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方法文章

立体定向过继性移植细胞毒性免疫细胞至原位人源多形性胶质母细胞瘤异种移植小鼠模型

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DOI：

10.3791/57870

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2018年9月1日

 ,  ,  ,  ,  , 
1INSERM, CNRS, Université d'Angers, Université de Nantes, CRCINA, 2Immunotherapy, Graft, Oncology, LabEx IGO, 3Hopital de Nantes, Hotel Dieu

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本文介绍了一种在携带原位人源性原发性脑肿瘤的免疫缺陷小鼠中，制备并进行立体定向移植同种异体人淋巴细胞的实验方案。本研究为细胞免疫疗法经颅内递送的可行性和抗肿瘤疗效提供了概念验证。

摘要

多形性胶质母细胞瘤（GBM）是成人中最常见且最具侵袭性的原发性脑癌，通常预后不良，过去十年中提出的有效疗法极为有限。在设计新型治疗策略的诸多有前景的候选方案中，细胞免疫疗法旨在清除高度侵袭性且具有化疗和放疗耐药性的肿瘤细胞，这些细胞很可能导致该癌症的快速且致命的复发。因此，在肿瘤附近施用同种异体GBM反应性免疫效应细胞（例如人Vϒ9Vδ2 T淋巴细胞），将是一种将高效且高浓度治疗剂直接递送至脑部恶性肿瘤部位的独特机会。本文介绍了一种针对携带原位人源性原发性脑肿瘤的免疫缺陷小鼠，制备并进行立体定向注射同种异体人淋巴细胞的实验方案。本研究为依赖于在脑内肿瘤区域立体定向注射同种异体人淋巴细胞的这类细胞免疫疗法的可行性及其抗肿瘤疗效提供了临床前概念验证。

引言

胶质母细胞瘤（GBM，WHO IV级星形细胞瘤）是成人中最常见且最具侵袭性的原发性脑癌。尽管采用手术联合放化疗的强化治疗手段，GBM的预后仍然极差（中位生存期为14.6个月，2年死亡率>73%）1。这表明在过去十年中，仅有少数有效的治疗进展得到验证2。在设计更有效治疗策略的诸多候选方案中3,4,5，免疫疗法6目前正被探索用于追踪并清除具有高度侵袭性且对放疗/化疗耐受的肿瘤细胞，这些细胞被认为在肿瘤快速且致命的复发过程中起关键作用7。已鉴定出多种潜在的免疫学靶点，并被提出用于免疫治疗，包括天然或经修饰的αβ或ϒδ T淋巴细胞，以及GBM特异性肿瘤抗原或应激诱导分子8,9,10。给予特定的对GBM有反应的免疫效应细胞，为将大量效应淋巴细胞直接递送至残留恶性病灶部位提供了独特机会。为支持这一策略，我们近期研究表明，基于免疫缺陷小鼠携带原位人源GBM异种移植的模型，能够真实再现GBM患者脑肿瘤的发展过程9,11。此外，这些模型已被用于证明异基因人源Vϒ9Vδ2 T淋巴细胞过继转移具有强大的抗肿瘤效应。

本方案描述了基于异基因T淋巴细胞过继转移治疗脑肿瘤（如胶质母细胞瘤，GBM）的立体定向免疫治疗中的关键实验步骤。本文介绍了：（i）治疗性异基因免疫效应T淋巴细胞（如人Vϒ9Vδ2T淋巴细胞）的扩增；（ii）效应T淋巴细胞注射前的制备；（iii）在脑内近肿瘤区域进行立体定向注射的操作流程。本文还提供了关于这些细胞效应物在立体定向注射后行为特征的深入见解。

本文所述的治疗方案基于注射 20 x 106 效应细胞 每 每只荷瘤免疫缺陷小鼠的给药剂量。初始 体外 扩增步骤是大量生产免疫细胞所必需的。因此，使用植物血凝素（PHA-L）和经照射的同种异体饲养细胞进行非特异性细胞扩增：来自健康供体的外周血单个核细胞（PBMCs）以及通过PBMCs衍生的EB病毒（EBV）转化的B淋巴母细胞样细胞系（BLCLs）。 体外 使用含EBV的Marmoset B95-8细胞系培养上清液感染，并添加1 µg/mL环孢素A。

GBM反应性效应免疫细胞的比较与筛选 体外 检测方法9。这些效应细胞根据其特性，采用标准方案进行激活和扩增（例如人Vγ9Vδ2 T淋巴细胞9 或人抗疱疹病毒αβ T淋巴细胞12) 纯度不低于 > 80%，通过流式细胞术分析常规检测确认。以下详述的细胞扩增步骤适用于多种人类淋巴细胞亚群。

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方案

涉及动物受试者的以下实验程序均按照机构指南（协议编号 #00186.02；法国卢瓦尔河地区区域伦理委员会）进行。人外周血单个核细胞（PBMCs）来自知情健康供体的血液样本（法国南特法国血液中心）。所有操作均在无菌条件下进行。

1. 细胞毒性效应T淋巴细胞的非特异性扩增

  1. 准备并以35 Gy照射饲养细胞。用于刺激2 x 105 - 4 × 105 效应细胞，准备 10 x 106 PBMCs 和 1 x 106 来自三位不同健康供体的BLCLs。
  2. 将饲养细胞和效应细胞均用15 mL RPMI重悬，RPMI中添加10%热灭活FCS、2 mM L-谷氨酰胺、青霉素（100 IU/mL）、链霉素（0.1 µg/mL）和300 IU/mL重组IL-2。
  3. 加入PHA-L至终浓度为1 µg/mL，轻轻混匀，然后将150 µL细胞悬液分装至96孔U型底培养板的每孔中。
  4. 37 °C、5% CO₂ 条件下培养2 在湿润的环境中。
  5. 每天观察培养板，直至培养孔中形成较大的细胞团块（约第7天）。
  6. 将细胞以 1 x 106 cells/mL 新鲜培养基中。
  7. 通过计数（每周两次）确定总细胞数量，并将其维持在 1 x 106 细胞/毫升的新鲜培养基。
    注意：效应免疫细胞应在静息状态下准备好用于治疗（通常在初次扩增刺激后3周）。在使用前应检测这些效应细胞的纯度和活性 体内 注射（例如，与 体外 检测方法。

2. 术前效应细胞的制备

  1. 检查效应细胞数量后，通过离心（300 × g，5 分钟）将效应细胞收集至 50 mL 离心管中。
    注意：为弥补可能的细胞损失，需准备过量细胞（例如，50 × 106）。
  2. 小心弃去上清液，用 15 mL 无菌 PBS 重悬细胞，并在 300 × g 条件下离心 5 分钟以进行洗涤。
  3. 小心且彻底地移除上清液，然后将细胞沉淀用 1 mL 无菌 PBS 重悬。
  4. 将重悬的细胞转移至 1.5 mL 微量离心管中，在 300 × g 条件下离心 5 分钟。
  5. 使用移液器缓慢地小心且彻底地移除上清液。
  6. 按每只小鼠 8 µL 无菌 PBS 重悬细胞沉淀。
    注意：此步骤至关重要。
  7. 使用微量移液器测量细胞悬液的体积；如有必要，加入无菌 PBS（每剂 20 × 106 个细胞溶于 15 µL PBS 中），并轻轻混匀。
  8. 使用微量移液器确认每只小鼠的最终体积在 15 至 20 μL 之间（必须 < 20 µL）。
  9. 将细胞置于冰上保存，直至进行立体定位注射。
    注意：未测试超过 3 小时的时间点。

3. 立体定位注射

  1. 设备设置
    1. 按照制造商的说明组装并校准小型动物立体定位仪，以确保颅内注射的准确性（例如注射器规格、所需体积和注射速率。
      注意：建议采用缓慢的输注速率（即，2 - 3 µL/min。
    2. 在微生物安全柜（MSC）中安装材料，以保持器械的无菌状态，并防止小鼠感染。
      注意：放置" 恒温模块" 在37 °C的水浴中。该系统可限制小鼠在手术期间出现低体温。在持续体温监测期间，必须使用加热垫，这是术后护理所必需的。
  2. 术前动物准备
    1. 通过腹腔注射氯胺酮（10 mg/mL）和赛拉嗪（0.1 mg/mL）对小鼠进行麻醉，剂量为每克体重10 µL。
    2. 进行脚趾捏压测试，以确认动物已完全麻醉并达到镇痛效果。
      注意：任何运动均表明未达到深度镇痛状态，若出现此情况，需再等待数分钟，方可重复操作。
    3. 小鼠充分麻醉后，使用剪刀去除手术区域（两耳之间至鼻部）的毛发。
  3. 术前细胞准备
    1. 每次注射前，用移液器轻轻重悬细胞（数次），以防止细胞聚集。
    2. 用22号微量注射器小心吸取所需的细胞悬液体积（15–20 µL），避免吸入气泡。
      注意：将细胞加载至微注射器的这一步骤至关重要，可尽量减少注射体积的差异。每次注射操作之间均需重新加载细胞，以防止细胞聚集，并确保队列中效应细胞给药数量均一。
    3. 然后，将注射器放入适配的注射泵中。
  4. 操作护理
    1. 使用浸有5%聚维酮碘溶液的棉签对术区进行消毒，至少3次。
    2. 在小鼠眼部涂抹润滑性眼膏，以防止角膜干燥。
    3. 将麻醉后的小鼠置于立体定位仪上，放置于覆盖无菌塑料膜的恒温加热板上，以维持小鼠术中体温并降低死亡率。
      注意：小鼠的鼻子和牙齿应适当地置于齿栏上方，以确保操作过程中呼吸通畅。
    4. 将小鼠置于齿栏上方后，紧固耳杆，使其位于小鼠耳朵下方，以固定头部。
      注意：操作时需小心，避免损伤耳膜或影响呼吸。
    5. 使用无菌剪刀沿颅骨上部中线从前向后做1-2厘米的矢状切口，以暴露颅骨。
    6. 确定矢状缝与冠状缝的交点（Bregma），作为注射前立体定位的解剖标志（如图所示） 图1).
    7. 将微量注射器置于该点上方。
    8. 将微量注射器移至前囟右侧2 mm、前方0.5 mm处。
    9. 使用微型钻孔器，在预定坐标处用无菌钻头于颅骨上钻出小孔。操作时需注意保持浅层钻孔，以避免对脑组织造成创伤性损伤。
      注意：在本方案中，免疫细胞被注射至已形成的肿瘤内（在肿瘤细胞注射后一周进行）。应重新切开皮肤（瘢痕处），并在先前植入肿瘤细胞时使用的相同坐标位置进行注射（注射孔通常在注射后两周内仍可存在）。所选坐标用于将肿瘤细胞和效应细胞注射至脑实质中13,14.
  5. 免疫效应细胞注射
    1. 小心地将微量注射器插入钻孔中，缓慢推进针头，使其在硬膜内向下移动3 mm，然后向上回撤0.5 mm，最终深度为2.5 mm，随后注射效应细胞。
    2. 以2-3 µL/min的速度注射效应细胞，并在注射期间持续监测小鼠状态。
    3. 注射完成后，将针头回撤1 mm，微注射器保持原位1分钟，然后缓慢完全抽出微注射器，以防止灌注部位发生渗漏。
      注意：在将动物从立体定位仪中取出后，应立即清洁注射设备，以备后续实验使用。
  6. 小鼠术后护理与随访
    1. 将动物从立体定位仪中取出，立即在切口处涂抹5%聚维酮碘溶液，并使用适当的外科缝线缝合皮肤。
    2. 在伤口处直接涂抹2%利多卡因凝胶，并通过皮下注射给予0.15 µg/g的丁丙诺啡，用于术后镇痛。
    3. 将麻醉后的小鼠放回笼中，置于设定为37 °C的加热垫上，以维持小鼠正常的体温，避免发生低体温。
      注意：无需单独饲养。
    4. 监测小鼠直至其从麻醉中完全恢复，然后将其转移至饲养室。
      注意：迄今为止，该方案已得到充分验证，因意外并发症极少发生（< 5% 的注射小鼠
    5. 每日监测小鼠，一旦观察到健康状况下降的迹象，立即实施安乐死例如、驼背姿势、活动能力下降、卧地不起或显著的体重减轻（≥ 15%）。

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结果

本研究描述了一种在荷瘤小鼠脑内进行细胞免疫效应细胞过继转移的策略，该方法基于直接在肿瘤床内进行的立体定向注射。

为尽量降低与大体积注射相关的脑损伤风险，效应细胞悬液需要浓缩（20 × 106 个细胞置于 15–20 µL PBS 中）。为检测该细胞浓缩步骤是否可能影响效应细胞的活力，按照所述方案制备细胞并将其装入微量注射器中。在装入后立即或10分钟后收集效应细胞，并用碘化丙啶（PI）染色。PI是一种荧光DNA嵌入剂，不能穿透活细胞膜，随后在不同时间点（0、24和72小时）通过流式细胞术进行分析。结果显示，细胞的制备及装入微量注射器的过程在至少24小时内对效应细胞的活力无显著影响（图2A 和 2B）。在72小时时，观察到PI阳性细胞略有增加，但无统计学意义（14%，而未装入的细胞为11%）。类似地，对制备后在冰上保存3...

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讨论

选择性地过继转移天然或经基因工程改造的免疫效应细胞，是一种有效治疗肿瘤（如浸润性脑癌）的有前景策略，同时有助于限制对非转化细胞的免疫反应15,16,17,18。然而，包括大脑在内的中枢神经系统具有特殊的免疫状态，这主要归因于血脑屏障的存在以及缺乏经典的淋巴引流系统19,20。这些生理特征会影响免疫细胞在组织中的迁移，可能削弱免疫细胞的全身性注射疗效。为克服这些障碍，研究人员已探索通过脑实质内注射的方式，将抗肿瘤细胞直接局部递送至肿瘤附近区域，类似于携带药物化合物的微球递送系统21,22。一方面，淋巴细胞在器官内的稀释程度较低，可能提高其抗肿瘤效率；但另...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者感谢南特大学医院动物实验中心（UTE）在动物饲养与护理方面的支持，感谢南特大学细胞与组织成像中心（MicroPICell）提供的成像技术支持，以及南特细胞计量平台（Cytocell）提供的专业技术协助。本研究由法国国家健康与医学研究院（INSERM）、法国国家科学研究中心（CNRS）、南特大学、法国国家癌症研究所（INCa#PLBio2014-155）、法国抗癌联盟（Ligue Nationale contre le Cancer，AO InterRégional 2017）以及欧洲ERA-Net Transcan2 consortium（Immunoglio）资助。研究团队还获得法国医学研究基金会（Fondation pour la Recherche Médicale，DEQ20170839118）的资助。本工作是在LabEX IGO和IHU-Cesti项目框架下完成的，上述项目由法国国家科研署“未来投资”计划（Investissements d'Avenir）支持。 通过 分别由项目ANR-11-LABX-0016-01和ANR-10-IBHU-005资助。IHU-Cesti项目还得到南特都会区和卢瓦尔河地区大区的支持。作者感谢Chirine Rafia在修改稿件过程中提供的帮助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
PBMCs来自3个不同健康供体
BLCLs来自3个不同供体
Roswell Park Memorial Institute培养基（RPMI）Gibco31870-025
FCSDutscherS1810-500
L-谷氨酰胺Gibco25030-024
青霉素/链霉素Gibco15140-122
IL-2诺华（Novartis）proleukin
PHA-LSigmaL4144
立体定位仪Stoelting Co.51600
小鼠立体定位仪适配器  Stoelting Co.51624
微量注射泵 WPIUMP3-4
NanoFil注射器WPINF34BV-2
NSG小鼠Charles RiverNSGSSFE07S
氯胺酮MerialImalgène 1000
赛拉嗪BayerRompur 2%
剪刀WPI201758
镊子WPI501215
OmniDrill 115/230VWPI503598
Vicryl 4-0EthiconVCP397H
利多卡因阿斯利康（Astrazeneca）3634461

参考文献

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