通过绿色荧光蛋白标记与4',6-二脒基-2-苯基吲哚染色检测蛋白质亚细胞定位 秀丽隐杆线虫

摘要

本实验方案演示了如何利用绿色荧光蛋白（GFP）融合蛋白作为标记，并结合4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色，在热应激条件下追踪蛋白质的核转位过程。DAPI染色步骤快速，且能有效保留GFP及蛋白质亚细胞定位信号。

摘要

在本实验方案中，通过绿色荧光蛋白（GFP）融合蛋白与4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色来追踪蛋白质亚细胞定位的变化，特别是热应激条件下发生的核转位。蛋白质会对外部和内部信号作出相应反应，其中一种常见机制是改变其亚细胞定位。本文介绍了一种无需使用抗体、放射性标记或共聚焦显微镜即可追踪蛋白质定位的实验方法。在本研究中，使用GFP标记线虫（C. elegans）中的目标蛋白EXL-1，该蛋白属于细胞内氯离子通道蛋白（CLICs）家族，与哺乳动物的CLIC4同源。通过转化和γ射线辐照构建了包含启动子和完整基因序列的稳定整合型翻译融合exl-1::gfp转基因品系，可稳定表达该基因及gfp。近期研究表明，在热应激而非氧化应激条件下，EXL-1::GFP会在细胞核中积累。通过将GFP信号与细胞核结构以及DAPI信号进行共定位，可确认EXL-1在应激状态下的亚细胞定位变化。本方案提供了两种不同的DAPI染色固定方法：乙醇固定和丙酮固定。本文所述的DAPI染色方法快速高效，能够同时保留GFP荧光信号和蛋白质的亚细胞定位变化。该方法仅需配备微分干涉相差（Nomarski）光学系统、FITC滤光片和DAPI滤光片的荧光显微镜，适用于小型实验室、本科生科研、高中生科研以及生物技术课程教学。

引言

蛋白质亚细胞定位的改变是响应内部或外部信号（如热应激、饥饿、氧化应激、细胞凋亡、蛋白质磷酸化等）的常见机制。例如，热应激可诱导FOXO家族成员DAF-16发生核转位^1,2，而促凋亡BCL-2蛋白BID在接收到死亡信号后会转位至线粒体^3,4。目前已有多种技术可用于检测这些变化。结合蛋白质印迹（western blotting）与亚细胞结构（例如，线粒体或细胞核）的生化分离方法可有效实现该目的³。然而，该方法需要针对目标蛋白的特异性抗体，因此高质量且经过验证的抗体成为实验成功的关键。另一种方法是利用绿色荧光蛋白（GFP）、红色荧光蛋白（RFP）、黄色荧光蛋白（YFP）和mCherry等标记不同的亚细胞结构或细胞器，同时用其他标记物标记目标蛋白，然后通过共聚焦显微镜观察以确定其定位^5,6。放射性同位素也可用于标记目标蛋白，进而检测其亚细胞定位⁷，但该方法需要专业培训以及对放射性废物的妥善处理。在缺乏特异性抗体、合适标记物或共聚焦显微镜等设备的情况下，需要考虑替代方案。为鉴定蛋白质的核转位，一种具有吸引力的方法是仅用标记物标记目标蛋白，并使用化学试剂4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）对细胞核进行染色，因为此方法仅需普通的荧光显微镜即可完成。

由于卵壳或包裹在线虫体表的胶原蛋白角质层通透性较低，使用抗体对 C. elegans 进行免疫标记具有较大挑战性。同时，由于 C. elegans 蛋白质与其脊椎动物同源蛋白差异显著，仅有少数商业公司提供针对 C. elegans 的特异性产品。小型实验室自行制备 C. elegans 抗体也十分困难。因此，研究者通常使用带标签的蛋白作为标记物，以展示蛋白定位或基因表达情况。本文以 EXL-1::GFP 为例，追踪在热应激条件下蛋白的核转位过程⁸。通过将翻译融合型 exl-1::gfp 整合至线虫基因组中，实现 gfp 融合基因的稳定表达。研究表明，exl-1 在肠道、体壁肌及其他亚细胞结构中均有表达⁸。本实验方案详细介绍了如何将线虫同步至第四龄幼虫（L4）阶段，进行热应激实验，并完成 DAPI 染色、乙醇固定、丙酮固定以及在常规荧光显微镜下的成像操作。

方案

1. 溶液

1. NGM 平板
   1. 在2 L的锥形瓶中，加入3 g NaCl、17 g琼脂、2.5 g蛋白胨和975 mL dH₂O₂O. 用铝箔封住烧瓶口，高压灭菌50分钟，冷却20–30分钟。
   2. 然后加入灭菌溶液：1 mL 1 M CaCl₂，1 mL 5 mg/mL 胆固醇乙醇溶液，1 mL 1 M MgSO₄₄，以及25 mL 1 M KPO₄ （pH 6.0）缓冲液。轻轻摇动溶液使其充分混匀。
   3. 使用液体分配器将NGM溶液分装至60 mm培养皿中，加入琼脂至培养皿容量的2/3。将培养皿密封存放于4 °C环境中，以备后续使用。
2. 1 M KPO₄ 缓冲液（pH 6.0）
   1. 溶解 10.83 g KH₂PO₄ 和 3.56 g 的 K₂HPO₄ 在 dH₂O 中₂O，然后将总体积调至100 mL。将溶液高压灭菌15分钟。
3. M9
   1. 溶解3 g KH₂PO_4, 6 g Na₂HPO₄，以及5 g NaCl溶于dH₂O中₂O，加入1 mL 1 M MgSO₄₄，并将总体积调至1 L。
4. 10 µg/mL DAPI
   1. 将1 µL的10 mg/mL DAPI加入999 µL的dH₂O中₂O.
5. 95% 乙醇（v/v）
   1. 量取95 mL的100%酒精，加入蒸馏水定容至100 mL。
6. 30% 丙酮（v/v）
   1. 加入 30 mL 丙酮至 dH₂O 中₂O，并调整总体积至100 mL。

2. 热应激

1. 构建含有目标基因翻译融合构建体的染色体外阵列品系^9,10。或者，可从秀丽隐杆线虫遗传中心（Caenorhabditis Genetics Center, CGC）——一个面向 C. elegans 研究的公共资源库——或先前已发表的研究实验室获取此类品系。
2. 通过将线虫暴露于3,800 Rad的γ射线辐射，将染色体外阵列品系整合到基因组中⁹。随后筛选稳定表达的品系，确保每条线虫均表达一种标记蛋白，如GFP或Roller表型。
3. 为消除辐射过程中可能产生的突变，至少进行两次回交。使用该转基因品系检测在胁迫条件下蛋白表达模式的变化。
4. 按步骤1.1所述制备NGM线虫培养板。挑取OP50菌落并在液体LB培养基中过夜培养。将液体OP50培养物接种至NGM平板上，于37 °C培养箱中过夜培养以形成细菌菌苔，作为线虫的食物来源。使用前将平板在室温下冷却至少30分钟。
5. 在进行热激实验前，将转基因品系在20 °C条件下无饥饿培养至少两代。
6. 挑选8–10只年轻产卵期成虫（子宫内充满卵）转移至新的线虫培养板，让其产卵约3–5小时，随后移除所有成虫。
7. 为实现线虫同步化，让卵孵化并培养幼虫约48小时至四龄幼虫（L4）阶段。通过观察其阴门结构（半月形结构）来确认L4阶段（图1，箭头所示）¹¹。
8. 将含有L4幼虫的线虫培养板置于35 °C培养箱中2–5小时，以实现热激处理。在培养箱内放置温度计以准确监测温度。

3. DAPI 染色

1. 乙醇固定
   1. 在玻璃载片中央加入 10 µL M9 缓冲液。
   2. 从步骤 2.8 中挑取热激后的线虫，放入玻璃载片上的 M9 缓冲液中。
      1. 或者，用 M9 缓冲液冲洗培养皿，室温下以 1,000 × g 离心 1 分钟，弃去上清液，将线虫转移至玻璃载片。
   3. 用柔软的纸巾吸去多余液体，在解剖显微镜下观察此步骤。
   4. 在线虫上加入 10 µL 95% 乙醇，使其自然干燥。在解剖显微镜下观察该过程，注意不要让样品过于干燥。乙醇挥发后立即进行下一步操作。
      注意：乙醇挥发非常迅速。
   5. 重复步骤 3.1.4 两次，以完成线虫的固定。
      注意：线虫颜色变深并出现形变是正常现象。
   6. 向线虫中加入 10 µL DAPI（10 µg/mL），立即加盖盖玻片，并用透明指甲油密封载片。
   7. 约 10 分钟后在荧光显微镜下观察样品。
2. 丙酮固定（替代方法）
   1. 用 M9 缓冲液冲洗步骤 2.8 中的热激培养皿，室温下以 1,000 × g 离心 1 分钟，弃去上清液。用 1 mL dH₂O 洗涤沉淀，收集沉淀后弃去上清液。
   2. 加入 400 µL 30% 丙酮，作用 15 分钟。室温下以 1,000 × g 离心 1 分钟，弃去上清液。用 500 µL dH₂O 洗涤样品两次，每次均弃去上清液。
   3. 在离心管中加入 200 µL DAPI（10 µg/mL），或加入总体积为线虫体积 4 倍的 DAPI，染色 15 分钟。
   4. 以 1,000 × g 离心 1 分钟，弃去上清液。用 500 µL dH₂O 洗涤沉淀两次。将线虫转移至玻璃载片，加盖盖玻片，用透明指甲油密封载片，然后在荧光显微镜下观察样品。

4. 显微成像

1. 打开紫外光源和荧光显微镜，启动与显微镜连接的计算机。
2. 将载玻片放置在荧光显微镜上。使用低倍物镜（10X）定位线虫，然后将放大倍数调至400X，并对样本进行聚焦。
3. 打开显微镜配套的软件。在菜单中点击"Acquisition"，然后点击"Camera"并选择与显微镜连接的相机；此操作可使所选相机与软件建立通信。
   注意：不同型号的显微镜操作可能有所差异。
4. 在同一"Acquisition"菜单下，点击"Multidimensional Acquisition"。这将打开一个新的"Multidimensional Acquisition"导航窗口。点击"Multichannel"按钮，所有可用通道将显示出来。
5. 选择蓝色、绿色和DIC（微分干涉差）通道以观察样本。在"Multidimensional acquisition"导航窗口中，保留"Blue-DAPI"、"Green-GFP"和"Grey-DIC"、"Nomarski"通道开启；右键单击其他通道（如"Red-rhodamine"和"White-bright field"）将其关闭。
6. 首先，测量每个通道的曝光时间：
   1. 左键单击"Blue-DAPI"通道以选中它，然后点击"Measure"，以在DAPI通道下自动设定曝光时间并获取实时图像。一个新的实时图像窗口将出现。
   2. 在实时图像窗口的左侧，根据需要手动调整曝光时间，以获得理想的图像效果。
   3. 最后，在实时图像窗口中点击"OK"。这将设定DAPI通道下的曝光时间。
7. 对其他通道"Green-GFP"和"Grey-DIC"、"Nomarski"重复步骤4.6，以设定这些通道的曝光时间。
8. 在"Multidimensional acquisition"导航窗口中，点击"Start"，系统将按照上述设定的曝光时间，依次自动采集三个不同通道下的三幅图像。
9. 为保存文件，请进入主菜单，点击"File"，然后点击"Save as"。输入文件名和文件夹名称。将文件保存为默认格式，以保留详细的成像信息供将来参考。
10. 以其他格式导出文件：
    1. 进入"File"，点击"Export"。这将打开导出设置窗口。
    2. 设置文件名和文件夹。勾选"Create a project folder"以更好地组织数据。软件还允许用户指定另外四个选项："Generate merged images"、"Use color for channel images"、"Use channel names"和"Merged image only"。
    3. 从下拉菜单中选择所需的文件类型，例如"TIF"、"BMP"、"PSD"或"JPG"等其他格式，然后点击"Start"开始导出。

结果

氯离子细胞内通道蛋白（CLIC）是一类在不同物种间高度保守的多功能蛋白¹²。大量研究表明，CLIC蛋白在哺乳动物系统中可调控细胞应激、自噬、凋亡、致癌作用、血管生成以及巨噬细胞的先天免疫反应^{13,14,15,16,17}。秀丽隐杆线虫（C. elegans）中有两个CLIC同源基因：exl-1和exc-4。我们近期的研究表明，exl-1参与调控动物的应激反应⁸。我们将一个翻译融合型exl-1::gfp构建体整合到动物基因组中，建立了稳定表达exl-1基...

讨论

本文介绍了一种快速高效验证蛋白质从细胞质向细胞核转移的方法。通过GFP融合蛋白显示目标蛋白的表达，同时利用DAPI染色验证细胞核结构（图3）。由于对C. elegans蛋白质进行免疫染色具有挑战性，大多数C. elegans蛋白的亚细胞定位研究通常采用标记蛋白（如GFP、Laz、mCherry等）进行标记^18,19,20,21。在本研究中，使用gfp标记目标基因exl-1，以展示其蛋白在细胞内的定位情况。为确认蛋白的核定位，采用了DAPI染色法。本文提供了两种DAPI染色的替代方法，均可在合理的工作时间范围内（少于1小时）有效显示线虫中清晰的细胞核信号。乙醇固定法适用于小样本量的收集，例如质量观察（收集少于50条线虫）。关键在于防止线虫完全干燥；一旦95...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
DAPI	Biotium	40043	Hoechst 33258 和 Hoechst 33342 同样适用
OP50	CGC	OP50	https://cgc.umn.edu/
秀丽隐杆线虫遗传中心（Caenorhabditis Genetics Center, CGC）			https://cgc.umn.edu/
Kim Wipe	Kimberly-Clark Corporation		柔软纸巾
Zeiss  AX10	Zeiss		荧光显微镜
Axiovision Rel 4.8	Zeiss		显微镜软件
AxioCam MR Rev3	Zeiss		数码相机
培养箱
微量离心机
透明指甲油凝胶
60 mm 培养皿
载玻片
盖玻片
1-20 µL 移液器
20-200 µL 移液器
200-1000 µL 移液器
1-200 µL 移液器吸头
200-1000 µL 移液器吸头
1.5 mL 微量离心管
铂金丝线虫挑取工具