我们展示了一种无需人工支架构建基于单细胞的三维（3D）组装的新方法。
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摘要
摘要
再生医学和组织工程为难治性疾病治疗提供了多种优势，已有许多研究证明了三维（3D）细胞组装在这些领域中的重要性。以往常使用人工支架来构建三维细胞组装结构。然而，用于构建细胞组装的支架有时具有毒性，并可能改变细胞的特性。因此，建立一种无毒且促进细胞间接触的方法将具有重要意义。本文介绍了一种利用光学镊子与葡聚糖构建稳定细胞组装的新方法。该方法的优势之一是在几分钟内即可实现稳定的细胞间接触。这种新方法可在天然亲水性聚合物中构建三维细胞组装结构，有望为再生医学和组织工程领域下一代三维单细胞组装的构建提供有力工具。
引言
尽管人体组织由多种细胞集合构成，并有助于维持机体的稳态，但单个细胞自身也发挥着重要作用 通过 细胞间相互作用。因此，阐明单个细胞如何响应外部信号以及它们如何将这些信号传递给其他贴壁细胞至关重要。为此，已建立多种方法用于构建基于单细胞的三维（3D）组装结构1,2,3,4,5,6,7,8然而，用于构建细胞组装体的材料仍有改进空间。例如，包括聚乙二醇（PEG）在内的合成凝胶和聚合物具有特定的化学和理化特性，可能影响靶细胞例如， 毒性
我们近期报道了一种新型系统，该系统可通过右旋糖酐（DEX）建立稳定的细胞间接触，从而生成基于单细胞的三维（3D）细胞组装体9。我们认为，该技术在再生医学乃至癌症生物学等多个研究领域中均具有应用潜力。在本报告中，我们描述了如何在不存在人工支架的情况下，通过多种亲水性生物大分子（包括DEX）操控单个细胞并构建三维（3D）细胞组装体的方法。
方案
1. 细胞的制备
- 在25 cm3培养瓶中，使用5 mL含10% (v/v) 胎牛血清（FBS）和1% (v/v) 青霉素-链霉素（P/S）的D-MEM培养基培养NAMRU小鼠乳腺上皮细胞（NMuMG细胞）。弃去含10% FBS和1% P/S的杜氏改良伊格尔培养基（D-MEM）。
- 向培养瓶中加入3-5 mL 37 °C的磷酸盐缓冲液（PBS）（-）。注意PBS的pH值为7.1-7.3。
- 用吸管将培养瓶中的所有PBS吸除。
- 向培养瓶中加入1.5 mL 37 °C的胰蛋白酶（0.25%，w/v）。
- 将培养瓶置于CO2培养箱中，37 °C孵育约1-2 分钟。
- 向培养瓶中加入3.5 mL含10% FBS和1% P/S的D-MEM培养基，用移液器吹打混匀。
- 将细胞悬液转移至15 mL离心管中，在室温下离心3分钟。注意离心机的旋转半径为16.6 cm，转速为1500 rpm。在此条件下，相对离心力为417 × g。
- 吸除培养液后，在培养瓶中加入5 mL新鲜D-MEM培养基（含10% FBS和1% P/S）（如需要，按照生产商说明使用冻存液对细胞进行冷冻保存）。
2. 葡聚糖（DEX）的制备
- 通过将10 mL D-MEM（含10% FBS，1% P/S）与0.8 g DEX混合，配制80 mg/mL的DEX溶液。注意，细胞培养足够时间后，DEX溶液可用注射器滤器（0.22 µm）过滤。
- 取2.1中制备的细胞悬液200 µL与DEX溶液200 µL混合，制备含40 mg/mL DEX培养基的细胞悬液。注意，该溶液中细胞的数密度约为2.3×105 cells/mL。
3. 激光与显微镜的准备工作
- 打开激光器（连续波，1,064 nm 波长）（图 1a）。请注意，使用红光至近红外区域波长的激光束效果最佳；该波长区域被称为诊断与治疗窗口10，因为细胞对该区域光的吸收最少。
- 双击软件图标。
- 依次双击 ① 相机、② 发光二极管（LED）、③ 焦点调节和 ④ 移动载物台的图标。对应的 ①–④ 显示界面将出现（图 1b）。
4. 使用激光捕获系统进行细胞操作
- 取2.2步骤中制备的20 µL样品，滴加到底部盖玻片（厚度0.17 mm，尺寸=30 mm × 40 mm）上，并用顶部盖玻片（厚度0.17 mm，尺寸=18 mm × 18 mm）覆盖，上下盖玻片之间由两个间隔片（厚度0.17 mm，尺寸=10 mm × 24 mm）隔开，如图2所示。注意：这些玻片无需特殊涂层。
- 将4.1步骤中制备的样品池放置在下物镜（水浸物镜，约10 μl，放大倍数=60X，工作距离=0.28 mm，数值孔径=1.2）上。
- 将上物镜（水浸物镜，约10 μl，放大倍数=60X，工作距离=2 mm，数值孔径=1.0）安装在样品池顶部。
- 点击图标2（图1b）打开LED光源。
- 通过点击面板3上的图标（图1b），调节样品与下物镜之间的距离，直至图像清晰对焦。
- 点击图标I、II和III（图1b），在样品的Position 1和Position 2（图1B）位置照射激光束。
- 在图标IV处输入数值，将每束激光的强度设定为1,500 mW（图1b）。
- 点击图标4并指示方向（图1b），移动样品台，直至一个细胞被捕获在Position 1（图1b）位置。
- 拖动指示Position 2（图1b）的光标，直至另一个细胞被捕获在Position 2位置。
5. 三维（3D）细胞结构的构建
- 操纵单个细胞，使其与另一个细胞接触。保持此状态300秒。 即， 每个细胞暴露于激光下300秒。
- 记录所示的 X-Y 轴 图1b.
- 通过捕获并转运另一个细胞至已有细胞，构建任意的二维细胞组装。
- 通过上下移动载物台构建三维细胞组装结构。
- 确认激光关闭后组装体仍保持稳定。
结果
图1展示了本研究中使用的显微镜和软件。图2为含有细胞的样品溶液放置步骤的示意图。图3展示了利用双光束光镊形成金字塔结构的过程。若实验成功，这些细胞组装体即使在激光关闭后仍能保持稳定。
图 1：（a） 激光捕获系统（NanoTracker2 (11)）的控制系统。通过执行步骤①-③打开激光开关以启动系统。（b） 用于控制激光捕获系统的软件。通过分别点击图标①、②、③和④来激活相机、LED光源、调焦功能和移动载物台。显微图像显示在面板1中。LED的开关控制位于面板2中。调焦控制位于面板3中。通过点击图标I至IV，可在位置1和位置2处照射激光束。该激光捕获系统的详细信息见参考文献(12)。请点击此处查看此图的放大版本。
图 2：放置载玻片的代表性示意图。将 20 µL 样品（含葡聚糖的细胞悬液）滴加到载玻片上，用于激光操控。请点击此处查看此图的放大版本。
图3：a) 在含有DEX（40 mg/mL）的培养基中形成的具有预定形状的上皮细胞（NMuMG）聚集体：以金字塔形为例展示三维细胞簇。 b) 同时展示了金字塔形三维细胞聚集体的示意图。 请点击此处查看该图的放大版本。
讨论
本研究展示了我们近期关于利用可溶性聚合物构建三维单细胞组装体的报告9,11 的具体应用。当细胞数量不超过10个时，此类组装体可在体相溶液中稳定形成，并能被单束激光捕获。当细胞数量超过10个时，组装体会在玻璃表面沉淀。尽管实验仍处于初级阶段，但我们预计这种新方法可能成为构建下一代三维单细胞组装体的有力工具，而这类组装体对于细胞生物学和再生医学领域的发展至关重要。
在不含聚合物的溶液中，细胞由于表面电荷引起的静电排斥、水合排斥力、糖萼排斥效应以及膜波动而相互排斥。我们之前的研究表明，当细胞经聚乙二醇（PEG）处理后，细胞对可以长时间保持稳定。更重要的是，将已在PEG中接触5分钟的细胞对成功转移至无PEG区域后，细胞间的接触仍能维持稳定，这表明细胞接触以一种稳定的方式得以保持。这一现象可通过耗竭效应得到合理解释11，本质上，利用葡聚糖（DEX）形成的细胞聚集体也遵循相同的机制9。我们目前的结果表明，其他类型的天然大分子也可能被用于构建稳定的三维细胞聚集体。
为了实现细胞的快速转运，聚合物的浓度至关重要。通常情况下，当聚合物溶解浓度超过重叠浓度时，溶液的黏度会急剧升高。在此条件下，使用光镊操控细胞将变得困难。因此，实验应在重叠浓度以下进行。对于葡聚糖（DEX）溶液，其重叠浓度约为 50 mg/mL（动力学黏度为 5.5 mm2/s）。如参考文献9所示，当DEX浓度在10 mg/mL至40 mg/mL之间时，可观察到稳定的细胞组装结构。该结果表明，即使DEX浓度低于重叠浓度，耗竭效应仍足够强，能够维持稳定的细胞间接触。已有研究表明，添加DEX在浓度高达40 mg/mL时不会影响细胞活力9。
构建三维细胞聚集体的方法在再生医学领域具有重要意义，因为模拟人体组织结构 体内 通过构建单细胞的细胞微环境，可能促进干细胞来源的组织形成。迄今为止，我们已采用本方案利用 Neuro2A 细胞构建细胞聚集体。9 除了 NMuMG 细胞外，我们还希望建立一种实验方法，用于构建包含更多数量且具有多种形态的三维细胞组装体。该光学镊子系统由 Ichikawa 开发 等13 可用于此目的，因为细胞的取向可以被控制。沿这一方向的进一步试验应具有良好的前景。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者感谢同志社大学的Shu Hashimoto、Aoi Yoshida和Taeko Ohta在实验装置方面提供的大力支持。本研究由KAKENHI（15H02121、15K05400、25103012、50587441）以及文部科学省资助的私立大学战略研究基地项目资助。本研究还得到了波兰科学与高等教育部第05-1/KNOW2/2015号决议支持的KNOW（领先国家研究中心）科学联合体"健康动物 - 安全食品"的资助。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 显微镜 IX71 | 奥林巴斯 | IX71 | |
| 葡聚糖（200,000；分子生物学级） | 和光 | CAS编号 9004-54-0 | |
| 激光捕获系统（NanoTracker 2） | JPK Instruments | S/N T-05-0200 | |
| 上部物镜 | Olympus | LUMPLFLN60XW | |
| 低倍物镜 | Olympus | UPLSAPO60XW | |
| 顶盖玻片 | MATUNAMI | C022401 | |
| 中间盖玻片（间隔片） | MATUNAMI | - | 定制（尺寸 = 10 mm）×10 毫米，厚度 = 0.17 毫米 |
| 底部盖玻片 | MATUNAMI | C030401 | |
| 相机 | The Imaging Source | DFK 31AF03 | |
| 软件 | JPK Instruments | NanoTracker2 PFM 软件 | |
| NMuMG 细胞 | 理化学研究所生物资源研究中心 | RCB2868 | |
| PBS | 和光 | 166-23555 | |
| 细胞冻存液 | 日本全薬工業 | ZR621 | |
| D-MEM | 和光纯药工业株式会社，日本 | 044-29765 | |
| FBS | 细胞培养，日本日清生物科学公司 | 172012-500ML | |
| 胰蛋白酶 | 赛默飞世尔科技 | 25200056 | |
| 青霉素-链霉素 | 和光纯药工业株式会社，日本 | 161-23181 |
参考文献
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