利用pH依赖性荧光报告基因mt-Keima通过流式细胞术灵敏检测线粒体自噬

摘要

线粒体自噬（mitophagy）是指线粒体的选择性降解过程，在维持线粒体稳态中发挥重要作用，并在多种人类疾病中出现调控异常。然而，目前可用于检测线粒体自噬活性的实验方法十分有限。本文中，我们提供了一种基于流式细胞术的高灵敏度检测方法，用于测量线粒体自噬活性。

摘要

线粒体自噬是一种利用自噬机制选择性清除受损或多余线粒体的过程。已有研究发现，线粒体自噬功能障碍与多种人类疾病密切相关，包括神经退行性疾病、癌症以及代谢性疾病。此外，近期研究表明，线粒体自噬还参与多种正常的细胞过程，如细胞分化与发育。然而，线粒体自噬的具体作用及其分子机制仍需进一步研究。因此，建立一种可靠且便捷的方法来检测线粒体自噬活性的变化至关重要。本文中，我们描述了一种利用线粒体靶向荧光蛋白Keima（mt-Keima）通过流式细胞术定量评估线粒体自噬活性的详细实验方案。相较于传统的显微镜观察或免疫印迹方法，该流式细胞术检测方法能够更快速、更灵敏地分析线粒体自噬活性。本方案可广泛应用于多种细胞类型的线粒体自噬活性分析。

引言

线粒体是细胞增殖和生理功能所必需的细胞器。线粒体通过氧化磷酸化产生超过80%的ATP供应，同时还为生物合成和代谢提供多种代谢中间产物^1，2。除了在能量供应和代谢中的作用外，线粒体还在许多其他重要过程中发挥核心作用，包括活性氧（ROS）的生成、细胞死亡的调控以及细胞内Ca²⁺动态平衡³。线粒体功能的改变与多种人类疾病相关，包括癌症、糖尿病以及各种神经退行性疾病^4，5。线粒体功能障碍的增加以及线粒体DNA突变也被认为是正常衰老过程的重要影响因素^6，7，8。因此，质量控制在线粒体中是一个至关重要的问题。线粒体是高度动态的细胞器，能够持续在拉长的网状结构与短小、碎片化的形态之间转换。线粒体动力学在维持线粒体功能以及通过线粒体自噬实现其降解方面发挥着重要作用⁹。

线粒体自噬是一种利用自噬机制选择性降解完整线粒体的过程。线粒体自噬是线粒体更新以及受损或功能....

方案

1. 表达线粒体Keima（mt-Keima）的HeLa细胞的制备

1. mt-Keima 慢病毒的制备
   1. 向100 mm培养皿中加入2 mL 0.001%的多聚赖氨酸/磷酸盐缓冲液（PBS），室温孵育5分钟，以包被培养皿。
   2. 使用连接真空泵的玻璃移液管吸除多聚赖氨酸溶液，并加入2 mL 1× PBS洗涤培养皿。
   3. 在包被后的培养皿中接种1.5 × 10⁶个HEK293T细胞，加入含10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素/链霉素的10 mL DMEM培养基，于37 °C、CO₂细胞培养箱中培养1天。
   4. 根据转染试剂说明书，使用转染试剂将2 µg mt-Keima慢病毒质粒²⁹ DNA与包装质粒DNA（psPAX 2 µg和pVSVG 0.25 µg）共转染，转染时间为8小时。
   5. 移除转染后的培养基，加入8 mL新鲜培养基。
   6. 48小时后收集含有病毒颗粒的培养基。将收集的培养基在500 × g条件下离心5分钟以去除细胞碎片，并用0.45 µm注射器滤器过滤。
      注意：如需长期保存，可将慢病毒颗粒分装后于-80 °C保存。为保证病毒感染效率，应避免反复冻融。

结果

HeLa-Parkin 细胞中由 CCCP 诱导的线粒体自噬流式细胞术分析示例见图4。采用上述流式细胞术分析方法，我们可检测到“高”门控区域中发生线粒体自噬的细胞数量显著增加。与未处理的对照细胞相比，“高”门控区域中的细胞比例增加了10倍以上（图4A）。共处理巴佛洛霉素A（BFA）后，线粒体自噬活性的这一增加被完全抑制（图4A 和 4B）。

讨论

本文介绍了一种利用流式细胞术快速、灵敏地检测表达mt-Keima的细胞中线粒体自噬活性的方法。经历高水平线粒体自噬的细胞表现出更高的PE-CF594（561 nm）/BV605（405 nm）激发光比率。因此，线粒体自噬活性可表示为具有高561/405比值的细胞百分比。我们计算了在PE-CF594（561 nm）与BV605（405 nm）的散点图中位于"高"门区的细胞百分比，结果显示，CCCP处理可诱导HeLa-Parkin细胞中线粒体自噬的增加。我们先前已证实，通过慢病毒介导的mt-Keima过表达本身不会影响线粒体功能或细胞生理状态³¹。尽管我们在论文中展示了流式细胞术能够成功检测表达Parkin的HeLa细胞中由CCCP诱导的线粒体自噬，但该技术在引入mt-Keima后可适用于任何类型的细胞。我们此前还证明，在无需外源性表达Parkin的情况下，也可在HeLa细胞中检测到缺氧诱导的线粒体自噬²⁹。此外，包括我们团队及其他研究小组在内的先前研究均表明，mt-Keima荧光分析可用于检测原代细胞（如小鼠胚胎成纤维细胞，ME.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
试剂
poly-L-lysine	Sigma-Aldrich	P2636
FBS	GIBCO	16000-044
青霉素/链霉素	wellgene	LS202-02
PBS	Hyclone	SH30013.02
HEK293T	ATCC	CRL-3216
DMEM	GIBCO	12800-082
OPTI-MEM	GIBCO	31985-070
Turbofect	Thermos scientific	R0531
0.45 μm 注射器滤器	sartorius	16555
HeLa	ATCC	CCL-2
polybrene	Sigma-Aldrich	H9268	8 mg/ml
嘌呤霉素	Sigma-Aldrich	P8833	2 mg/ml
羰基氰基间氯苯腙（CCCP）	Sigma-Aldrich	C2759	10 mM
胰蛋白酶-EDTA	wellgene	LS015-01
仪器
BD LSRFortessa	BD Bioscience	LSRFortessa
FACSDIVA	BD Bioscience	FACSDIVA (v8.0.1)