本实验方案演示了如何利用绿色荧光蛋白（GFP）融合蛋白作为标记，并结合4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色，在热应激条件下追踪蛋白质的核转位过程。DAPI染色步骤快速，且能有效保留GFP及蛋白质亚细胞定位信号。
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摘要
摘要
在本实验方案中，通过绿色荧光蛋白（GFP）融合蛋白与4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色来追踪蛋白质亚细胞定位的变化，特别是热应激条件下发生的核转位。蛋白质会对外部和内部信号作出相应反应，其中一种常见机制是改变其亚细胞定位。本文介绍了一种无需使用抗体、放射性标记或共聚焦显微镜即可追踪蛋白质定位的实验方法。在本研究中，使用GFP标记线虫（C. elegans）中的目标蛋白EXL-1，该蛋白属于细胞内氯离子通道蛋白（CLICs）家族，与哺乳动物的CLIC4同源。通过转化和γ射线辐照构建了包含启动子和完整基因序列的稳定整合型翻译融合exl-1::gfp转基因品系，可稳定表达该基因及gfp。近期研究表明，在热应激而非氧化应激条件下，EXL-1::GFP会在细胞核中积累。通过将GFP信号与细胞核结构以及DAPI信号进行共定位，可确认EXL-1在应激状态下的亚细胞定位变化。本方案提供了两种不同的DAPI染色固定方法：乙醇固定和丙酮固定。本文所述的DAPI染色方法快速高效，能够同时保留GFP荧光信号和蛋白质的亚细胞定位变化。该方法仅需配备微分干涉相差（Nomarski）光学系统、FITC滤光片和DAPI滤光片的荧光显微镜，适用于小型实验室、本科生科研、高中生科研以及生物技术课程教学。
引言
蛋白质亚细胞定位的改变是响应内部或外部信号（如热应激、饥饿、氧化应激、细胞凋亡、蛋白质磷酸化等）的常见机制。例如，热应激可诱导FOXO家族成员DAF-16发生核转位1,2，而促凋亡BCL-2蛋白BID在接收到死亡信号后会转位至线粒体3,4。目前已有多种技术可用于检测这些变化。结合蛋白质印迹（western blotting）与亚细胞结构（例如，线粒体或细胞核）的生化分离方法可有效实现该目的3。然而，该方法需要针对目标蛋白的特异性抗体，因此高质量且经过验证的抗体成为实验成功的关键。另一种方法是利用绿色荧光蛋白（GFP）、红色荧光蛋白（RFP）、黄色荧光蛋白（YFP）和mCherry等标记不同的亚细胞结构或细胞器，同时用其他标记物标记目标蛋白，然后通过共聚焦显微镜观察以确定其定位5,6。放射性同位素也可用于标记目标蛋白，进而检测其亚细胞定位7，但该方法需要专业培训以及对放射性废物的妥善处理。在缺乏特异性抗体、合适标记物或共聚焦显微镜等设备的情况下，需要考虑替代方案。为鉴定蛋白....
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方案
1. 溶液
- NGM 平板
- 在2 L的锥形瓶中，加入3 g NaCl、17 g琼脂、2.5 g蛋白胨和975 mL dH₂O2O. 用铝箔封住烧瓶口，高压灭菌50分钟，冷却20–30分钟。
- 然后加入灭菌溶液：1 mL 1 M CaCl2，1 mL 5 mg/mL 胆固醇乙醇溶液，1 mL 1 M MgSO₄4，以及25 mL 1 M KPO4 （pH 6.0）缓冲液。轻轻摇动溶液使其充分混匀。
- 使用液体分配器将NGM溶液分装至60 mm培养皿中，加入琼脂至培养皿容量的2/3。将培养皿密封存放于4 °C环境中，以备后续使用。
- 1 M KPO4 缓冲液（pH 6.0）
- 溶解 10.83 g KH2PO4 和 3.56 g 的 K2HPO4 在 dH₂O 中2O，然后将总体积调至100 mL。将溶液高压灭菌15分钟。
- M9
- 溶解3 g KH2PO4,
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结果
氯离子细胞内通道蛋白（CLIC）是一类在不同物种间高度保守的多功能蛋白12。大量研究表明，CLIC蛋白在哺乳动物系统中可调控细胞应激、自噬、凋亡、致癌作用、血管生成以及巨噬细胞的先天免疫反应13,14,15,16,17。C. elegans 中存在两种 CLIC 同源蛋白： exl-1 和 exc-4。我们最近的研究表明，exl-1 参与调控动物的应激反应8。我们将一个翻译融合型 exl-1::gfp 构建体整合到动物基因组中，建立了稳定表达带有 GFP 标签的
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讨论
本文介绍了一种快速高效验证蛋白质从细胞质向细胞核转移的方法。通过GFP融合蛋白显示目标蛋白的表达，同时利用DAPI染色验证细胞核结构（图3）。由于对C. elegans蛋白质进行免疫染色具有挑战性，大多数C. elegans蛋白的亚细胞定位研究通常采用标记蛋白（如GFP、Laz、mCherry等）进行标记18,19,20,21。在本研究中，使用gfp标记目标基因exl-1，以展示其蛋白在细胞内的定位情况。为确认蛋白的核定位，采用了DAPI染色法。本文提供了两种DAPI染色的替代方法，均可在合理的工作时间范围内（少于1小时）有效显示线虫中清晰的细胞核信号。乙醇固定法适用于小样本量的收集，例如质量观察（收集少于50条线虫）。关键在于防止线虫完全干燥；一旦95.......
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致谢
本研究中使用的 C. elegans 菌株来自线虫遗传学中心（Caenorhabditis Genetics Center），该中心由美国国立卫生研究院研究基础设施项目（P40 OD010440）资助。本工作得到以下资助：美国国立卫生研究院（NIH）1R03AG048578-01 项目、CUNY-CCRG 1501 项目以及 PSC-CUNY 66184-00 44 和 67248-00 45 项目，均由 Jun Liang 负责。我们感谢 Cathy Savage-Dunn 慷慨提供实验室空间。所有荧光图像均在皇后学院核心设施采集。我们感谢 William J. Rice 对稿件提出的修改意见。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| DAPI | Biotium | 40043 | Hoechst 33258 和 Hoechst 33342 同样适用 |
| OP50 | CGC | OP50 | https://cgc.umn.edu/ |
| 秀丽隐杆线虫遗传中心（Caenorhabditis Genetics Center, CGC） | https://cgc.umn.edu/ | ||
| Kim Wipe | Kimberly-Clark Corporation | 柔软纸巾 | |
| Zeiss AX10 | Zeiss | 荧光显微镜 | |
| Axiovision Rel 4.8 | Zeiss | 显微镜软件 | |
| AxioCam MR Rev3 | Zeiss | 数码相机 | |
| 培养箱 | |||
| 微量离心机 | |||
| 透明指甲油凝胶 | |||
| 60 mm 培养皿 | |||
| 载玻片 | |||
| 盖玻片 | |||
| 1-20 µL 移液器 | |||
| 20-200 µL 移液器 | |||
| 200-1000 µL 移液器 | |||
| 1-200 µL 移液器吸头 | |||
| 200-1000 µL 移液器吸头 | |||
| 1.5 mL 微量离心管 | |||
| 铂金丝线虫挑取工具 |
参考文献
- Essers, M. A., et al. FOXO transcription factor activation by oxidative stress mediated by the small GTPase Ral and JNK. The EMBO Journal. 23 (24), 4802-4812 (2004).
- Oh, S. W., et al.
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重印与许可
