基因，同时提供比对得分和序列一致性百分比。若多个基因或等位基因获得相同的最高得分，则会全部列出。提交序列与最接近的IGHV基因及等位基因之间的序列一致性百分比尤为重要，因其决定了体细胞高频突变（SHM）状态。该值的计算范围从V区（V-REGION）的第一个核苷酸至其3'端，但不包括CDR3区域。若使用了IGHV FR1引物，则必须去除与引物对应的序列，以确保结果尽可能准确。需要注意的是，较低的一致性百分比（<85%）可能由插入或缺失引起（下文将进一步讨论），此时“结果摘要”行中将出现“警告”提示，以提醒用户。

J-基因和等位基因。 如上文V-基因和等位基因所述，“J-基因和等位基因”行表示最接近的种系IGHJ基因及其等位基因，同时提供其比对得分和序列一致性百分比。然而，由于IGHJ基因较短，且其5'端可能因外切核酸酶活性而被切除，因此该工具还会根据连续相同核苷酸数量最多的原则，搜索其他可能的备选基因。

D-GENE 和等位基因由 IMGT/JunctionAnalysis 分析。 “D-GENE 和等位基因（由 IMGT/JunctionAnalysis 确定）”表示该工具在用户序列中识别出的 D-区域阅读框所对应的最接近的种系 IGHD 基因及等位基因。IMGT/JunctionAnalysis³¹ 对连接区提供了详细而准确的分析，并已整合至IMGT/V-QUEST工具界面。该工具可处理与IGHD基因及等位基因鉴定相关的所有复杂问题 即， （i）D区长度较短；（ii）使用2个甚至3个阅读框；（iii）基因两端的外切核酸酶修剪；以及（iv）存在突变。

FR-IMGT 长度、CDR-IMGT 长度和氨基酸连接区（AA JUNCTION）。该行提供 IGHV 框架区（FR）和互补决定区（CDR）的长度，长度数值显示在括号内，以点号分隔，以及氨基酸（AA）连接序列。连接区的氨基酸序列可说明以下三点：(i) 重排是否在读框内（不在读框内的位置以“#”符号标示）；(ii) 是否存在终止密码子（终止密码子以星号“*”表示）；(iii) VH CDR3-IMGT 锚定残基 C（第2个半胱氨酸，位置104）和 W（J-TRP，位置118）是否存在。

体细胞高频突变主要由单核苷酸改变组成，然而在V区中也可观察到小片段的插入和缺失，尽管其发生频率要低得多³³使用默认的 IMGT/V-QUEST 参数时，插入和缺失不会被自动检测；然而，有强烈迹象表明某序列可能携带此类变异， 即， 在提交的用户序列与最接近的种系基因及等位基因之间，若工具检测到较低的序列同一性百分比和/或不同的 IGHV CDR1-IMGT 与 CDR2-IMGT 长度，则结果摘要表下方将显示警告提示图5C).

IMGT 在“显示结果”部分下方的“高级参数”中提供了一个名为“搜索插入和缺失”的选项。当出现相关警告时，建议使用此功能。当检测到插入或缺失时，“结果摘要”部分将提供有关发现的详细信息，包括（i）插入或缺失的位置 即， VH FR-IMGT 或 CDR-IMGT；(ii) 插入/缺失的核苷酸数目；(iii) 序列（仅适用于插入）；(iv) 是否发生移码；(v) 插入或缺失起始的V区密码子；以及 (vi) 提交序列中受影响的核苷酸位置图5D）。对于插入序列，该工具会将用户提交序列中的插入部分去除，然后使用标准的 IMGT/V-QUEST 参数重新分析序列。若检测到缺失，工具会在缺失的核苷酸位置添加由点表示的空位，随后重复分析过程。

对于临床实验室中开展的每一项诊断或预后检测，严格的标准和高度的可重复性都至关重要。IMGT/V-QUEST 的输出结果提供了报告慢性淋巴细胞白血病（CLL）IG 基因序列分析结果所需的大部分信息。 即， （i）所使用的 IGHV、IGHD 和 IGHJ 基因及等位基因；（ii）克隆型 IGHV-IGHD-IGHJ 基因重排的功能性 即， 重排是有义还是无义；以及（iii）重排后的IGHV基因及等位基因与其最接近的种系IGHV基因及等位基因之间的序列同一性百分比。有关慢性淋巴细胞白血病（CLL）中IG基因临床报告的详细说明、对疑难或技术上具有挑战性病例的解读，以及准确、可靠判定CLL中IGHV基因体细胞超突变（SHM）状态的建议，读者可参考近期更新的ERIC指南及相关报告^27,34.

最后，由于我们对慢性淋巴细胞白血病（CLL）中B细胞受体免疫球蛋白（BcR IG）序列的刻板模式认识不断加深，目前建议在CLL的免疫球蛋白（IG）基因重排临床报告中增加一项内容，即判断病例是否属于主要的刻板亚型。现在建议在临床报告中明确指出，所分析的具有功能性的IGHV基因重排是否可归入主要的刻板亚型之一，即#1、#2、#4或#8亚型^12,27。对CLL主要刻板亚型的归类应使用ARResT/AssignSubsets工具进行（图6）³²。

5’ IGHV FR1 引物	引物序列		60 μL 引物混合液中的用量
IGHV1	CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGG		10
IGHV2	CAGGTCAACTTAAGGGAGTCTGG		10
IGHV3	GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGG		10
IGHV4	CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGG		10
IGHV5	GAGGTGCAGCTGTTGCAGTCTGC		10
IGHV6	CAGGTACAGCTGCAGCAGTCAGG		10
5’ IGHV 领导序列引物
IGHV1L	AAATCGATACCACCATGGACTGGACCTGGAGG		5
IGHV1bL	AAATCGATACCACCATGGACTGGACCTGGAG(C/A)		5
IGHV2aL	AAATCGATACCACCATGGACACACTTTGCT(A/C)AC		5
IGHV2bL	AAATCGATACCACCATGGACATACTTTGTTCCAC		5
IGHV3aL	AAATCGATACCACCACCATGGAGTTTGGGCTGAGC		5
IGHV3bL	AAATCGATACCACCACCATGGA(A/G)(C/T)T(G/T)(G/T)G(G/A)CT(G/C/T)(A/C/T)GC		5
IGHV4L	AAATCGATACCACCATGAAACACCTGTGGTTCTT		10
IGHV5L	AAATCGATACCACCATGGGGTCAACCGCCATC		10
IGHV6L	AAATCGATACCACCATGTCTGTCTCCTTCCTC		10
3’ IGHJ 引物
IGHJ1-2	TGAGGAGACGGTGACCAGGGTGCC		20
IGHJ3	TGAAGAGACGGTGACCATTGTCCC		10
IGHJ4-5	TGAGGAGACGGTGACCAGGGTTCC		20
IGHJ6	TGAGGAGACGGTGACCGTGGTCCC		10

表1. 用于扩增克隆型 IGHV-IGHD-IGHJ 基因重排的引物序列及用量。

试剂	体积 (μL)
RB x 10 缓冲液	5
MgCl2 (50 mM)	3
dNTPs (10 mΜ)	2
引物 IGHV leader/FR1 混合物 (10 μM)	3
引物 IGHJ 混合物 (10 μM)	3
H2O	31.5
总体积	47.5

表2. 用于扩增克隆型 IGHV-IGHD-IGHJ 基因重排的试剂。

温度	持续时间	循环次数	描述
94 °C	5分钟	1	聚合酶激活
94 °C	1分钟	39	变性
59 °C	1分钟		退火
72 °C	1.5分钟		延伸
72 °C	10分钟	1	最终延伸
18 °C	∞	1	保存

表3. 扩增克隆型 IGHV-IGHD-IGHJ 基因重排的PCR扩增热循环条件。

温度	持续时间	循环次数	描述
94 °C	5 分钟	1	聚合酶激活
96 °C	20 秒	30	变性
50 °C	20 秒		退火
60 °C	4 分钟		延伸
4 °C	∞	1	保存

表4. IG基因测序反应的热循环条件。

图1. IGHV-IGHD-IGHJ基因重排的示意图，标示了不同引物的退火位置。 5' IGHV引物退火至位于IGHV编码序列上游的前导序列。5' IGHV框架区（FR）引物退火至重排后IGHV基因内FR1区域的起始位置，而3' IGHJ引物则退火至重排后IGHJ基因的末端。UTR：非翻译区。请点击此处查看此图的放大版本。

图2. 使用5' IGHV 领导序列引物对7例患者样本进行IGHV-IGHD-IGHJ基因重排的PCR扩增。 第八泳道为阳性对照，第九泳道为PCR的阴性对照。当使用IGHV领导序列引物时，预期的PCR产物大小约为500个碱基对。凝胶最后一列中的星号表示100 bp DNA标记。 请点击此处查看该图的放大版本。

图3. 使用 IGHV FR1 引物对13例患者样本进行 IGHV-IGHD-IGHJ 基因重排的PCR扩增。 第十四个泳道为阳性对照，第十五个泳道为阴性对照。如以DNA为起始材料的第2泳道所示，可见多条PCR条带，应分别切胶并进行测序。第5、7和13泳道的样本结果显示为多克隆性（凝胶中呈现弥散条带），因此需重复PCR步骤。若第二次PCR仍未能扩增出重排的IG基因，则应使用新样本（如可能）或更换引物组合重新进行分析。使用 IGHV FR1 引物混合物时，预期PCR产物大小约为350个碱基对。凝胶最右侧泳道中的星号表示100 bp DNA标记。 请点击此处查看该图的放大版本。

图 4. 利用Genescan分析评估克隆性。 在Genescan分析中，单克隆PCR产物会产生一个主导峰，代表大小一致的荧光产物（上图）；而多克隆PCR产物则呈现出更接近正态分布的产物大小（下图）。红色曲线为与待测样本同时进样至毛细管中的荧光标记DNA分子量标记物所产生的峰。该大小标准片段与样本受到相同的电泳力作用，因此处于相同的进样条件。大小标准片段之间均匀的间距可确认精确的片段大小判定。蓝色曲线代表样本的单克隆性（上图）或多克隆性（下图）。请点击此处查看本图的放大版本。

图 5. IMGT/V-QUEST 提供的结果摘要表的示例。 (A) 一个功能性 IGHV-IGHD-IGHJ 基因重排（无终止密码子且为框内连接序列）的结果摘要表。本例中，IMGT/V-QUEST 在用户序列中鉴定出的 V-GENE 及其等位基因和 J-GENE 及其等位基因为 IGHV4-34*01 和 IGHJ6*02（基于最高比对得分评估）。由于存在单个体细胞突变，序列一致性为 99.65%。由 IMGT/JunctionAnalysis 鉴定出的 D-GENE 及其等位基因为 IGHD3-3*01，位于阅读框 1。四个骨架区（FRs）以及三个互补决定区（CDRs）的长度均以括号标示。同时提供了 IGHV-D-J 连接区的氨基酸（AA）序列。本示例中，该连接区包含 22 个氨基酸。 (B) 因连接区移码而导致非功能性的 IGHV-IGHD-IGHJ 基因重排序列的结果摘要表。CDR3-IMGT 长度处的“X”表示该序列的长度无法确定。氨基酸连接序列中出现的“#”符号表示发生了移码。 (C) 提示 V-REGION 一致性较低（60.94%），并建议使用“高级参数”部分中的“搜索插入和缺失”选项的结果摘要表。 (D) 针对 (C) 中所示 germline 一致性较低的情况，在使用“搜索插入和缺失”选项重新进行序列分析后得到的结果摘要表。括号中显示了正确的序列一致性百分比，该值将插入视为单一突变事件进行计算。 请点击此处查看该图的放大版本。

图6. 由 ARResT/AssignSubsets 工具生成的亚群分配报告表。 来自10名慢性淋巴细胞白血病（CLL）患者（A1-A10）的FASTA IG序列被提交至ARResT/AssignSubsets工具进行分析。其中，病例A4被高置信度地归类于CLL立体化亚组#2（该组患者无论体细胞高突变负荷如何，均以预后不良著称）。其余7个病例/序列未被归入任何主要的立体化亚组，因此被归类为未分配（unassigned）。提交的序列中有两条（A7和A8）由于序列质量问题无法用于亚组分配，被标记为跳过/异常（skipped/unhealthy）。 即， 由于移码连接或终止密码子的存在。有关表格标题及该工具的详细说明，请访问 ARResT/AssignSubsets 网站³². 请点击此处以查看此图的放大版本。

讨论

CLL中IG基因的研究不仅对于深入理解疾病的病理生物学机制至关重要，而且对于改善患者的危险分层也具有重要意义。因此，以标准化的方式进行IG基因序列分析的多步骤操作及后续序列数据的解读显得尤为关键。合适的、足量的患者样本的可获得性以及采样时机不应影响IG基因突变分析的实施，因为该检测可在外周血（PB）以及任何CLL肿瘤细胞含量较高的样本上进行。采用密度梯度分离法分离外周血单个核细胞是诊断实验室的常规操作，操作过程中在将血液/RPMI溶液添加至含有梯度介质的离心管时应格外小心；此步骤应缓慢、轻柔地进行，以避免破坏梯度层并防止细胞丢失。

细胞分离后提取核酸。基因组DNA（gDNA）和互补DNA（cDNA）均适用于克隆重排IGH的体细胞超突变（SHM）分析，但使用任一种材料均有其优缺点。使用gDNA时，由于无需在PCR扩增前进行逆转录反应，实验室操作流程更为快速。然而，以gDNA为PCR模板可能导致功能性与非功能性重排同时被扩增，进而增加实验操作的工作量。 即， 多重PCR产物的纯化或凝胶切胶，以及所有重排产物的单独测序。在比较基因组DNA（gDNA）与cDNA方法时，后者需在PCR扩增前进行逆转录步骤。然而，在此情况下，大多数情况下仅能扩增并随后测序可读框内的免疫球蛋白（IG）重排。因此，仅需纯化并测序单一PCR产物，结果解读也更为直接。

扩增效率在很大程度上取决于gDNA/cDNA的质量，应使用灵敏的定量方法进行评估，同时也取决于所使用的引物。引物的选择在整个分析过程中至关重要，因为只有扩增出重排IGHV基因的完整序列，才能准确测定体细胞超突变（SHM）水平。只有使用5' IGHV前导区引物，才能评估全长重排，这也支持了欧洲研究慢性淋巴细胞白血病免疫学特征协作组（ERIC）近期推荐使用前导区引物的建议²⁷。使用其他引物导致扩增出不完整的IGHV-IGHD-IGHJ基因重排，不适合用于IGHV基因突变分析，因此强烈不推荐。唯一的例外情况是，当使用IGHV前导区引物反复出现阴性结果，且无法获取新的患者样本或新样本仍无法获得结果时。如果更换不同的患者样本和/或材料（gDNA/cDNA）以及多组引物仍无法扩增出PCR产物，则可能的原因包括肿瘤细胞负荷过低，或淋巴细胞增多并非由慢性淋巴细胞白血病（CLL）克隆引起（此时应重新评估免疫表型）。用于分析的引物应在临床报告中明确注明。

由于慢性淋巴细胞白血病（CLL）源于携带相同IGHV-IGHD-IGHJ基因重排的单克隆B细胞的积聚，绝大多数病例的克隆性评估将显示出一个独特的单克隆峰。 即， 单克隆。在极少数情况下，可观察到双重组或甚至寡克隆模式³⁵在此类情况下，凝胶电泳并非克隆性评估的首选技术，应采用更为敏感的方法，如片段分析。在确认克隆性后，测序前的最后一步是纯化PCR产物，以确保获得高质量的序列。最后，ERIC推荐使用IMGT/V-QUEST工具进行免疫球蛋白（IG）序列分析。由于IMGT数据库持续更新，并以一致且注释完善的方式报告结果，该工具可确保分析的标准化，并促进不同临床或学术机构之间的比较分析。

由于慢性淋巴细胞白血病（CLL）中的免疫遗传学分析具有预后意义，尤其是预测意义，因此对IGHV-IGHD-IGHJ基因重排进行全面分析，包括确定其是否属于主要的CLL刻板亚型，已不再仅仅是理想选择，而是至关重要。在新型治疗手段不断涌现的当下，这一重要性尤为突出，因为免疫球蛋白基因分析具有指导治疗决策的潜力^{5,21,22,23,36,37,38}，这一点已在国际CLL研讨会（International Workshop on CLL）近期更新的美国国家癌症研究所（NCI）资助指南中正式指出²⁴。然而，严格的分析标准是必要的，特别是确定CLL患者克隆型IGHV基因的体细胞超突变（SHM）状态并非易事，而是一个多步骤的过程。其中某些实验步骤，尤其是引物的选择，若采用特定方案或策略，可获得更优结果；而其他技术环节，如样本选择或克隆性评估方法，则在一定程度上具有灵活性，因为这些因素对最终结果的影响甚微，甚至无显著差异。

在过去十年中，ERIC 致力于推动与慢性淋巴细胞白血病（CLL）诊断和预后相关的各种方法的标准化与统一。这体现在已发表的免疫遗传学分析建议和指南^27,34、多次组织的教育培训研讨会和活动、IG 网络的建立，以及为讨论和指导 CLL 中 IG 基因序列解读而设立的专家在线论坛。ERIC 通过这些举措的总体目标是促进最佳的临床管理和患者照护。尽管已付出巨大努力，但这项任务远未完成，事实上，由于旨在免疫谱型分析的新型高通量测序技术的发展，其复杂性进一步增加。然而，尽管仍存在挑战，针对 CLL 中 IG 基因分析的严格标准化工作仍在持续进行，并且目前仍是 ERIC 内部正在进行的各项活动的重点。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
BD Vacutainer K2EDTA 抗凝塑料采血管：管塞	ThermoFisher scientific	02-689-4	材料储存
BD Vacutainer CPT 单个核细胞分离管 - 肝素钠	Becton Dickinson	362753	材料储存
BD Vacutainer 肝素采血管常见问题解答	Daigger Scientific	366480	材料储存
UltraPure 0.5 M EDTA pH 8.0	Invitrogen	15575038	细胞处理
15 mL 离心管 CS500	Corning	352096	细胞处理
50 mL 聚丙烯离心管 CS500	Corning	352070	细胞处理
RPMI 1640 培养基（1X），液体	Invitrogen	21875-091	细胞处理
Ficoll-Paque PLUS，6 × 100 mL	STEMCELL Technologies	17-1440-02	细胞处理
5 mL 血清移液管	Sarstedt	861,253,001	细胞处理
10 mL 血清移液管	Sarstedt	861,254,001	细胞处理
25 mL 血清移液管	Sarstedt	861,685,001	细胞处理
杜氏磷酸盐缓冲液（D-PBS）（1X）	Invitrogen	14190250	细胞处理
血细胞计数板（Neubauer 板）	Marienfeld-Superior	640010	细胞处理
Türk 溶液	Sigma-Aldrich	93770	细胞处理
PureLink 基因组 DNA 小量提取试剂盒	Invitrogen	K1820-01	DNA 提取
QIAamp RNA 血液小量提取试剂盒	Qiagen	52304	RNA 提取
AllPrep DNA/RNA 小量提取试剂盒	Qiagen	80204	DNA/RNA 提取
5X 第一链合成缓冲液	Invitrogen	P/N Y02321	cDNA 合成
随机引物，20 µg	Promega	C1181	cDNA 合成
RNaseOUT™ 重组核糖核酸酶抑制剂	Invitrogen	10777019	cDNA 合成
DTT	Invitrogen	P/N Y00147	cDNA 合成
SuperScript II 逆转录酶	Invitrogen	18064-014	cDNA 合成
10 mM dNTP 混合液	Invitrogen	18427013	cDNA 合成，PCR
PCR 缓冲液	Invitrogen	O00065	PCR
MgCl2（氯化镁）（25 mM）	ThermoFisher scientific	AB0359	PCR
Taq DNA 聚合酶，重组	Invitrogen	10342-020	PCR
Applied Biosystems 5′ 标记引物	ThermoFisher scientific	-	PCR/克隆性分析
Agilent 高灵敏度 DNA 检测试剂盒	Agilent Technologies	5067-4626	PCR 产物定量
UltraPure TBE 缓冲液，10X	ThermoFisher scientific	15581044	凝胶电泳
UltraPure 溴化乙锭，10 mg/mL	ThermoFisher scientific	15585011	凝胶电泳
SYBR Safe DNA 凝胶染料	ThermoFisher scientific	S33102	凝胶电泳
10X BlueJuice 凝胶上样缓冲液	Invitrogen	16500100	凝胶电泳
DNA Ladder 1000 bp/1 kb ladder BLUE 即用型	Geneon	305-105	凝胶电泳
UltraPure 琼脂糖	ThermoFisher scientific	16500500	凝胶电泳
低熔点琼脂糖	Sigma-Aldrich	A9414-250G	凝胶电泳
Novex TBE 凝胶，10%，10 孔	ThermoFisher scientific	EC6275BOX	凝胶电泳
ExoSAP-IT PCR 产物纯化试剂	ThermoFisher scientific	78201.1.mL	PCR 产物纯化
QIAquick 凝胶回收试剂盒（50）	Qiagen	28704	PCR 产物纯化
GenomeLab DTCS 快速启动试剂盒	Beckman Coulter	608120	Sanger 测序
乙酸钠溶液（3 M），pH 5.2	ThermoFisher scientific	R1181	Sanger 测序
糖原，分子生物学级	ThermoFisher scientific	R0561	Sanger 测序
无水乙醇	EMD Millipore	1024282500	Sanger 测序
SafeSeal 1.5 mL 管	Sarstedt	72,706	通用
Multiply-Pro 0.2 mL 杯，聚丙烯	Sarstedt	72,737,002	通用
离心机			设备
PCR 仪			设备
生物分析仪（Bioanalyzer）	Agilent Technologies		设备