从代谢综合征相关射血分数保留型心力衰竭大鼠模型中分离心房心肌细胞

摘要

本文介绍了一种经过优化的基于兰根多夫（Langendorff）系统的分离方法，用于从与代谢综合征相关且射血分数保留的心力衰竭大鼠模型中分离单个心房心肌细胞。通过手动调节心脏腔室的管腔内压力，可获得功能完整的肌细胞，适用于兴奋-收缩耦联研究。

摘要

本文介绍了一种经过优化的、基于兰格多夫（Langendorff）系统的单细胞心房心肌细胞（ACMs）分离方法，用于从代谢综合征（MetS）相关射血分数保留型心力衰竭（HFpEF）的大鼠模型中获取细胞。MetS相关HFpEF的发病率正在上升，而与心房重构及心房颤动相关的心房心肌病在临床上具有重要意义，因为心房重构是死亡率的独立预测因子。针对分离的单个心肌细胞的研究常被用于验证和补充体内实验的结果。然而，循环血管稀疏化和间质组织纤维化可能成为从此类疾病动物模型中成功分离单个ACMs的潜在限制因素。

我们通过使用一种能够在分离过程中手动调节心腔内压力的装置，显著提高了形态和功能完整的心肌细胞的得率。所获得的细胞可用于多种不同的实验，例如细胞培养和功能性钙成像（即，兴奋-收缩耦联）。

我们为研究人员提供了一步一步的操作方案、优化试剂列表、准备必要设备的详细说明以及全面的故障排除指南。尽管该实验程序的初次实施可能较为困难，但成功掌握后，读者便可在与代谢综合征相关的射血分数保留型心力衰竭（HFpEF）大鼠模型中，开展多种实验所需的前沿心外膜脂肪组织（ACM）分离。

引言

代谢综合征（MetS）是一组2型糖尿病和心血管疾病的危险因素集合，包括动脉血压升高、血脂异常（甘油三酯升高和高密度脂蛋白胆固醇降低）、空腹血糖升高以及中心性肥胖¹。全球范围内MetS的患病率估计为25%–30%，且呈持续上升趋势²。射血分数保留的心力衰竭（HFpEF）是一种具有异质性的临床综合征，常与MetS相关。在HFpEF及其前期阶段（即高血压性心脏病）中，心脏重构通常伴随心房的重构³。左心房收缩功能减退及结构改变与死亡率升高、心房颤动以及新发心力衰竭密切相关⁴。心房重构的特征包括离子通道功能改变、Ca²⁺稳态失调、心房结构变化、成纤维细胞活化以及组织纤维化⁵。MetS相关HFpEF中的左心房重构及其潜在病理机制目前仍不明确，亟需深入研究。动物模型已被证实是研究心房心肌病的重要工具，并推动了该领域的多项进展^6,7,8,9。

采用分离的单细胞心肌....

方案

所有实验均经当地伦理委员会批准（TVA T0060/15 和 T0003-15），并遵循美国国立卫生研究院（National Institute of Health, U.S.A.）颁布的《实验动物护理与使用指南》进行。

注意：该实验流程的简化流程图见图1。

1. 实验前准备

1. 根据表1准备缓冲液。

溶液

PB

CB

DB

SB

S1

S2

S3

NT

结果

通过本方法，可在21周龄时从ZSF-1肥胖大鼠中分离出60–90%的有活力心外膜细胞（ACM）（活力评估方法见步骤6.1），且细胞经过钙再适应处理（步骤5.4–5.7）（图4A）。在大鼠中，与心室心肌细胞（VCM）相比，ACM具有不同且更为异质的表型^24,25。图4B显示了一个单个ACM，其细胞膜和肌节结构均保持完整，两者均为功能完整细胞的有力指标。

所获得的心房心肌细胞（ACMs）可通过多种方式进行处理。如图5所示，可将细胞负载荧光染料，用于研究其形态和/或功能。例如，使用di-8-ANEPPS染料来显示大鼠心房细胞中肌管系统的结构（

讨论

本文首先描述了一种从表现为明显心房重构的代谢综合征相关射血分数保留型心力衰竭（HFpEF）大鼠模型中分离单个心房心肌细胞（ACM）的实验方案²²。该操作具有独特挑战性，因为过量的脂肪组织会使得手术准备以及主动脉插管变得愈发困难。表2中提供的故障排除指南针对了分离过程中最常见的问题。

.......

问题	可能原因	解决方案
蝶形管无液体流过	插管结扎导致主动脉闭合不充分	结扎前去除脂肪组织

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
ZSF-1 肥胖大鼠	Charles River Laboratories, Inc.		21 周龄
精细虹膜剪刀	Fine Science Tools GmbH	14094-11
手术剪刀	Fine Science Tools GmbH	14001-18
微型敷料镊（弯曲，带齿）	Aesculap, Inc.	BD312R
组织镊（直型，1×2齿）	Aesculap, Inc.	BD537R
打结镊（成角）	Aesculap, Inc.	MA624R
啮齿类与小型动物断头器	Kent Scientific Corp.	DCAP
低成本诱导室 3.0 L	Kent Scientific Corp.	SOMNO-0730
蝶形带翼输液套管 21 G	Hospira, Inc.	181106101
Abbocath 16 G	Hospira, Inc.	0G7149702
微量兰斯皮下注射针头	Becton Dickinson GmbH	301300	改装针头以制备套管
Braun Original Perfusor 注射器 50 ml	B. Braun Melsungen AG	8728810F
Braun Inject Solo 注射器 10 ml	B. Braun Melsungen AG	2057926
50 ml 烧杯	Duran Group (DWK Life Sciences GmbH)	21 106 17
Duroplan 培养皿（100 × 20 mm）	Duran Group (DWK Life Sciences GmbH)	21 755 48
Seraflex 缝合线 USP 3/0	SERAG-WIESSNER GmbH & Co. KG	IC208000
VWR 一次性方形称量舟 100 ml	VWR, Inc.	10803-148
泡沫塑料表面
氯化钠	Sigma-Aldrich, Inc.	71380
氯化钾	Sigma-Aldrich, Inc.	P4504
磷酸二氢钾	Sigma-Aldrich, Inc.	P5379
磷酸氢二钠	Sigma-Aldrich, Inc.	S0876
七水合硫酸镁	Sigma-Aldrich, Inc.	230391
氯化镁	Sigma-Aldrich, Inc.	M8266
HEPES	Sigma-Aldrich, Inc.	H3375
牛磺酸	Sigma-Aldrich, Inc.	T0625
葡萄糖	Sigma-Aldrich, Inc.	G7528
2,3-丁二酮单肟	Sigma-Aldrich, Inc.	B0753
氯化钙溶液（1 M）	Sigma-Aldrich, Inc.	21115
牛血清白蛋白	Sigma-Aldrich, Inc.	A9647
Liberase	Roche (Sigma-Aldrich, Inc.)	LIBTM-RO
肝素	Rotexmedica GmbH	3862357
Forene（异氟烷）	Abbvie Deutschland GmbH & Co. KG	10182054
Engelbreth-Holm-Swarm 小鼠肉瘤基底膜来源层粘连蛋白	Sigma-Aldrich, Inc.	L2020
WillCo 玻璃底培养皿 500µl 0.005 mm	WillCo Wells B.V.	HBST-3522
Fluo4 AM	Invitrogen (Thermo Fisher Scientific, Inc.)	F14201	室温下 5µM 孵育 20 分钟
Di-8-ANNEPS	Invitrogen (Thermo Fisher Scientific, Inc.)	D3167	37°C 下 10µM 孵育 45 分钟
Mitotracker RED FM	Invitrogen (Thermo Fisher Scientific, Inc.)	M22425	37°C 下 20 nM 孵育 30 分钟
夹套式反应容器 500 ml	Gebr. Rettberg GmbH	107024414
夹套式反应容器 1000 ml	Gebr. Rettberg GmbH	107025414
夹套式气泡捕集器	Gebr. Rettberg GmbH	134720001
ED 加热浸入式循环器	Julabo GmbH	9116000
Reglo Digital MS-2/6 蠕动泵	Ismatec (Cole-Parmer Gmbh)	ISM 831
Voltcraft Thermometer 302 K/J 温度计	Conrad Electronic SE	030300546
管路
LSM 700 显微镜	Carl Zeiss, Inc.
ZEN 2.3 成像软件	Carl Zeiss, Inc.	410135-1011-240
单通道加热控制器 TC-324B	Warner Instruments, LLC	64-2400
8 通道灌流系统	Warner Instruments, LLC	64-0185
8 通道多管线串联溶液加热器	Warner Instruments, LLC	64-0105