原位显微镜技术用于生物过程中单细胞形态的实时测定

摘要

一种光-光学 原位 开发了一种显微装置，用于直接在细胞悬液中监测单个细胞的大小。通过将光-光学生物可灭菌探头与自动图像分析系统耦合，实现实时测量。细胞形态变化随生长状态和培养条件的不同而呈现差异。

摘要

原位 微生物生物过程中的监测主要局限于培养基的化学和物理性质（例如pH值和溶解氧浓度）。然而，细胞形态可作为判断最佳培养条件的合适指标，因为其形态会随生长状态、产物积累和细胞应激而发生变化。此外，单细胞大小分布不仅能够反映培养条件，还能揭示细胞群体的异质性。为获取此类信息，需采用一种基于光学成像的 原位 显微镜装置¹ 旨在实现对生物反应器中细胞悬浮液内单细胞大小分布的直接监测。该系统将基于神经网络模型的显微镜与自动图像分析相结合，神经网络模型通过用户标注的图像进行训练。从显微镜采集图像中获取的多个参数与细胞的工艺相关特征（如代谢活性）相关联。截至目前，所介绍的 原位 显微镜探针系列被用于测量丝状真菌悬浮液中的菌丝球大小，也可用于区分微藻培养中的单细胞尺寸，并将其与脂质积累相关联。细胞颗粒的形态与酵母培养中的出芽现象相关。显微分析通常可分为三个步骤：（i）图像采集，（ii）颗粒识别，以及（iii）数据分析。所有步骤均需根据具体生物体进行调整，因此必须提供特定的注释信息，以获得可靠结果。该技术具备直接监测细胞形态变化的能力 在一行中 或 在线 （旁路）可在工艺开发及生产规模中实现在线监测与控制的实时数值。如果 离线 数据与实时数据相关，当前繁琐的 离线 无需再进行可能对细胞大小产生未知影响的测量。

引言

细胞的形态特征通常与其生理状态相关，许多应用中均存在形态与功能之间的关联。单个细胞的形态受生长状态、细胞年龄、渗透压及其他潜在的细胞应激因素或产物积累的影响。细胞的形态变化常常可作为衡量培养物生长活力的指标。细胞内产物合成、藻类中的脂质积累以及细菌中的包涵体形成等过程也与细胞大小相关。细胞聚集可能是另一个值得研究的因素，最近已有相关综述²。

基于单个细胞的形态特征，可以对群体异质性进行量化。研究表明，培养物内部的异质性可能十分显著，例如，在大规模生产条件下³，亚群的低效表现可能会影响整体产量⁴。

通常，细胞形态特征的评估通过人工取样或使用旁路流动室连接光电检测装置来完成。这种方法存在若干局限性：所获取的数据量有限，难以提供具有统计可靠性的测量结果；取样与获得结果之间的时间延迟可能过长，无法跟上过程的动态变化；更重要的是，取样过程本身（如取样口的位置、测量前对样品的预处理、取样管或旁路管中的不利条件）可能引发偏差，因为取样操作本身就可能影响细胞形态。最后，若无法在线灭菌，取样过程或旁路系统始终存在较高的污染风险。

应用 原位 显微镜技术（ISM）可以克服其中多个问题。若细胞能够被自动检测，则....

方案

注意：以下步骤对于根据特定微生物和培养条件调整参数是必要的。对于有经验的用户，探针设置的调整大约需要 20 分钟。相关探针的操作手册（由 SOPAT GmbH 提供）中提供了工具和步骤的详细说明。通常，本方案中所述的以下工具是必需的：（i）Probe Controller，用于探针调节和图像采集；（ii）Fiji (ImageJ)，用于对采集的图像进行标注；（iii）SOPAT support，用于人工神经网络（ANN）训练和工作流程创建；（iv）Batcher，用于利用已建立的工作流程对已采集的图像进行批量数据处理；（v）Result Analyzer，用于对批量处理后的图像结果进行可视化和评估；以及（vi）Monitor，用于自动化实时测量和结果可视化。

1. 设置硬件参数

1. 准备一个在实验过程中可能达到最高细胞浓度的培养液，或通过离心并重悬菌体以达到该浓度。本例中，S. cerevisiae 培养选用的干生物质浓度为 65 g L^-1。
2. 制备一系列稀释样，其浓度范围应覆盖从最高到最低的预期范围。建议至少设置 4 个不同浓度。
3. 通过常规显微镜观察确定微生物的细胞尺寸范围，并定义相应细胞的预期最大直径（d_max）。对于 S. cerevi....

结果

利用ISM和自动图像检测对酵母培养物中的细胞大小进行检测，并成功区分了出芽与非出芽细胞。频闪灯强度和测量间隙的选择均存在一定的容差范围，在此范围内粒子识别不受影响。例如，在干生物量浓度为4 g L^-1时，对S. cerevisiae细胞在频闪灯强度变化范围达11%的条件下进行了测量。所得图像中细胞边界清晰，因此无论频闪灯强度如何，均可实现可行的粒子识别，且细胞大小的测量变异在可接受范围内（1%）。若频闪灯强度未正确调节，则图像会出现过亮现象，导致无法实现准确的细胞识别（图4）。

讨论

如文中所述，使用相同或极为相似的设备，ISM 已被用于测量真菌、微藻和酵母细胞的形态动力学，从而能够确定其生长活性，对于微藻还可确定其细胞内产物的积累情况。该传感器无活动部件，可直接应用于任何标准搅拌式生物反应器中，既可通过标准接口安装，也可置于可灭菌的旁路系统中。由于酵母细胞远小于微藻细胞，为实现对酵母足够高的像素分辨率，近期对硬件进行了若干调整，例如提高了相机分辨率，并采用透射照明方式（技术细节参见¹⁵）。然而，对于测量细菌等更小的细胞，仍然存在局限性。目前 原位 光-光学子仪器在高浓度条件下存在颗粒信息重叠的局限性，并且在紫外/可见光谱以下会受到结构干扰效应的影响。迄今为止，除亮度相关性分析外，尚无针对细菌悬浮液的图像分析算法得到应用。¹⁶.

其他先前应用的ISM工具被用于确定细胞浓度，以验证其可靠性。然而，当细胞浓度升高导致细胞相互重叠时，这一方法变得尤为关键。因此，本研究的重点并非细胞定量，而是形态特征的检测，而图像特征（如亮度强度）可与其他设备一样，用于关联.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
传感器 MM 2.1 - MFC	SOPAT GmbH, 德国	n.a.	带微流池的在线单目显微探头 2.1 版
软件版本 v1R.003.0092	SOPAT GmbH, 德国	n.a.
厚度测量仪	n.n.		可来自任意供应商，符合 DIN 2275:2014-03 标准
70% 乙醇	n.n.		可来自任意供应商
SOPAT 手册 2.0.5 版	SOPAT GmbH, 德国
光学镜头纸	VWR	470150-460
Fiji, ImageJ	开源软件
50 mL 圆锥形离心管			可来自任意供应商