生物发光细菌通过多种机制调控发光，例如群体感应。该新方法能够 原位 生物发光现象的研究及光发射与细胞密度的相关性。一种人工生物发光 大肠杆菌 系统可实现对特征的表征 lux 操纵子、Lux蛋白及其相互作用。
本文内容
摘要
摘要
能够发光的细菌种类相当多。它们都具有相同的基因簇，即lux操纵子。尽管存在这一共同点，这些细菌在生长行为、发光强度或生物发光调控等方面表现出极大的差异。本文介绍的方法是一种新开发的检测技术，利用酶标仪随时间同步记录细胞生长和生物发光强度。由此获得的生长和发光特征可与相应菌株的重要特性（如群体感应调控）相关联。多种发光细菌的培养需要特定培养基（例如，人工海水培养基）和特定温度条件。相比之下，易于操作且本身不发光的标准研究用细菌大肠杆菌（Escherichia coli，E. coli）可在实验室规模下廉价地大量培养。通过将包含完整lux操纵子的质粒导入E. coli，可简化实验条件，并为未来应用开辟多种可能性。通过吉布森克隆技术构建表达质粒，将包含lux-rib操纵子中七个lux基因和三个rib基因的四个片段插入pET28a载体，实现了在E. coli表达菌株中所有lux基因的表达。通过添加异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）可诱导并调控基于E. coli的lux基因表达，从而获得具有生物发光能力的E. coli细胞。该系统的优势在于避免了群体感应调控的限制，以及复杂培养基成分和非标准培养条件（如特定温度）的需求。该系统可通过从lux操纵子中剔除特定基因，甚至引入新基因、替换不同菌株来源的luxAB基因，或分析蛋白质复合物（如luxCDE），来研究lux基因之间的相互作用。
引言
生物体发光（生物发光）是一种存在于细菌、真菌、昆虫、线虫、鱼类和鱿鱼中的引人入胜的过程1。生物发光是由化学发光反应产生的，其中化学能（部分地）转化为光能（“冷光”）。在发光细菌中，异源二聚体酶荧光素酶催化长链脂肪醛（如十四醛）的单加氧反应，生成相应的酸，并伴随最大发射波长为490 nm的光2,3。
图 1：细菌荧光素酶的一般反应机制。 细菌荧光素酶（LuxAB）利用还原型黄素单核苷酸（FMNH2）和分子氧（O2），催化长链醛（CH3(CH2)nCHO）的单加氧反应，生成长链脂肪酸（CH3(CH2)nCOOH）、黄素单核苷酸（FMN）、水（H2O），并发射波长峰值为 490 nm 的光。 请点击此处查看该图的放大版本。
该氧化过程中释放的能量产生一种处于激发态的FMN-4a-羟基化合物，其作为发光的荧光素4。参与细菌生物发光的蛋白质（即LuxCDABEG,）由lux操纵子编码，并在多种细菌菌株中高度保守2,5。luxA和luxB基因编码异源二聚体荧光素酶；luxC、luxD和luxE的基因产物是脂肪酸还原酶复合物的组分；而luxG编码黄素还原酶6。一些发光的Photobacteria（例如，Photobacterium mandapamensis 27561）携带额外的luxF基因。据报道，LuxF是一种同源二聚体蛋白，可结合一种不寻常的黄素衍生物6-(3'-(R)-十四烷基)-FMN（myrFMN）7,8,9,10,11,12。此外，已鉴定出参与核黄素合成的其他基因（例如，ribEBH），以及参与群体感应调控生物发光的调控基因，尤其在Vibrio fischeri和Vibrio harveyi中已有报道6,13。尽管基因排列顺序高度保守，发光细菌在生长行为、发光强度或生物发光调控等特性方面仍表现出显著差异2,5,14。
若干含有部分或完整序列的修饰菌株或质粒 勒克斯 已知的操纵子利用生物发光作为报告系统。各种应用包括测定启动子活性、监测环境或食品样品中的细菌污染、生物发光共振能量转移（BRET）。 体内 真核生物感染成像、焦磷酸测序等技术已建立15,16,17有趣的是，三种最常用的生物发光报告系统源自北美萤火虫（Photinus pyralis），线虫的肠道病原体（Photorhabdus luminescens），以及海仙桃（海肾（Renilla reniformis））。这些系统均非源自细菌，但其使用 勒克斯 源自细菌的基因和操纵子在应用研究中正受到越来越多的关注16细菌来源的生物发光蛋白应用较少，主要归因于源自细菌的发光蛋白稳定性较低且持续时间较短，这可能与其海洋生境有关。海洋生境中的生物发光细菌在标准实验室条件下无法培养，需要特定的培养基和培养条件，例如人工海水培养基以及较低的生长/培养温度。例如， 28 °C).
为了简化比较 lux 操纵子特征或单个 lux 多种不同发光细菌菌株的基因，一种标准化方法 勒克斯 操纵子表达与分析是前提条件。因此，整合整个 lux-rib 将操纵子导入标准研究用细菌 大肠杆菌 (E. coli) 出现。为此，Gibson 组装被证明是一种有效的工具，可将多个线性且具有重叠序列的片段整合到一个表达载体中，而无需特定的限制性酶切位点。当 DNA 插入片段过大时，该方法同样适用例如，P. mandapamensis 27561 luxCDABFEG-ribEBH; ~ 9 kb 操纵子大小）通过 PCR 扩增。A 勒克斯 操纵子可被分割为多个重叠片段，随后组装成一个表达质粒，最终可将序列验证正确的组装产物直接转化至合适的宿主中 E. coli 高产量蛋白质表达系统18,19,20此外，易于操作 E. coli 基于 lux 基因表达，一种结合细胞生长记录与生物发光光强检测的简便方法仍有待建立。本文所述方法能够实现 原位 生物发光细菌的细胞密度与发光强度的测量及相关性分析
分析 lux 基因和 lux 不同发光细菌操纵子的排列顺序及其调控，一方面与人工发光系统相结合 E. coli 包含完整的系统 lux-rib 操纵子 P. mandapamensis 27561，另一方面，一种新开发的酶标仪检测法结合了 原位 记录细胞密度和光发射，有助于获得关于各类细菌的更多信息 勒克斯 该对荧光素酶及相关酶的基础表征与比较研究，可能为已建立的报告系统提供具有更高稳定性和活性的替代方案。
方案
1. lux 操纵子在Escherichia coli中的设计、制备与表达
注意：本节所用商品化试剂盒的相关信息请参见材料表。
- 用于转移的 lux 操纵子进入 E. coli 选择一个具有合适限制性酶切位点和目标抗生素抗性基因的标准 pET 载体（例如， pET28a；NcoI，XhoI，卡那霉素
- 根据DNA序列设计用于Gibson组装的片段及重叠引物 Photobacterium mandapamensis 27561（GenBank：DQ988878.2）
- 使用设计的引物和分离的基因组DNA进行标准PCR反应 Photobacterium mandapamensis 27561 作为模板（参见 补充材料 引物和反应条件）。
注意：分离相应细菌菌株的基因组DNA可提高PCR效率。 - 通过离心柱纯化法纯化PCR产物。
- 使用 NcoI 和 XhoI 在 37 °C 对分离的 pET28a 载体进行限制性酶切消化，反应 45 分钟。
- 通过琼脂糖凝胶电泳及随后的离心柱纯化法纯化线性化载体和PCR片段。
- 测定各片段及线性化载体的 DNA 浓度，并根据实验方案计算连接反应的最佳用量20,21.
注意：组装效率取决于片段大小和数量，需根据制造商提供的方案进行调整20,21. - 将所有片段与缓冲液加入PCR管后，在PCR仪中于50 °C孵育反应体系1小时。
- 根据标准转化方案转化组装好的载体产物 E. coli 将细菌质粒转化至合适的宿主中 E. coli 用于高产量质粒复制的系统（例如，E. coli TOP10 或 XL-1
- 从转化平板上挑取菌落，并在新的平板上划线以进行DNA分离。
- 根据标准方案提取质粒DNA。
- 为验证包含所有片段的质粒是否正确组装，首先使用针对每个组装片段的特异性引物，按照标准操作流程进行菌落PCR。
- 除了菌落PCR及随后的琼脂糖凝胶电泳外，还需将所有分离得到的组装载体进行DNA测序，以验证正确的组装结果和正确的DNA序列。
- 根据标准的质粒转化方案进行已验证质粒的转化 E. coli 将细菌质粒转化至合适的宿主中 E. coli 用于高产量蛋白质生产的系统（例如，E. coli BL21
注意：请继续执行下方的表达方案。如需长期保存，建议制备甘油菌种。
2. 修饰基因的表达 E. coli 菌株
- 通过将之前制备的含有重组质粒的 E. coli BL21 感受态细胞甘油菌（或直接从转化平板）接种至适量体积的 LB 培养基（例如，100 mL）中，制备过夜培养物（ONC）。加入 100 µL 卡那霉素（50 mg/mL；pET28a 质粒的抗生素抗性基因），并将 ONC 置于 37 °C、120 rpm 条件下的摇床中培养过夜。
- 取 8 mL ONC 接种至主表达培养液（例如，800 mL LB 培养基）中，并加入 800 µL 卡那霉素（50 mg/mL）。
- 将主培养物置于 37 °C、120 rpm 的摇床中培养，直至菌液在 600 nm 处的光密度（OD600）达到 0.6–0.8（约 2.5 小时）。
- 将培养温度降至 28 °C。
- 加入 IPTG 至终浓度为 0.1 mM，以诱导蛋白表达。
注意：经验性测试表明，将温度降低至 28 °C 时发光强度最高。 - 观察细胞，直至其开始发光（约 1 小时）。
注意：根据表达目的的不同，可继续培养细胞至次日再进行收集，或在细胞持续发光期间保持振荡培养（最长 48 小时）。细胞的收集及任何目标蛋白的纯化均可按照标准操作流程进行。
3. 细菌生物发光菌株的表达
注意：细菌发光菌株需要特定的培养基/人工海水培养基以供生长和发光。
- 制备人工海水培养基，该培养基由两种分别配制的组分组成。
注意：人工海水培养基的配制方法参考自原始方案22。以下用量适用于1 L液体培养基或1 L琼脂培养基。- 配制人工海水培养基时，称取以下盐类：28.13 g NaCl、0.77 g KCl、1.60 g CaCl2 · 2H2O、4.80 g MgCl2 · 6H2O、0.11 g NaHCO3 和 3.50 g MgSO4 · 7H2O。
- 加入1 L蒸馏水，溶解所有组分。
- 配制LB培养基时，称取以下成分：10 g酵母提取物、10 g蛋白胨；若制备琼脂平板，则额外加入 20 g琼脂。
- 加入250 mL自来水，溶解各组分。
- 将两种配制好的培养基分别在121 °C条件下高压灭菌20分钟。
- 制备琼脂平板时，在高压灭菌后立即混合250 mL LB培养基与750 mL人工海水培养基，并制备平板。
- 配制液体培养基时，可在高压灭菌后立即或冷却后，将250 mL LB培养基与750 mL人工海水培养基混合。
注意：人工海水培养基可能因 盐类析出而变得浑浊。
- 将发光细菌菌株划线接种于人工海水培养基琼脂平板上，在24 - 30 °C条件下过夜培养。
注意：细菌菌株的长期保存通常通过冷冻保存含甘油的菌种实现。由于解冻后细菌生长存在延滞期，在用于液体培养前，应先将菌株划线接种于琼脂平板上，以确保所有菌株具有均一的 起始培养状态。 - 取平板上的单菌落接种至100 mL人工海水培养基中，制备过夜培养物（ONC）。将ONC置于24 - 30 °C、120 rpm的摇床中过夜培养。
- 用8 mL ONC接种800 mL人工海水培养基。
- 将细菌在24 - 30 °C、120 rpm条件下于摇床中培养。
注意：发光细菌的发光强度随温度变化显著。根据特定菌株发光调控机制的不同，发光通常在接种后约1 - 6小时开始。 - 观察细菌培养物 ，直至其开始发光（约1 - 6小时）。
注意：根据实验目的，可继续培养至次日收获细胞，或持续振荡培养至发光停止。收获细胞及后续蛋白纯化可按照标准操作流程进行。
4. 体内 细菌生物发光菌株及其改良株的活性检测实验 E. coli 菌株
注意：菌株的长期保存通常通过冷冻保存细菌培养物的甘油菌种来实现 。由于解冻后菌株生长存在滞后期，在用于液体培养之前，应始终先将菌株划线接种于琼脂平板上，以确保所有菌株具有均一的 起始生长条件。
- 将目标发光细菌菌株或改造后的 E. coli 菌株划线接种至琼脂平板，于 28 °C 培养过夜。
注意：不同菌株的培养温度可能有所差异，需通过实验经验确定。为能够比较不同发光细菌菌株或改造 E. coli 菌株，必须保持一致的培养条件。 - 从琼脂平板上挑取单菌落，接种至 3 mL 培养基中，在 28 °C、180 rpm 条件下于摇床中培养约 1 - 2 小时。
- 测定液体培养物 1:10 稀释液在 650 nm 处的菌液密度。计算获得 OD650 为 0.05 的 1 mL 培养液体积所需的稀释比例和体积。
注意：后续的酶标仪检测将在 650 nm 处测定菌液密度，以避免菌株发光对吸光度读数的干扰。 - 将计算所得体积的菌液和培养基加入至底部为玻璃、侧壁为黑色的 24 孔板中。对于改造的 E. coli 菌株，向样品中加入 1 µL 卡那霉素（pET28a 载体的抗生素抗性）和 1 µL IPTG（诱导基因表达）。盖上盖子，以防止测量过程中液体蒸发。
注意：为确保含有完整 lux 操纵子的 pET28a 载体不会在 E. coli 培养过程中丢失，必须在每孔的 E. coli 样品中添加卡那霉素；同时，为确保可检测到 E. coli 细胞的发光，必须使用 IPTG 诱导基因表达。为避免信号串扰和测量干扰，推荐使用侧壁为黑色、底部为玻璃、盖子透明的孔板，此类孔板表现最佳。尽管如此，仍可能存在信号串扰，因此需谨慎选择孔位布局。 - 在酶标仪中开始检测。
注意：酶标仪检测程序基于为此实验专门开发的脚本（见 补充材料），该程序整合了吸光度与生物发光两项检测。每 10 分钟采集一次数据，检测间期持续振荡，并保持 28 °C 恒温。
结果
基因的排列顺序 勒克斯 操纵子 luxCDABFEG - 在不同菌株中高度保守2,5,14质粒设计所用的序列信息来源于生物发光细菌菌株 Photobacterium mandapamensis 27561，其基因顺序保持不变，同时考虑了单个基因之间的非编码序列。所采用的Gibson克隆策略的示意图如下所示 图2共四个片段， luxCDAB, luxF, luxEG, 和 ribEBH，生成了具有20-40个碱基对重叠序列的片段。在完成Gibson组装的全部步骤后20DNA测序证实质粒正确组装，包含所有片段。最终组装产物pET28a的载体图谱 lux-rib 操纵子被描绘在 图3该改良型pET28a载体的一个显著优势在于采用了标准化的 E. coli 生长条件及通过IPTG进行的诱导控制。
为测量发光细菌的发光强度及相应的细胞密度，开发了一种基于酶标仪的方法。该酶标仪方法通过整合光强度和细胞密度的单项测量程序而建立。这一新型程序实现了OD的同步测量650 每10分钟记录一次光强度，持续时间为用户自定义的时间范围，该时间范围需根据所用细菌在相应分析中的世代时间进行调整（例如， 10 小时）。为避免光发射的干扰，光密度在 650 nm 处进行测量。作为概念验证，并确保细胞的健康状态及正常生长行为 E. coli 细胞，进行了参考测量。在 图4 比较 E. coli BL21细胞， E. coli 含有空pET28a质粒的BL21细胞，以及 E. coli 含有pET28a载体的BL21细胞 lux-rib 操纵子插入的结果已展示。对于后者菌株，未添加IPTG，以分析T7启动子渗漏导致的发光现象。三种参考测量均显示出具有三个生长期（延滞期、指数期和稳定期）的S形生长曲线。仅 E. coli 含有pET28a载体的BL21细胞 lux-rib 操纵子插入后开始发光，但与通过添加IPTG诱导表达、30分钟后即发光的测量结果相比，未诱导的细胞约5小时后才开始发光，且发光强度远低于诱导系统（约低4倍）。
图5 比较了生长曲线和光强度的 勒克斯 操纵子表达于 E. coli 以及生物发光细菌菌株 P. mandapamensis 27561，无论是在LB培养基还是人工海水中，使用新建立的 原位 方法。为比较这些细菌，在培养温度下进行测量 28 °C该温度降低了经修饰的微生物的生长速率 E. coli 在LB培养基和人工海水中进行培养时，对于发光细菌菌株而言，较低的温度至关重要。这种温度依赖性在下文中可见。 图5A，作为 P. mandapamensis 27561 的细胞密度明显高于 E. coli此外，尽管对于 E. coli 菌株，LB培养基可支持更高的细胞密度；对于天然发光的细菌菌株，人工海水培养基更适宜，且对发光至关重要。所记录的细胞密度与相应的光强度呈正相关，如图所示 图5B值得注意的是，该生物发光 E. coli 细胞在LB培养基和人工海水中均能达到相似的发光强度峰值，尽管最高强度出现在不同的时间点。与此观察结果相反的是， P. mandapamensis 27561 在 LB 培养基中具有活力，但生长速率显著降低，且细菌细胞完全不发光。图5B）。在人工海水培养基中， P. mandapamensis 27561 在约 1 x 10 处显示出最大光发射4 每秒计数，比原始值低近200倍 E. coli. 图5C 表示将生物发光值按OD归一化后的相对发光单位。这些结果证实，不仅含有质粒的插入 lux 操纵子进入 E. coli 成功且具有功能，还表明这种修饰后的 E. coli 该菌株是一种有效的替代选择，具有更高的发光产率，且不受海洋细菌生物发光的限制，例如复杂的海水培养基和较低温度等条件限制。
此外，对长期测量的 E. coli 基于 lux-rib 24 小时内的基因表达用于分析发光的持续时间（图6）。发光持续了19.5小时，远长于细菌菌株的发光时间（例如，P. mandapamensis 27561），其中观察到光信号逐渐减弱，10小时后光发射极低。
为说明所开发检测方法的局限性， 图7 显示了三种生物发光细菌菌株的测量结果，即 Photobacterium mandapamensis S1, Photobacterium mandapamensis TH1 和 Vibrio harveyi 14126. 对于第一种菌株（S1），该方法效果非常好，显示出接近 2 x 10 的最大生物发光强度6对于另外两个菌株（TH1 和 14126），由于二者产生的光强度均超过了所用仪器设置的检测限，因此无法确定其最大光强。为所开发方法（脚本）中这两个菌株设定的增益值过高。尽管如此，仍可相互比较其生物发光活性的起始时间。 P. mandapamensis TH1 和 P. mandapamensis S1 在约 1 h 后开始发光，且 OD650 分别为 0.1 - 0.2 时。相比之下， V. harveyi 14126 在 OD 约 5.5 h 后开始发光650 1.0。观察到的发光起始伴随着光密度（OD）和生物发光的指数级增长。已知生物发光的 V. harveyi 14126 是群体感应调控的基础，因此需要特定的细胞密度才能启动激活 勒克斯 操纵子，可在其中清晰观察到 图713这一结果表明，通过这种新型方法 原位 使用酶标仪检测，可轻松比较不同发光细菌，并通过确定是否存在群体感应调控，初步界定这些菌株的调控机制。
图8 展示了在IPTG诱导后，携带组装型pET28a质粒（含lux操纵子）的E. coli BL21细胞表达培养的一个示例。诱导约1 h后，E. coli细胞开始发出蓝绿色光。 图8A 显示了在光照下拍摄的E. coli表达培养物，图8B 为同一培养物在黑暗中的图像。图8C 展示了人工海水培养基琼脂平板上黑暗环境中发出蓝绿色光的P. mandapamensis S1，该颜色为细菌生物发光的典型特征。
图 2：Gibson 克隆策略的示意图。步骤（I）：设计重叠引物（彩色箭头；重叠区域约 20 - 40 个碱基对）。重叠引物包含退火序列，分别来自一个片段的 5' 和 3' 区域以及相邻片段的 3' 和 5' 区域。 步骤（II）：通过标准 PCR 反应扩增获得用于组装的各个片段。 步骤（III）：通过限制性酶切（例如，NcoI, XhoI）将目标载体线性化。 步骤（IV）：需测定所有片段及线性化载体的 DNA 浓度，以调整至适合 Gibson 连接反应的浓度（依据试剂盒生产商的操作说明）。 步骤（V）：将具有优化 DNA 浓度的所有片段与线性化载体加入 Gibson 连接主混合液（T5 核酸外切酶、DNA 聚合酶和 DNA 连接酶）中，于 50 °C 孵育 1 小时。 步骤（VI）：按照标准操作流程，将连接产物转化至适合高拷贝质粒复制的 E. coli 菌株中（例如，E. coli TOP10 或 XL-1）。 步骤（VII）：为验证质粒组装的正确性，需对组装后的质粒进行 DNA 测序。 请点击此处查看该图的高清版本。
图 3：含有 lux-rib 操纵子的 pET28a 载体图谱。 P. mandapamensis 27561 的 lux-rib 操纵子以原始基因顺序（luxCDABFEG-ribEBH）插入 pET28a 的多克隆位点。用于克隆的限制性酶切位点为 NcoI 和 XhoI。用于 Gibson 组装的片段分别为：橙色的 luxCDAB、绿色的 luxF、蓝色的 luxEG 和淡紫色的 ribEBH；同一片段内的各个基因以独立的方框表示。克隆策略中包含了操纵子各基因之间的非编码序列。包含完整 lux-rib 操纵子的最终 pET28a 质粒大小为 14,625 个碱基对。请点击此处查看该图的放大版本。
图 4： 参考菌株生长曲线与发光强度的比较。 在28 °C条件下，每10分钟测定一次650 nm处的光密度（OD）和以每秒计数表示的生物发光强度，持续10小时。所有测量数据均为三个生物学重复的平均值，每个生物学重复包含四个技术重复。误差线表示标准偏差。E. coli BL21细胞（灰色方块）、含空pET28a载体的E. coli BL21细胞（灰色圆圈）以及含带有lux-rib操纵子插入片段的pET28a载体的E. coli BL21细胞（黑色菱形）被用于分析，以确认本实验所用E. coli细胞具有正常的生长行为。请点击此处查看该图的放大版本。
图5：生长曲线与光强的比较 勒克斯 操纵子表达于 E. coli （正方形）和 P. mandapamensis 27561（圆圈）在LB培养基（空心符号）或人工海水培养基（实心符号）中。 所有测量值均为三个生物学重复（每个生物学重复包含四个技术重复）的平均值。误差线表示标准偏差。所有实验均在孵育温度为 28 °C. （A） 在650 nm处每10分钟进行一次光密度（OD）测量，持续10小时。 大肠杆菌 lux 操纵子表达（左图）与 P. mandapamensis 在LB培养基和人工海水培养基中测定27561（右图）的细胞密度，测定波长为650 nm，以避免生物发光干扰。 （B） 每10分钟测量一次光强度（生物发光，[计数/秒]），持续10小时。 大肠杆菌 lux 操纵子表达（左图）与 P. mandapamensis 27561（右图）在LB培养基和人工海水培养基中的生长情况。 （C） 相对光强度（RLU/OD）的 勒克斯 操纵子表达于 E. coli （左侧面板）和 P. mandapamensis 27561（右侧面板）通过将生物发光归一化至细胞密度来确定。 请点击此处以查看此图的放大版本。
图6：大肠杆菌（E. coli）基于lux基因表达的生长曲线与发光强度在24小时内的比较。 在28 °C条件下，每10分钟测定一次650 nm处的光密度（OD）和以每秒计数表示的生物发光强度，持续24小时。所有测量值均为三个生物学重复（每个含四个技术重复）的平均值。误差线代表标准偏差。此外，还展示了相对发光强度（RLU/OD），即生物发光信号经细胞密度归一化后的结果。请点击此处查看该图的高清版本。
图7：比较生物发光细菌以评估潜在的群体感应调控。 每10分钟测量一次光发射和细胞密度，持续10小时，数据代表三次生物学重复（每次包含四次技术重复）的平均值。误差线表示标准差。Photobacterium mandapamensis TH1（黑色方块）、Vibrio harveyi 14126（灰色圆形）和Photobacterium mandapamensis S1（灰色菱形）的测量结果相互比较；(A) 显示650 nm处的光密度（OD），(B) 显示光强度（生物发光[计数/秒]），(C) 显示相对光强度（RLU/OD）。请点击此处查看此图的放大版本。
图 8：液体培养基和琼脂平板上的生物发光。（A） 接种了表达 pET28a lux 操纵子质粒的 E. coli BL21 细胞的 5 L 锥形瓶，内含 2 L LB 培养基，在光照条件下拍摄。（B） 与（A）相同的培养物在黑暗中拍摄。图片 A 和 B 均在诱导表达约 2 小时后拍摄。（C） 在黑暗中拍摄的人工海水培养基琼脂平板，上面划线接种了 P. mandapamensis S1 菌株。请点击此处查看该图的放大版本。
讨论
通过吉布森克隆技术，构建了包含四个片段的表达质粒，这些片段组成了 P. mandapamensis 27561 完整的 lux-rib 操纵子。该基于 E. coli 的 lux 基因表达系统可使 E. coli 细胞发光。该系统具有避免群体感应调控和无需非标准培养条件的重要优势。
采用Gibson克隆策略的优势在于能够简便地组装多个线性DNA片段，具有高度灵活性，且无需特定的限制性酶切位点18,19,20。该方法可轻松更换lux操纵子，例如剔除单个基因或基因簇，或引入新基因，或将一种菌株的基因替换为另一种菌株的相应基因。应用该方法的前提是必须已知并可获取相应的lux操纵子基因序列。目前仅有少数发光细菌的lux操纵子完整DNA序列被明确并公开。许多序列仍处于片段化状态，原因是采用鸟枪法测序获得。对于本研究中的P. mandapamensis 27561菌株，其lux操纵子的完整DNA序列已知，并可在NCBI基因数据库中获取（GenBank: DQ988878.2）。
Gibson 组装实验方案中的一个关键步骤是计算单个 DNA 片段的浓度。根据生产商的组装方案建议，对于 4 至 6 个片段，应使用 0.2 - 0.5 pmol 的量，总体积为 20 µL20,21。而在我们的实验中，luxCDABFEG-ribEBH 由 4 个片段组成，所用浓度和总体积分别为 0.1 pmol 和 45 µL，具体数值取决于 PCR 产物的得率。一方面需要降低片段浓度，另一方面则需增加反应体积。尽管如此，组装反应仍取得了良好效果，DNA 测序结果在首次尝试中即确认了正确的插入序列。该结果证实 Gibson 组装是一种稳健且适用于本研究的可靠方法，且易于进行优化调整18,19,20。
新建立的酶标仪检测方法操作简便，可对新发现或已知/未知的生物发光细菌菌株进行初步分析，并能初步提示发光机制的调控方式例如， 在低细胞密度下，发光存在延迟。此外，通过简单地更换培养基或改变温度，即可轻松评估生长条件与发光之间的关系。
使用酶标仪进行测量时的温度设置为 28 °C。采用这一非常规设置的原因在于生物发光细菌菌株对温度敏感，当温度高于 30 °C 时，会导致生长减弱甚至完全停止，和/或发光减弱或完全消失。需要注意的是，酶标仪能够在测量过程中维持设定的温度，但其局限性在于缺乏主动冷却系统。因此，环境温度必须低于测量温度。
作为概念验证，一方面将大肠杆菌（E. coli）构建体与生物发光菌株P. mandapamensis进行比较（图5），另一方面与参考测量结果进行对比（图4），实验结果证实了该新建立系统的可靠性。此外，长期测量验证了发光信号的持久性（图6）。但需要注意的是，光密度（OD）值在超过某一特定光学密度后将不再可靠，具体数值取决于所用测量设备的特性（本实验中约为15小时），此时需对样品进行适当稀释，以使其处于检测器的线性响应范围内。这些较高的OD值变异使得长时间测量结果不可靠。因此，建议采用本文所述的实验装置进行较短时间的测量，例如10小时。
已建立的酶标仪检测方法的局限性可见于 图7。难点在于找到合适的测量设置。‘增益值’用于调节光电倍增管（PMT）的灵敏度。增益是指PMT中信号的放大倍数，意味着增益因子越高，信号越强。如果增益设置过低，信噪比会增大，光强度的 "低" 发光的生物发光细菌已无法再被检测到（信号接近零，数据未显示）。生物发光检测中的挑战在于设定增益值，以确保所有细菌菌株的测量结果均处于仪器的检测范围内。此外，发光信号的检测范围还取决于测量时间间隔例如， 最大值为每秒 2,000,000。
增益设置为2800，该值是通过经验测试并针对本方法所使用的特定酶标仪选定的。该增益设置可在不发生溢出的情况下，记录生物发光大肠杆菌（E. coli）系统、P. mandapamensis 27561 和 P. mandapamensis S1 的最大发射光强；但对于 P. mandapamensis TH1 和 V. harveyi 14126 菌株而言，此增益过高。因此，这些菌株的信号超出检测限，无法测得真实的最大光强。这一技术限制可能妨碍对最大发光强度差异较大的生物发光细菌进行比较，即使它们的生长条件和细胞密度具有可比性。
分析所用细菌菌株在孔板中的排布位置需通过实验经验确定。尽管使用了带玻璃底的黑色孔板，但仍观察到样品之间存在串扰现象。某些菌株的发光强度极高，会导致所有相邻孔出现假阳性发光信号（例如空白孔）。因此，重要的是将两种不同的菌株分别测量，或在空间上保持一定距离进行排布。
目前已知的多种改造大肠杆菌（E. coli）菌株均携带部分lux操纵子，且主要面向应用研究15,16,17。本文所述方法则侧重于基础研究，例如可独立分析每一个lux基因的可能性。尽管生物发光研究已有悠久历史，但仍存在诸多未解问题。通过在易于操作的E. coli系统中，剔除或引入lux操纵子中的基因、将luxAB基因替换为其他菌株的同源基因，或分析蛋白质复合物，并进一步结合酶标仪检测方法，有望获得关于lux基因调控机制及其功能的更多信息。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们感谢 Wladislaw Maier（BMG Labtech GmbH）在建立酶标仪自编脚本过程中提供的支持。本研究工作由奥地利"Fonds zur Förderung der wissenschaftlichen Forschung"（FWF）向 PM 提供的项目（P24189）以及向 PM 提供的博士培养项目"DK Molecular Enzymology"（W901）资助。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| NEBuilder 高保真 DNA 组装克隆试剂盒 | New England Biolabs Inc. | E2621S | 适用于 10 次反应 dx.doi.org/10.17504/protocols.io.cwaxad |
| Phusion 聚合酶 | Thermo Scientific | F530S | |
| Q5 高保真 DNA 聚合酶 | New England Biolabs Inc. | M0491S | |
| GeneJet 基因组 DNA 纯化试剂盒 | Thermo Scientific | K0721 | 适用于 50 次反应 |
| 限制性内切酶及缓冲液（NcoI, XhoI） | New England Biolabs Inc. | R3193S/R0146S | |
| Wizard SV 凝胶及 PCR 产物纯化试剂盒 | Promega | A9282 | 适用于 250 次反应 |
| Monarch DNA 凝胶回收试剂盒 | New England Biolabs Inc. | #T1020S | 适用于 50 次反应 |
| GeneJet 质粒小量提取试剂盒 | Thermo Scientific | K0503 | 适用于 250 次反应 |
| GoTaq G2 DNA 聚合酶 | Promega | M7841 | |
| 24 孔黑色带玻璃底板的微孔板 | Greiner Bio One | 662892 | |
| FLUOStar Omega 微孔板检测仪 | BMG Labtech | ||
| OPTIMA/Mars 分析软件 | BMG Labtech | 版本 2.20 | |
| Microsoft Excel 2010 | Microsoft | ||
| Multitron Standard 恒温振荡培养箱 | Infors AG |
参考文献
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