数字PCR用于急性心肌梗死和心血管疾病中循环微小RNA的定量分析

摘要

循环microRNA作为心血管疾病和急性心肌梗死的生物标志物已展现出良好的应用前景。在本研究中，我们描述了一种用于从心血管疾病患者血清中提取miRNA、逆转录及数字PCR的实验方案，以实现对miRNA的绝对定量。

摘要

循环血清微小RNA（miRNA）作为心血管疾病和急性心肌梗死（AMI）的生物标志物展现出良好前景，这些miRNA由心血管细胞释放进入血液循环。循环miRNA具有高度稳定性，并可被定量检测。特定miRNA的定量表达水平与病理状态相关，部分miRNA表现出高度的组织和疾病特异性。发现新的心血管疾病生物标志物对医学研究具有重要意义。近年来，数字聚合酶链式反应（dPCR）技术被发明出来。dPCR结合荧光水解探针，可实现特异性的直接绝对定量。与定量聚合酶链式反应（qPCR）相比，dPCR具有更优异的技术性能，包括更低的变异性、更高的线性度和更高的灵敏度。因此，dPCR是一种更准确、可重复性更高的miRNA直接定量方法，尤其适用于大规模多中心心血管临床试验。本文中，我们描述了如何有效开展数字PCR，以测定血清样本中miRNA的绝对拷贝数。

引言

循环miRNA已被确定为多种疾病的潜在标志物，包括心血管疾病¹微小RNA（miRNA）是一类长度约为22个核苷酸的小型非编码单链RNA分子，参与转录后基因表达调控。 通过 信使RNA翻译的改变及对基因表达的影响²在生理和病理状态下，这些物质均会释放进入循环系统。特定miRNA的定量表达可与病理状态相关联，且某些miRNA表现出高度的组织和疾病特异性¹在心血管疾病中，miRNA 因其在血清中具有显著的稳定性，并可通过 PCR 技术轻松定量，已成为极具吸引力的新型生物标志物候选分子。³微小RNA作为心肌梗死生物标志物的潜在价值已在小规模研究中得到评估，但在大规模队列中的验证仍然缺乏²例如，miR-499 在心肌组织中高表达，且已被证实其在急性心肌梗死（AMI）中显著升高^4,5,6此外，它还调控程序性细胞死亡（凋亡）以及心肌细胞的分化，因此参与急性心肌梗死（AMI）后的多种机制⁷除了少数小型研究报道了miRNA在诊断急性心肌梗死（AMI）方面具有优越性....

方案

1. 从血浆/血清中提取miRNA

注意：为了准确量化miRNA，从血浆/血清中正确分离microRNA是至关重要的步骤。需要特别注意的是，由于存在不同的实验方案，在处理样本时应始终遵循相同的操作流程。在本方案中，miRNA从50 µL血清中提取。请勿使用超过200 µL的样本量，否则将影响正确的提取过程。

1. 准备血清或解冻冷冻样本。
2. 向50 µL血清中加入250 µL（5倍体积）商用裂解试剂。通过涡旋振荡辅助裂解。将含有裂解液的离心管置于室温下静置5分钟。
3. 向裂解液中加入3.5 µL spike-in对照（1.6 x 10⁷ 拷贝/µL），并通过涡旋振荡混匀。
4. 加入50 µL氯仿（i.e.，与起始血清样本等体积）以进行相分离。剧烈振荡离心管15秒。将离心管在室温下静置2–3分钟。
5. 为实现相分离，在4 °C条件下以12,000 x g离心15分钟。
   注意：此时样本已分为上层含RNA的水相、中间白色界面层和下层粉红色有机相。
6. 将含有RNA的上层水相（100 µL）转移至新离心管中。避免转移任何白色界面层物质，以免干扰RNA定量准确性。
7. 加入150 µL（i.e.，转移样本体积的1.5倍）100%乙醇。通过移液器反复吹打混匀。切勿离心，并立即进入下一步操作。
....

结果

数字PCR结合荧光水解探针技术，可使研究人员直接定量特定miRNA的绝对拷贝数（拷贝数/µL）。由于dPCR将样本分割为约20,000个独立的PCR反应单元，因此无需进行技术重复¹⁰。dPCR系统采用泊松统计学方法对荧光信号（区分阳性与阴性反应）进行数学分析，从而实现无需标准曲线的绝对定量¹⁰。为准确计算浓度，需获得可接受的液滴数量（>15,000）。无模板对照可确保排除显著的非特异性扩增。所有纳入分析的样本均采用相同的体积、方法和PCR程序进行处理，以增强所得结果的可靠性。dPCR中获得的浓度数据通过中位数标准化方法进行归一化处理，该方法基于所有样本中添加的合成外源性 C. elegans miR-39 进行校正¹³。将数据归一化至所测定的添加 C. elegans miR-39 量，可校正样本间RNA提取效率的差异，并作为PCR反应的对照，进一步提高结果的有效性。目前尚无公认的血清mi.......

讨论

数字PCR（dPCR）是一种相对较新的终点式PCR方法，可实现对样本中核酸的直接绝对定量。该方法具有若干显著优势，包括变异性降低、日间重复性提高以及更高的灵敏度^11,12。此外，由于将样本分割为约20,000个独立反应并进行终点分析，与定量RT-PCR相比，dPCR对PCR中的干扰物质具有更强的耐受性¹⁶。这些特性使dPCR成为用于定量分析的一种颇具吸引力的诊断工具，可替代定量RT-PCR。由于循环miRNA在血清中的浓度通常较低，迄今为止，科学家在利用PCR准确量化miRNA方面面临挑战⁹。而dPCR能够准确量化血清中极低水平的miRNA表达，从而缓解低丰度miRNA定量过程中存在的问题¹⁷。dPCR能够在miRNA表达极低的情况下直接提供每微升的拷贝数（counts/µL），因此在心血管研究领域的miRNA生物标志物研究中，成为一种极具吸引力的诊断工具。由于以counts/µ.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
RNA提取
miRNeasy 血清/血浆试剂盒（50次）	Qiagen-Sample & Assay Technologies, Hilden, Deutschland	217184	用于microRNA提取的试剂盒。试剂盒包含商用缓冲液RWT（文中称为一号缓冲液） 和RPE（文中称为二号缓冲液）。
miRNeasy 血清/血浆内参对照；Syn-cel-miR-39 miRNA；10 pmol	Qiagen-Sample & Assay Technologies, Hilden, Deutschland	219610	用于归一化的加标对照，序列：5'-UCACCGGGUGUAAAUCAGCUUG-3'
逆转录
TaqMan MicroRNA 逆转录试剂盒（1000次反应）	Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA	4366597	用于microRNA逆转录的试剂盒
TaqMan MicroRNA 检测试剂 M	Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA	4440887	用于逆转录的检测试剂
hsa-miR-499（750次逆转录/750次PCR反应）	Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA	4440887	检测编号 001352
cel-miR-39（750次逆转录/750次PCR反应）	Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA	4440887	检测编号 000200
PCR板，96孔，分段式，半裙边	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	AB0900	用于逆转录的96孔板
Microseal ‘B’ 密封膜	Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA	MSB1001	铝箔膜，用于确保妥善保存
C1000 Touch 梯度PCR仪	Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA	1851196	用于逆转录的PCR仪
微滴数字PCR
100 nmol RNA寡核苷酸 hsa-miR-499-5p	Integrated DNA Technologies	Custom	序列：5'-phos-UUAAGACUUGCAGUGAUGUUU-3'
ddPCR 探针用预混液（不含dUTP）	Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA	1863024	用于微滴生成的预混液
TaqMan MicroRNA 检测试剂	Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA	4440887	用于数字PCR的检测试剂（荧光水解探针）
hsa-miR-499（750次逆转录/750次PCR反应）	Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA	4440887	检测编号 001352，商用引物
cel-miR-39（750次逆转录/750次PCR反应）	Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA	4440887	检测编号 000200，商用引物
DG8 微滴生成卡盒及垫圈	Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA	1864007	卡盒最多可容纳8个样本进行微滴生成
DG8 卡盒支架	Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA	1863051	用于固定微滴生成过程中的卡盒
探针用微滴生成油	Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA	1863005	用于微滴生成的油相
ddPCR 96孔板	Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA	12001925	用于ddPCR的96孔板
PCR板热封膜，铝箔，可穿刺	Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA	1814040	可穿刺铝箔膜，与微滴读取仪兼容
ddPCR 微滴读取油	Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA	1863004	用于微滴读取的油相
QX100 或 QX200 微滴生成仪	Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA	1863002	微滴生成仪，用于从样本/油相乳液中生成微滴
PX1 PCR板封膜仪	Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA	1814000	PCR前对反应板进行封膜
C1000 Touch 梯度PCR仪	Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA	1851196	用于ddPCR的PCR仪
QX100 或 QX200 微滴读取仪	Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA	1863003	通过光学检测器读取PCR阳性与PCR阴性微滴
探针用ddPCR空白缓冲对照	Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA	1863052	空白对照 并用于填满8孔条板中的剩余孔
软件
QuantaSoft 软件	Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA	1864011	用于微滴读取的程序
Prism Windows 5	GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA		用于统计分析的程序