循环microRNA作为心血管疾病和急性心肌梗死的生物标志物已展现出良好的应用前景。在本研究中，我们描述了一种用于从心血管疾病患者血清中提取miRNA、逆转录及数字PCR的实验方案，以实现对miRNA的绝对定量。
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摘要
摘要
循环血清微小RNA（miRNA）作为心血管疾病和急性心肌梗死（AMI）的生物标志物展现出良好前景，这些miRNA由心血管细胞释放进入血液循环。循环miRNA具有高度稳定性，并可被定量检测。特定miRNA的定量表达水平与病理状态相关，部分miRNA表现出高度的组织和疾病特异性。发现新的心血管疾病生物标志物对医学研究具有重要意义。近年来，数字聚合酶链式反应（dPCR）技术被发明出来。dPCR结合荧光水解探针，可实现特异性的直接绝对定量。与定量聚合酶链式反应（qPCR）相比，dPCR具有更优异的技术性能，包括更低的变异性、更高的线性度和更高的灵敏度。因此，dPCR是一种更准确、可重复性更高的miRNA直接定量方法，尤其适用于大规模多中心心血管临床试验。本文中，我们描述了如何有效开展数字PCR，以测定血清样本中miRNA的绝对拷贝数。
引言
循环miRNA已被确定为多种疾病的潜在标志物，包括心血管疾病1微小RNA（miRNA）是一类长度约为22个核苷酸的小型非编码单链RNA分子，参与转录后基因表达调控。 通过 信使RNA翻译的改变及对基因表达的影响2在生理和病理状态下，这些物质均会释放进入循环系统。特定miRNA的定量表达可与病理状态相关联，且某些miRNA表现出高度的组织和疾病特异性1在心血管疾病中，miRNA 因其在血清中具有显著的稳定性，并可通过 PCR 技术轻松定量，已成为极具吸引力的新型生物标志物候选分子。3微小RNA作为心肌梗死生物标志物的潜在价值已在小规模研究中得到评估，但在大规模队列中的验证仍然缺乏2例如，miR-499 在心肌组织中高表达，且已被证实其在急性心肌梗死（AMI）中显著升高4,5,6此外，它还调控程序性细胞死亡（凋亡）以及心肌细胞的分化，因此参与急性心肌梗死（AMI）后的多种机制7除了少数小型研究报道了miRNA在诊断急性心肌梗死（AMI）方面具有优越性及附加价值外，目前尚无大规模研究证实其相对于高敏性心肌肌钙蛋白具有优越性或等效性。2,5,6,8因此，还需要在大样本队列中开展更多前瞻性研究，以评估miRNA的潜在诊断价值。此外，应采用可比的实验方案，对miRNA定量方法进行优化和标准化。9标准化的检测方法可能减少结果的不一致性，并有助于将miRNA发展为可用于常规临床应用的潜在生物标志物，因为生物标志物需要以可重复的方式进行定量，以确保其临床适用性。
近年来，数字PCR（dPCR）作为一种终点分析方法被引入。该技术可将样本分割为约20,000个独立的反应单元10。dPCR系统随后对荧光信号（阳性与阴性反应）进行数学上的泊松统计分析，从而实现无需标准曲线的绝对定量10。当dPCR与荧光水解探针结合使用时，可实现对miRNA的高度特异性直接绝对定量。与定量实时PCR相比，数字聚合酶链式反应在循环miRNA水平的定量中表现出更优的技术性能（包括变异性降低、日间重复性提高、线性程度高以及灵敏度高）10,11。这些优越的技术特性可能有助于克服当前将循环miRNA用作生物标志物的局限性，并有望推动miRNA在大规模多中心心血管临床试验中作为生物标志物的确立，以及作为常规诊断方法的应用。在之前的一项研究中，我们近期应用dPCR对急性心肌梗死（AMI）患者循环miRNA进行了绝对定量，并证明其诊断潜力优于qPCR对miRNA的定量结果12。
在本出版物中，我们旨在证明使用数字PCR（dPCR）是直接定量循环心血管miRNA的准确且可重复的方法。利用数字PCR对血清中miRNA水平进行绝对定量，在大规模多中心心血管临床试验中具有应用潜力。本文详细描述了如何有效进行数字PCR操作，以及如何检测血清中miRNA的绝对拷贝数。
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方案
1. 从血浆/血清中提取miRNA
注意：为了准确量化miRNA，从血浆/血清中正确分离microRNA是至关重要的步骤。需要特别注意的是，由于存在不同的实验方案，在处理样本时应始终遵循相同的操作流程。在本方案中，miRNA从50 µL血清中提取。请勿使用超过200 µL的样本量，否则将影响正确的提取过程。
- 准备血清或解冻冷冻样本。
- 向50 µL血清中加入250 µL（5倍体积）商用裂解试剂。通过涡旋振荡辅助裂解。将含有裂解液的离心管置于室温下静置5分钟。
- 向裂解液中加入3.5 µL spike-in对照（1.6 x 107 拷贝/µL），并通过涡旋振荡混匀。
- 加入50 µL氯仿（i.e.，与起始血清样本等体积）以进行相分离。剧烈振荡离心管15秒。将离心管在室温下静置2–3分钟。
- 为实现相分离，在4 °C条件下以12,000 x g离心15分钟。
注意：此时样本已分为上层含RNA的水相、中间白色界面层和下层粉红色有机相。 - 将含有RNA的上层水相（100 µL）转移至新离心管中。避免转移任何白色界面层物质，以免干扰RNA定量准确性。
- 加入150 µL（i.e.，转移样本体积的1.5倍）100%乙醇。通过移液器反复吹打混匀。切勿离心，并立即进入下一步操作。
- 将250 µL样本溶液转移至置于2 mL收集管中的商用离心柱中。盖紧管盖。在室温下以>8,000 x g离心15秒。弃去穿流液。
- 向离心柱中加入700 µL商用洗涤缓冲液1。盖紧管盖，在室温下以>8,000 x g离心15秒。弃去穿流的洗涤缓冲液。
- 向离心柱中加入500 µL商用洗涤缓冲液2。盖紧管盖，在室温下以>8,000 x g离心15秒。弃去穿流的洗涤缓冲液。
- 向离心柱中加入500 µL 80%乙醇。盖紧管盖，在室温下以>8,000 x g离心2分钟。弃去含穿流液的收集管。
- 将离心柱转移至新的2 mL收集管中。打开管盖，以最大转速离心以干燥膜。弃去含穿流液的收集管。
- 将离心柱转移至新的1.5 mL收集管中。通过将30 µL无RNase水直接加至膜中心来洗脱RNA。盖紧管盖，以最大转速离心1分钟。
- 将RNA储存于-70 °C。
注意：将纯化的RNA溶于无RNase水中并保存在-70 °C至-20 °C之间，可确保RNA在1年内不发生降解。根据制造商说明书，用于稀释RNA的最小无RNase水量为10 µL。使用少于10 µL可能导致膜水合不充分，从而降低总RNA得率。
2. 逆转录
注意：使用以下15 µL反转录（RT）体系（总体积）合成互补DNA（cDNA）。
- 将RT试剂盒置于冰上解冻。酶类应尽可能保留在冷冻环境中，以防止降解，并在使用前离心收集。
- 按照表1所述配制预混液。
- 在96孔板中，每孔加入10 µL预混液和5 µL提取的RNA。
- 将96孔板在4 °C、2,000 x g条件下离心2分钟。
- 按照表2所述的程序进行逆转录反应。
注意：如下所述，cDNA可直接用于数字PCR仪（见材料表）；也可在-20 °C保存。
3. 微滴生成与数字PCR
注意：数字PCR采用以下40 µL体系进行。
- 将商用dPCR混合液、制备好的cDNA以及PCR引物置于冰上解冻。使用前短暂离心。
- 按照表3所述配制主混合液。
- 每孔加入1.33 μL的反转录产物，并短暂离心。
- 将20 μL样品加入8孔联管（中排）的每个孔中。
注意：若8孔联管未完全使用，剩余孔需加入无模板对照（NTC），即不含cDNA的反应体系（例如，以水代替提取RNA所制备的反转录产物），或加入dPCR商用缓冲液。NTC用于污染对照。剩余孔中不得加水，否则会影响液滴生成的质量。 - 将70 μL探针用液滴生成油加入8孔联管的油孔（底排）中。
- 在8孔联管上放置密封垫，然后将联管放入液滴生成仪中。关闭液滴生成仪，等待3个指示灯均稳定显示绿色。
注意：此时正在生成液滴。 - 用移液器小心缓慢地将40 μL已形成液滴的样品（上排）转移至96孔板中的各个独立孔中。
- 完成所有样品的液滴生成后，使用可穿刺的dPCR封口膜在180 °C下热封PCR板4秒。
- 将封膜后的PCR板放入PCR仪中，按照表4所述程序进行扩增，升降温速率为2.5 °C/s。
4. 液滴读取与分析
- 将PCR板从热循环仪转移到板架底座上，通过将板架上部盖在PCR板上来固定PCR板。
- 启动商用数字PCR软件。
- 在设置中输入样本名称、实验名称和靶标信息，并选择绝对定量模式。
- 点击RUN开始液滴读取。当使用水解探针时，选择FAM/HEX或FAM/VIC作为检测化学体系。
注意：商用数字PCR软件将自动分析数据。 - 检查结果表格中的液滴数量，以确保液滴生成正常。
- 选中所有含有相同定量miRNA的孔，然后点击ANALYZE。使用二维图谱标记阳性液滴，并对手动校正自动分析结果（图1）。
5. 样品的正确计算
- 通过将样本乘以归一化因子（NF）对样本进行归一化处理。
NF = 所有样本的C. elegans miR-39 测量值中位数所有样本 / 给定样本的C. elegans miR-39 值给定样本 - 计算最终的血清miRNA浓度，并根据稀释因子（DF）进行调整。
[miRNA]最终 = [miRNA]原始值 × DFRT × DFdPCR × DFEx
其中：
[miRNA]原始值 = 商业dPCR软件定量的miRNA值；
DFRT = 逆转录过程中模板的稀释因子；
DFdPCR = dPCR过程中模板的稀释因子；
DFEx = 提取过程中的稀释因子。
6. 合成寡核苷酸稀释系列
- 将冻干的合成寡核苷酸在冰上解冻，短暂离心。
- 用无核酸酶的水将冻干的合成寡核苷酸稀释至终浓度为 10 pmol/µL，短暂离心。
- 按照表5中的描述，用无核酸酶的水进行稀释；每次稀释步骤之间均需短暂离心，离心条件为 8,000 × g 离心 10 秒。
- 继续进行逆转录（如步骤 2 所述），并按照步骤 3 和步骤 4 所述方法使用数字 PCR 分析样品。
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结果
数字PCR结合荧光水解探针可使研究人员直接定量特定miRNA的绝对拷贝数（拷贝数/µL）。由于dPCR将样本分割为约20,000个独立的PCR反应，因此无需进行技术重复10。dPCR系统利用泊松统计学对荧光信号（阳性与阴性反应之间的差异）进行数学分析，从而实现绝对定量，无需标准曲线10。为了准确计算浓度，需要达到可接受的液滴数量（>15,000）。无模板对照可确保排除显著的非特异性扩增。所有纳入分析的样本均采用相同的体积、方法和PCR程序进行处理，以增强所得结果的有效性。dPCR中获得的浓度通过中位数标准化方法进行归一化处理，该方法基于所有样本中加入的合成外源性 C. elegans miR-39 进行校正13。将数据归一化至所测得的外源性 C. elegans miR-39 量，可校正样本间RNA提取效率的差异，并作为PCR反应的对照，进一步提高结果的可靠性。目前尚无血清miRNA归一化的公认...
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讨论
数字PCR（dPCR）是一种相对较新的终点式PCR方法，可实现对样本中核酸的直接绝对定量。该方法具有若干显著优势，包括变异性降低、日间重复性提高以及更高的灵敏度11,12。此外，由于将样本分割为约20,000个独立反应并进行终点分析，与定量RT-PCR相比，dPCR对PCR中的干扰物质具有更强的耐受性16。这些特性使dPCR成为用于定量分析的一种颇具吸引力的诊断工具，可替代定量RT-PCR。由于循环miRNA在血清中的浓度通常较低，迄今为止，科学家在利用PCR准确量化miRNA方面面临挑战9。而dPCR能够准确量化血清中极低水平的miRNA表达，从而缓解低丰度miRNA定量过程中存在的问题17。dPCR能够在miRNA表达极低的情况下直接提供每微升的拷贝数（counts/µL），因此在心血管研究领域的miRNA生物标志物研究中，成为一种极具吸引力的诊断工具。由于以counts/µ...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| RNA提取 | |||
| miRNeasy 血清/血浆试剂盒（50次） | Qiagen-Sample & Assay Technologies, Hilden, Deutschland | 217184 | 用于microRNA提取的试剂盒。试剂盒包含商用缓冲液RWT（文中称为一号缓冲液） 和RPE（文中称为二号缓冲液）。 |
| miRNeasy 血清/血浆内参对照；Syn-cel-miR-39 miRNA；10 pmol | Qiagen-Sample & Assay Technologies, Hilden, Deutschland | 219610 | 用于归一化的加标对照，序列：5'-UCACCGGGUGUAAAUCAGCUUG-3' |
| 逆转录 | |||
| TaqMan MicroRNA 逆转录试剂盒（1000次反应） | Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA | 4366597 | 用于microRNA逆转录的试剂盒 |
| TaqMan MicroRNA 检测试剂 M | Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA | 4440887 | 用于逆转录的检测试剂 |
| hsa-miR-499（750次逆转录/750次PCR反应） | Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA | 4440887 | 检测编号 001352 |
| cel-miR-39（750次逆转录/750次PCR反应） | Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA | 4440887 | 检测编号 000200 |
| PCR板，96孔，分段式，半裙边 | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | AB0900 | 用于逆转录的96孔板 |
| Microseal ‘B’ 密封膜 | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | MSB1001 | 铝箔膜，用于确保妥善保存 |
| C1000 Touch 梯度PCR仪 | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1851196 | 用于逆转录的PCR仪 |
| 微滴数字PCR | |||
| 100 nmol RNA寡核苷酸 hsa-miR-499-5p | Integrated DNA Technologies | Custom | 序列：5'-phos-UUAAGACUUGCAGUGAUGUUU-3' |
| ddPCR 探针用预混液（不含dUTP） | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1863024 | 用于微滴生成的预混液 |
| TaqMan MicroRNA 检测试剂 | Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA | 4440887 | 用于数字PCR的检测试剂（荧光水解探针） |
| hsa-miR-499（750次逆转录/750次PCR反应） | Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA | 4440887 | 检测编号 001352，商用引物 |
| cel-miR-39（750次逆转录/750次PCR反应） | Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA | 4440887 | 检测编号 000200，商用引物 |
| DG8 微滴生成卡盒及垫圈 | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1864007 | 卡盒最多可容纳8个样本进行微滴生成 |
| DG8 卡盒支架 | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1863051 | 用于固定微滴生成过程中的卡盒 |
| 探针用微滴生成油 | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1863005 | 用于微滴生成的油相 |
| ddPCR 96孔板 | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 12001925 | 用于ddPCR的96孔板 |
| PCR板热封膜，铝箔，可穿刺 | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1814040 | 可穿刺铝箔膜，与微滴读取仪兼容 |
| ddPCR 微滴读取油 | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1863004 | 用于微滴读取的油相 |
| QX100 或 QX200 微滴生成仪 | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1863002 | 微滴生成仪，用于从样本/油相乳液中生成微滴 |
| PX1 PCR板封膜仪 | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1814000 | PCR前对反应板进行封膜 |
| C1000 Touch 梯度PCR仪 | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1851196 | 用于ddPCR的PCR仪 |
| QX100 或 QX200 微滴读取仪 | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1863003 | 通过光学检测器读取PCR阳性与PCR阴性微滴 |
| 探针用ddPCR空白缓冲对照 | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1863052 | 空白对照 并用于填满8孔条板中的剩余孔 |
| 软件 | |||
| QuantaSoft 软件 | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1864011 | 用于微滴读取的程序 |
| Prism Windows 5 | GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA | 用于统计分析的程序 |
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