本文介绍了一种在携带原位人源性原发性脑肿瘤的免疫缺陷小鼠中，制备并进行立体定向移植同种异体人淋巴细胞的实验方案。本研究为细胞免疫疗法经颅内递送的可行性和抗肿瘤疗效提供了概念验证。
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方法文章
立体定向过继性移植细胞毒性免疫细胞至原位人源多形性胶质母细胞瘤异种移植小鼠模型
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
多形性胶质母细胞瘤（GBM）是成人中最常见且最具侵袭性的原发性脑癌，通常预后不良，过去十年中提出的有效疗法极为有限。在设计新型治疗策略的诸多有前景的候选方案中，细胞免疫疗法旨在清除高度侵袭性且具有化疗和放疗耐药性的肿瘤细胞，这些细胞很可能导致该癌症的快速且致命的复发。因此，在肿瘤附近施用同种异体GBM反应性免疫效应细胞（例如人Vϒ9Vδ2 T淋巴细胞），将是一种将高效且高浓度治疗剂直接递送至脑部恶性肿瘤部位的独特机会。本文介绍了一种针对携带原位人源性原发性脑肿瘤的免疫缺陷小鼠，制备并进行立体定向注射同种异体人淋巴细胞的实验方案。本研究为依赖于在脑内肿瘤区域立体定向注射同种异体人淋巴细胞的这类细胞免疫疗法的可行性及其抗肿瘤疗效提供了临床前概念验证。
引言
胶质母细胞瘤（GBM，WHO IV级星形细胞瘤）是成人中最常见且最具侵袭性的原发性脑癌。尽管采用手术联合放化疗的强化治疗手段，GBM的预后仍然极差（中位生存期为14.6个月，2年死亡率>73%）1。这表明在过去十年中，仅有少数有效的治疗进展得到验证2。在设计更有效治疗策略的诸多候选方案中3,4,5，免疫疗法6目前正被探索用于追踪并清除具有高度侵袭性且对放疗/化疗耐受的肿瘤细胞，这些细胞被认为在肿瘤快速且致命的复发过程中起关键作用7。已鉴定出多种潜在的免疫学靶点，并被提出用于免疫治疗，包括天然或经修饰的αβ或ϒδ T淋巴细胞，以及GBM特异性肿瘤抗原或应激诱导分子8,9,10。给予特定的对GBM有反应的免疫效应细胞，为将大量效应淋巴细胞直接递送至残留恶性病灶部位提供了独特机会。为支持这一策略，我们近期研究表明，基于免疫缺陷小鼠携带原位人源GBM异种移植的模型，能够真实....
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方案
涉及动物受试者的以下实验程序均按照机构指南（协议编号 #00186.02；法国卢瓦尔河地区区域伦理委员会）进行。人外周血单个核细胞（PBMCs）来自知情健康供体的血液样本（法国南特法国血液中心）。所有操作均在无菌条件下进行。
1. 细胞毒性效应T淋巴细胞的非特异性扩增
- 准备并以35 Gy照射饲养细胞。用于刺激2 x 105 - 4 × 105 效应细胞，准备 10 x 106 PBMCs 和 1 x 106 来自三位不同健康供体的BLCLs。
- 将饲养细胞和效应细胞均用15 mL RPMI重悬，RPMI中添加10%热灭活FCS、2 mM L-谷氨酰胺、青霉素（100 IU/mL）、链霉素（0.1 µg/mL）和300 IU/mL重组IL-2。
- 加入PHA-L至终浓度为1 µg/mL，轻轻混匀，然后将150 µL细胞悬液分装至96孔U型底培养板的每孔中。
- 37 °C、5% CO₂ 条件下培养2 在湿润的环境中。
- 每天观察培养板，直至培养孔中形成较大的细胞团块（约第7天）。
- 将细胞以 1 x 106 cells/mL 新鲜培养基中。
- 通过计数（每周两次）确定总细胞数量，并将其维持在 1 x 106
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结果
本研究描述了一种在荷瘤小鼠脑内进行细胞免疫效应细胞过继转移的策略，该方法基于直接在肿瘤床内进行的立体定向注射。
为尽量降低与大体积注射相关的脑损伤风险，效应细胞悬液需要浓缩（20 × 106 个细胞置于 15–20 µL PBS 中）。为检测该细胞浓缩步骤是否可能影响效应细胞的活力，按照所述方案制备细胞并将其装入微量注射器中。在装入后立即或10分钟后收集效应细胞，并用碘化丙啶（PI）染色。PI是一种荧光DNA嵌入剂，不能穿透活细胞膜，随后在不同时间点（0、24和72小时）通过流式细胞术进行分析。结果显示，细胞的制备及装入微量注射器的过程在至少24小时内对效应细胞的活力无显著影响（图2A 和 2B）。在72小时时，观察到PI阳性细胞略有增加，但无统计学意义（14%，而未装入的细胞为11%）。类似地，对制备后在冰上保存3.......
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讨论
选择性地过继转移天然或经基因工程改造的免疫效应细胞，是一种有效治疗肿瘤（如浸润性脑癌）的有前景策略，同时有助于限制对非转化细胞的免疫反应15,16,17,18。然而，包括大脑在内的中枢神经系统具有特殊的免疫状态，这主要归因于血脑屏障的存在以及缺乏经典的淋巴引流系统19,20。这些生理特征会影响免疫细胞在组织中的迁移，可能削弱免疫细胞的全身性注射疗效。为克服这些障碍，研究人员已探索通过脑实质内注射的方式，将抗肿瘤细胞直接局部递送至肿瘤附近区域，类似于携带药物化合物的微球递送系统21,22。一方面，淋巴细胞在器官内的稀释程度较低，可能提高其抗肿瘤效率；但另.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者感谢南特大学医院动物实验中心（UTE）在动物饲养与护理方面的支持，感谢南特大学细胞与组织成像中心（MicroPICell）提供的成像技术支持，以及南特细胞计量平台（Cytocell）提供的专业技术协助。本研究由法国国家健康与医学研究院（INSERM）、法国国家科学研究中心（CNRS）、南特大学、法国国家癌症研究所（INCa#PLBio2014-155）、法国抗癌联盟（Ligue Nationale contre le Cancer，AO InterRégional 2017）以及欧洲ERA-Net Transcan2 consortium（Immunoglio）资助。研究团队还获得法国医学研究基金会（Fondation pour la Recherche Médicale，DEQ20170839118）的资助。本工作是在LabEX IGO和IHU-Cesti项目框架下完成的，上述项目由法国国家科研署“未来投资”计划（Investissements d'Avenir）支持。 通过 分别由项目ANR-11-LABX-0016-01和ANR-10-IBHU-005资助。IHU-Cesti项目还得到南特都会区和卢瓦尔河地区大区的支持。作者感谢Chirine Rafia在修改稿件过程中提供的帮助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| PBMCs | 来自3个不同健康供体 | ||
| BLCLs | 来自3个不同供体 | ||
| Roswell Park Memorial Institute培养基（RPMI） | Gibco | 31870-025 | |
| FCS | Dutscher | S1810-500 | |
| L-谷氨酰胺 | Gibco | 25030-024 | |
| 青霉素/链霉素 | Gibco | 15140-122 | |
| IL-2 | 诺华（Novartis） | proleukin | |
| PHA-L | Sigma | L4144 | |
| 立体定位仪 | Stoelting Co. | 51600 | |
| 小鼠立体定位仪适配器 | Stoelting Co. | 51624 | |
| 微量注射泵 | WPI | UMP3-4 | |
| NanoFil注射器 | WPI | NF34BV-2 | |
| NSG小鼠 | Charles River | NSGSSFE07S | |
| 氯胺酮 | Merial | Imalgène 1000 | |
| 赛拉嗪 | Bayer | Rompur 2% | |
| 剪刀 | WPI | 201758 | |
| 镊子 | WPI | 501215 | |
| OmniDrill 115/230V | WPI | 503598 | |
| Vicryl 4-0 | Ethicon | VCP397H | |
| 利多卡因 | 阿斯利康（Astrazeneca） | 3634461 |
参考文献
- Stupp, R., Roila, F. Malignant glioma: ESMO clinical recommendations for diagnosis, treatment and follow-up. Annals of Oncology. 20 Suppl 4, 126-128 (2009).
- Weller, M., Cloughesy, T., Perry, J. R., Wick, W. Standards of care for treatment of....
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重印与许可
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