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原位显微镜技术用于生物过程中单细胞形态的实时测定

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DOI：

10.3791/57823

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2019年12月5日

 ,  ,  ,  , 
1Chair of Bioprocess Engineering, Department of Biotechnology, Technische Universität Berlin, 2SOPAT GmbH

本文内容

摘要

一种光-光学 原位 开发了一种显微装置，用于直接在细胞悬液中监测单个细胞的大小。通过将光-光学生物可灭菌探头与自动图像分析系统耦合，实现实时测量。细胞形态变化随生长状态和培养条件的不同而呈现差异。

摘要

原位 微生物生物过程中的监测主要局限于培养基的化学和物理性质（例如pH值和溶解氧浓度）。然而，细胞形态可作为判断最佳培养条件的合适指标，因为其形态会随生长状态、产物积累和细胞应激而发生变化。此外，单细胞大小分布不仅能够反映培养条件，还能揭示细胞群体的异质性。为获取此类信息，需采用一种基于光学成像的 原位 显微镜装置1 旨在实现对生物反应器中细胞悬浮液内单细胞大小分布的直接监测。该系统将基于神经网络模型的显微镜与自动图像分析相结合，神经网络模型通过用户标注的图像进行训练。从显微镜采集图像中获取的多个参数与细胞的工艺相关特征（如代谢活性）相关联。截至目前，所介绍的 原位 显微镜探针系列被用于测量丝状真菌悬浮液中的菌丝球大小，也可用于区分微藻培养中的单细胞尺寸，并将其与脂质积累相关联。细胞颗粒的形态与酵母培养中的出芽现象相关。显微分析通常可分为三个步骤：（i）图像采集，（ii）颗粒识别，以及（iii）数据分析。所有步骤均需根据具体生物体进行调整，因此必须提供特定的注释信息，以获得可靠结果。该技术具备直接监测细胞形态变化的能力 在一行中 或 在线 （旁路）可在工艺开发及生产规模中实现在线监测与控制的实时数值。如果 离线 数据与实时数据相关，当前繁琐的 离线 无需再进行可能对细胞大小产生未知影响的测量。

引言

细胞的形态特征通常与其生理状态相关，许多应用中均存在形态与功能之间的关联。单个细胞的形态受生长状态、细胞年龄、渗透压及其他潜在的细胞应激因素或产物积累的影响。细胞的形态变化常常可作为衡量培养物生长活力的指标。细胞内产物合成、藻类中的脂质积累以及细菌中的包涵体形成等过程也与细胞大小相关。细胞聚集可能是另一个值得研究的因素，最近已有相关综述2。

基于单个细胞的形态特征，可以对群体异质性进行量化。研究表明，培养物内部的异质性可能十分显著，例如，在大规模生产条件下3，亚群的低效表现可能会影响整体产量4。

通常，细胞形态特征的评估通过人工取样或使用旁路流动室连接光电检测装置来完成。这种方法存在若干局限性：所获取的数据量有限，难以提供具有统计可靠性的测量结果；取样与获得结果之间的时间延迟可能过长，无法跟上过程的动态变化；更重要的是，取样过程本身（如取样口的位置、测量前对样品的预处理、取样管或旁路管中的不利条件）可能引发偏差，因为取样操作本身就可能影响细胞形态。最后，若无法在线灭菌，取样过程或旁路系统始终存在较高的污染风险。

应用 原位 显微镜技术（ISM）可以克服其中多个问题。若细胞能够被自动检测，则可对其形态学特征进行准确识别与分析5迄今为止，该方法的主要局限性在于：（i）图像评估时间过长，难以满足实际需求 原位 应用，以及（ii）图像分辨率较差，尤其是在细胞密度较高时。尽管ISM的早期解决方案包括机械采样、探针稀释或仅限于旁路系统6,7，进一步的方法允许直接捕获细胞悬液8.

ISM 技术的最新进展使得能够在单细胞水平上对细胞进行在线或联机监测，从而在较高细胞浓度的细胞悬液中实时直接获取形态学参数的分布情况。通过对细胞关键参数的离线分析，可识别出与耦合的自动细胞检测和 ISM 所提供信息之间的相关性。随后，由此实现新的软传感器设计，即利用单细胞形态学特征来估计无法直接测量的参数。

本报告中，通过将光电探头与自动图像分析系统耦合来实施ISMA。ISMA包含一个单杆式传感器探头，可在可调节的测量间隙内，在已知焦距范围内利用高分辨率CCD相机[MM-Ho = CCD GT2750 (2750×2200) 和 MM 2.1 = CMOS G507c (2464×2056)]采集图像。照明采用透射闪光方式，光源位于相机的对侧9，其强度可调节。细胞随液体流动连续通过该间隙，从而获得具有代表性的样本群体。该探头可直接安装至生物反应器中，伸入细胞悬浮液内，也可用于可灭菌的旁路系统。传感器外壳在灭菌前即连接至系统，光学部件则在灭菌后装入外壳中。

迄今为止，相关的工业微生物， 例如，丝状真菌（直径可达200 µm以上），异养微藻 Crypthecododinium cohnii （平均细胞直径为20 µm）以及酵母 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae） （平均细胞直径为5 µm）的细胞被用于本研究或类似装置中，相关内容简述如下。

丝状真菌在特定培养条件下 tends to 形成菌丝球，其大小可达数百 µm。真菌细胞的菌丝长度会因流体相中的流体动力学应力不同而有所差异。这会影响其代谢和生长活性、底物吸收以及产物释放。已应用 ISM 来确定菌丝球的尺寸分布及其边缘低生物量密度区域的宽度（本实验室未发表数据）。

C. cohnii 在氮限制条件下积累多不饱和脂肪酸二十二碳六烯酸（DHA）时，细胞大小在 15 至 26 µm 之间变化。该生物技术DHA生产过程包括两个阶段：生长阶段，细胞在此阶段分裂并变小；生产阶段，细胞在此阶段积累产物因而体积增大。因此，细胞大小被用于判断过程所处的状态，以确定是利于生长还是DHA生产。最终发现细胞大小与DHA含量之间存在相关性。在此情况下，ISM技术能够在无需取样、细胞破碎以及常规气相色谱分析的条件下，实时监测细胞内DHA的积累过程10。

芽殖酵母的大小通常在 3 至 8 µm 之间。某一时刻处于成熟状态的细胞所占比例，即芽殖指数（BI），可反映其生长活力11,12，甚至已证实其与重组蛋白的分泌存在关联13。借助 ISM 技术，可区分出芽殖与非芽殖酵母细胞（即有芽和无芽的细胞）14。如近期在模拟大规模营养限制性补料分批培养条件的缩小规模培养实验中所示，胁迫条件还会导致酵母群体内细胞大小的变异范围更广3。

因此，ISM 有望在生物过程的各个阶段，在单细胞水平上监测细胞生长活力和产物形成，以确定最佳培养条件，或用于过程控制。本文所述方法主要针对单个微生物细胞的应用，但也适用于较大的颗粒，如人和动物细胞、细胞聚集体以及丝状生物的菌丝球。

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方案

注意：以下步骤对于根据特定微生物和培养条件调整参数是必要的。对于有经验的用户，探针设置的调整大约需要 20 分钟。相关探针的操作手册（由 SOPAT GmbH 提供）中提供了工具和步骤的详细说明。通常，本方案中所述的以下工具是必需的：（i）Probe Controller，用于探针调节和图像采集；（ii）Fiji (ImageJ)，用于对采集的图像进行标注；（iii）SOPAT support，用于人工神经网络（ANN）训练和工作流程创建；（iv）Batcher，用于利用已建立的工作流程对已采集的图像进行批量数据处理；（v）Result Analyzer，用于对批量处理后的图像结果进行可视化和评估；以及（vi）Monitor，用于自动化实时测量和结果可视化。

1. 设置硬件参数

  1. 准备一个在实验过程中可能达到最高细胞浓度的培养液，或通过离心并重悬菌体以达到该浓度。本例中，S. cerevisiae 培养选用的干生物质浓度为 65 g L-1。
  2. 制备一系列稀释样，其浓度范围应覆盖从最高到最低的预期范围。建议至少设置 4 个不同浓度。
  3. 通过常规显微镜观察确定微生物的细胞尺寸范围，并定义相应细胞的预期最大直径（dmax）。对于 S. cerevisiae，该值设定为 8 µm。
  4. 选择两个测量间隙，分别为预期细胞 dmax 的 5 倍和 10 倍。
  5. 选择最高频闪强度，并针对两种间隙宽度，在最高细胞浓度条件下选择频闪强度，使细胞在光照最弱（图像最暗）的情况下仍能在图像中清晰可见。
  6. 选择最低频闪强度，然后针对两种间隙宽度，在最低细胞浓度（测量期间可能出现的最低浓度）条件下选择频闪强度，使细胞在光照最强（图像最亮）的情况下仍能清晰可见。
  7. 为每个测量间隙、两种频闪强度以及待测的浓度范围选择一个合适的焦平面，以获得最清晰的图像（聚焦方法详见步骤 2）。正确对细胞进行对焦，以便后续对图像数据进行标注（参见步骤 4）。
  8. 使用两种间隙宽度和两种频闪强度，测量先前制备好的细胞浓度稀释系列（参见步骤 2）。

浓度校准工具界面、线性回归图、浓度分析方法。
图1：浓度校准工具。 左侧图形用户界面（GUI）：设置包含已知浓度的图像目录（至少3个）；中间图形用户界面：选择在图像目录上计算的特征；右侧图形用户界面：选择加权均方根误差（WRMSE）以确定最小值。WRMSE以及任意图像特征与细胞浓度之间的最佳相关性。请点击此处查看该图的放大版本。

  1. 评估稀释系列实验。
    1. 使用 浓度校准（CoCa）工具 （参见 图1以确定提取的图像特征（亮度或清晰度）与用户先前提供的测量浓度之间的最佳相关性 例如，干重生物量或细胞计数。有关更多详细信息，请参阅软件手册中的说明。
    2. 识别从不同浓度下的图像特征中提取的信息与任何参考数据之间的最佳相关性 离线 测量。参见图注 图1.
    3. 在考虑浓度相关曲线特征的前提下，选择能使加权均方根误差（WRMSE）最小的最合理的测量间隔和频闪强度。
      注意：实验过程中测量间隙保持固定，而频闪灯强度可根据细胞浓度进行调整。

2. 离线 测量

  1. 使用厚度规，按照步骤1调整所需的测量间隙。
  2. 打开图形用户界面 探针对照 在 SOPAT 仪表板中。
  3. 将所需的探头连接到软件子部分中的放大器 操作步骤 并按压 连接.
  4. 按压 播放 开始流媒体的按钮（实时观察).
  5. 用乙醇喷洒测量间隙以清洁，并用光学纸小心擦拭任何灰尘或污物。使用放大镜检查传感器玻璃表面是否无颗粒物 实时观察 在 CamControl.
    注意：颗粒物和灰尘会干扰测量结果及自动细胞识别。
  6. 在测量间隙中放置一张干燥的光学纸。打开标签 探针对照 调节频闪仪强度以观察纸张，旋转固定螺丝直至纸张的单根纤维清晰可见。
  7. 用培养液填充试管。将显微镜浸入培养液中，使间隙完全被细胞悬液覆盖。打开标签 探针对照 并根据第1节调整所需的频闪仪强度。通过微调聚焦旋钮对细胞进行聚焦。实验过程中不得再改变聚焦。
    注意：向 50 mL 锥形离心管中加入 5–6 mL 培养液，以充分填充测量间隙。
  8. 在菜单的用户界面中定义每个时间点的帧数 [-] 触发 在图形用户界面中 每触发帧数将每触发采集的帧数设置为200帧。
    注意：帧数可减少至获得具有统计学可靠结果所需的最低值。这取决于获取具有代表性的细胞形态大小分布所需的样本量（另见步骤5）。
  9. 在菜单中定义帧率 [Hz] 触发 在图形用户界面中 帧率选择一个帧率，以确保前一帧中移动的颗粒不会出现在后续帧中。
    注意：可通过使用200帧的测试触发来验证此情况。检查图像中是否出现被重复捕获的颗粒。如果存在此类情况，则应降低帧率。对于 离线 测量时，建议使用 1 Hz。
  10. 在菜单中设置获取图像的保存目录 通用.
  11. 通过激活进行图像采集 开始图像触发采集 按钮。轻轻上下移动装有培养液悬浮液的试管，使液体流过测量间隙。
  12. 每次测量后重复步骤 2.5。
  13. 检查获取的图像。细胞必须足够清晰以便标注。检查图像中是否存在反复捕获的颗粒。如果存在此类情况，应降低帧率。
  14. 通过选择以下路径保存设置：C:\Program Files\SOPAT GmbH\monitoringPrograms\camcontrol，然后按 保存.

3. 颗粒物识别

  1. 为人工神经网络（ANN）训练标注颗粒（训练集）。
    1. 将获取的图像载入标注工具中Fiji，ImageJ通过将文件拖放到主窗口中ImageJ窗口（参见图形用户界面“Fiji工具在 图2)
    2. 通过选择以下选项打开 ROI 管理器： 分析 | 工具 | 感兴趣区域管理器.
    3. 选择一种选择工具。 描迹工具、手绘、圆形或椭圆形 建议进行筛选。
    4. 用之前提到的选择工具在需要标注的颗粒周围画一个圆，然后使用画笔工具进行细化。
    5. 将注释添加到 ROI 管理器 通过按压 添加 [t].
    6. 在约15张图像上标记所有感兴趣的目标（待识别的细胞）。
      注意：为了涵盖所有必要信息， 即， 不同形态、大小、细胞浓度、亮度 等等。，从实验开始阶段选取五张图像，中间阶段选取五张图像，结束阶段选取五张图像。
    7. 根据细胞形态决定是否需将其分类为不同的亚类例如，细胞周期的不同阶段），或所有细胞是否属于同一类别。
    8. 根据所选颗粒的类别相应更改其名称。为每个类别设置一个名称或缩写，并为该类别中的每个颗粒设置一个计数器（例如, 细胞_1, 细胞_2, 等等。）。每类至少标注50个粒子。
    9. 不要标注那些与过程无关、无需被检测的物体，例如气泡或未溶解的培养基成分等其他颗粒。
      注意：这些事件不会被纳入人工神经网络（ANN）的训练过程，而被视为背景。
    10. 不要对标记失焦的细胞进行注释。
    11. 尽可能保持图像标注的一致性。若有疑问，以标签为准 忽略 可应用该方法。强烈建议不要滥用此方法，因为人工神经网络（ANN）仅能识别已标注的结构。

显微镜下酵母细胞分析；ImageJ 软件界面；带有 50 µm 比例尺的细胞识别。
图 2：Fiji 工具用户界面。 使用已标注的图像创建训练集。图中显示了包含两个类别的手动标注，已标注颗粒的列表显示在 ROI 管理器中。不同类别可设置不同的名称和颜色。请点击此处查看该图的放大版本。

  1. 将标注的对象和图像保存为 ZIP 格式，并将文件发送至训练网络， 通过 上传至平台或发送 ZIP 文件 通过 电子邮件
    注意：通常需要进行多轮迭代训练，才能在图像上获得对分类对象的充分预测。每轮训练都会生成由程序返回的一个工作流程。
  2. 使用带有训练好的物体识别算法的工作流程（*.wf），通过数据批处理程序分析测试图像 批处理 可在仪表板中启动。
  3. 通过量化假阳性和假阴性事件，在测试图像上检查目标检测效果。
    1. 量化检测假阳性事件：错误识别为细胞的颗粒、未能正确分类的细胞，以及轮廓未能准确识别的细胞。
    2. 量化假阴性事件（未被识别为假阴性的细胞）。
  4. 在工具中可视化结果 结果分析仪 通过仪表板启动程序。
    1. 导入所需的結果文件 文件 | 导入文件 或 文件 | 导入文件夹.
    2. 通过可视化展示结果 图表 | 创建图表 在图表图形用户界面中。
    3. 选择以下选项之一：分布图、灵敏度图、随时间变化特征、随测点变化特征、特征 与 特征
      注意：关于使用该设备的手册 结果分析仪 随系统提供，也可从技术支持获取。
    4. 如果结果可以接受，则运行该工作流程 批处理器 在实验获取的所有图像上。同时，可以通过组合保存的设置来创建监控程序 探针控制器 （*.pcfg）与工作流程（*.wf）一起使用，另请参阅手册。
      注意：该工作流程也可用于对此培养基的后续实验进行监测。
    5. 如果结果不可接受，则检查训练集上的标注和/或继续进行下一轮迭代训练（参见步骤 4.2）。

4. 样本量测定

  1. 设定可接受的检测颗粒间标准差（σ）。
    注意：标准差的变化与细胞大小的均一性平行变化。标准差最大时，表明该样本的尺寸异质性程度最高。
  2. 根据测量值的预期方差，设定置信区间的幅度或期望的精度 (e).
  3. 将容许误差（α）设定在5%（z1-α/2 = 1.96）和 10%（z1-α/2 = 1.64).
  4. 根据公式 1 计算需从每一类中识别的细胞数量。
    样本量计算公式 n=(σz(1-α/2)/ε)²，统计学计算，公式示意图。 [公式 1]
    注：可根据细胞数量为每个数据点确定需要采集的图像数量。
  5. 对实验的随机时间点进行敏感性分析，以验证分析 n 个粒子所导致的平均 Feret 直径和 Dv90 的变异小于 5%。该计算可在 结果分析器.

5. 在线（旁路）或在线测量

  1. 首先执行离线测量程序（参见步骤2），以根据生物体种类及工艺条件（浓度或培养基）设定硬件和软件参数。
  2. 通过点击“加载”按钮，上传上一节中保存的设置，并选择以下路径：C:\Program Files\SOPAT GmbH\monitoringPrograms\camcontrol。
  3. 将探头连接至流动池或生物反应器。
    注意：原位测量可通过卡箍法兰实现。
  4. 进行灭菌处理。
    注意：仅仪器中与液体接触的探头部分可通过蒸汽灭菌。探头的湿接触长度范围为6至222 mm（图3）。

用于生物化学研究中工艺整合与优化的生物反应器流动回路装置示意图。
图3：ISM 装置示意图。 探头 MM-Ho（A）可直接安装于生物反应器中，而探头 MM 2.1（B）可用作旁路。每幅图中均以箭头标示了培养液的循环流向。MM-Ho 的转换因子为 0.166 µm pix-1，MM 2.1 的转换因子为 0.087 µm pix-1。请点击此处查看该图的高清版本。

  1. 在图形用户界面中定义图像采集速率 触发 在该领域 触发间隔 [s].
    注意：根据过程动力学的不同，可调整图像采集频率。例如，若预计存在3小时的延滞期，则采集频率可低于需监测代谢转换或产物积累的情况。后者通常要求更短的采集时间，达到分钟级。例如，在分批酵母培养过程中，每5至10分钟进行一次图像采集，即可充分获取反映过程动态的信息。
  2. 按照第2.10步所述定义帧率。
    注意：在 在线 和 在一行中 测量时，由于机械搅拌可增加通过间隙的流速，因此可以提高帧率。
  3. 通过激活按钮开始图像采集 开始所选探针的信号采集.
  4. 实验结束时，使用按钮停止采集 停止所选探针的流式传输.
    注意：对于第1个st 运行时，在接种培养物之前立即开始采集数据，然后进入第4步。对于后续的运行，打开程序 监测 在仪表板中选择已创建的工作流程（参见步骤4）。在接种培养物之前，按下按钮开始监测 播放 按钮

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结果

利用ISM和自动图像检测对酵母培养物中的细胞大小进行检测，并成功区分了出芽与非出芽细胞。频闪灯强度和测量间隙的选择均存在一定的容差范围，在此范围内粒子识别不受影响。例如，在干生物量浓度为4 g L-1时，对S. cerevisiae细胞在频闪灯强度变化范围达11%的条件下进行了测量。所得图像中细胞边界清晰，因此无论频闪灯强度如何，均可实现可行的粒子识别，且细胞大小的测量变异在可接受范围内（1%）。若频闪灯强度未正确调节，则图像会出现过亮现象，导致无法实现准确的细胞识别（图4）。

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讨论

如文中所述，使用相同或极为相似的设备，ISM 已被用于测量真菌、微藻和酵母细胞的形态动力学，从而能够确定其生长活性，对于微藻还可确定其细胞内产物的积累情况。该传感器无活动部件，可直接应用于任何标准搅拌式生物反应器中，既可通过标准接口安装，也可置于可灭菌的旁路系统中。由于酵母细胞远小于微藻细胞，为实现对酵母足够高的像素分辨率，近期对硬件进行了若干调整，例如提高了相机分辨率，并采用透射照明方式（技术细节参见15）。然而，对于测量细菌等更小的细胞，仍然存在局限性。目前 原位 光-光学子仪器在高浓度条件下存在颗粒信息重叠的局限性，并且在紫外/可见光谱以下会受到结构干扰效应的影响。迄今为止，除亮度相关性分析外，尚无针对细菌悬浮液的图像分析算法得到应用。16.

其他先前应用的ISM工具被用于确定细胞浓度，以验证其可靠性。然而，当细胞浓度升高导致细胞相互重叠时，这一方法变得尤为关键。因此，本研究的重点并非细胞定量，而是形态特征的检测，而图像特征（如亮度强度）可与其他设备一样，用于关联...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

作者感谢德国联邦经济和能源部在ZIM-Koop框架内对项目“智能过程检测”（资助编号：ZF 4184201CR5）提供的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
传感器 MM 2.1 - MFCSOPAT GmbH, 德国n.a.带微流池的在线单目显微探头 2.1 版
软件版本 v1R.003.0092SOPAT GmbH, 德国n.a.
厚度测量仪n.n.可来自任意供应商，符合 DIN 2275:2014-03 标准
70% 乙醇n.n.可来自任意供应商
SOPAT 手册 2.0.5 版SOPAT GmbH, 德国
光学镜头纸VWR470150-460
Fiji, ImageJ开源软件
50 mL 圆锥形离心管可来自任意供应商

参考文献

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