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方法文章

利用pH依赖性荧光报告基因mt-Keima通过流式细胞术灵敏检测线粒体自噬

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DOI：

10.3791/58099

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2018年8月12日

 ,  ,  , 
1Peripheral Neuropathy Research Center, College of Medicine, Dong-A University, 2Department of Biochemistry, College of Medicine, Dong-A University, 3Aging Institute, Department of Medicine, University of Pittsburgh School of Medicine

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

线粒体自噬（mitophagy）是指线粒体的选择性降解过程，在维持线粒体稳态中发挥重要作用，并在多种人类疾病中出现调控异常。然而，目前可用于检测线粒体自噬活性的实验方法十分有限。本文中，我们提供了一种基于流式细胞术的高灵敏度检测方法，用于测量线粒体自噬活性。

摘要

线粒体自噬是一种利用自噬机制选择性清除受损或多余线粒体的过程。已有研究发现，线粒体自噬功能障碍与多种人类疾病密切相关，包括神经退行性疾病、癌症以及代谢性疾病。此外，近期研究表明，线粒体自噬还参与多种正常的细胞过程，如细胞分化与发育。然而，线粒体自噬的具体作用及其分子机制仍需进一步研究。因此，建立一种可靠且便捷的方法来检测线粒体自噬活性的变化至关重要。本文中，我们描述了一种利用线粒体靶向荧光蛋白Keima（mt-Keima）通过流式细胞术定量评估线粒体自噬活性的详细实验方案。相较于传统的显微镜观察或免疫印迹方法，该流式细胞术检测方法能够更快速、更灵敏地分析线粒体自噬活性。本方案可广泛应用于多种细胞类型的线粒体自噬活性分析。

引言

线粒体是细胞增殖和生理功能所必需的细胞器。线粒体通过氧化磷酸化产生超过80%的ATP供应，同时还为生物合成和代谢提供多种代谢中间产物1，2。除了在能量供应和代谢中的作用外，线粒体还在许多其他重要过程中发挥核心作用，包括活性氧（ROS）的生成、细胞死亡的调控以及细胞内Ca2+动态平衡3。线粒体功能的改变与多种人类疾病相关，包括癌症、糖尿病以及各种神经退行性疾病4，5。线粒体功能障碍的增加以及线粒体DNA突变也被认为是正常衰老过程的重要影响因素6，7，8。因此，质量控制在线粒体中是一个至关重要的问题。线粒体是高度动态的细胞器，能够持续在拉长的网状结构与短小、碎片化的形态之间转换。线粒体动力学在维持线粒体功能以及通过线粒体自噬实现其降解方面发挥着重要作用9。

线粒体自噬是一种利用自噬机制选择性降解完整线粒体的过程。线粒体自噬是线粒体更新以及受损或功能障碍线粒体清除的主要机制。在此过程中，线粒体首先被膜结构包裹，形成自噬体，随后自噬体与溶酶体融合，实现水解降解9。先前在Drosophila中的遗传学研究提示，两个与帕金森病相关的基因——PTEN诱导的假定激酶1（PINK1）（PARK6）和Parkin（PARK2）——在同一条信号通路中发挥作用10,11。后续研究表明，PINK1-Parkin通路负责清除受损的线粒体，该通路的缺陷会导致线粒体自噬功能障碍，并可能参与多种人类疾病的发生12,13。近年来发现，线粒体自噬过程的缺陷存在于多种人类疾病中，包括癌症、心脏病、肝脏疾病和神经退行性疾病14。此外，最近的研究还表明，线粒体自噬在许多生理过程中至关重要，例如细胞分化、发育以及免疫应答15,16,17,18,19，提示线粒体自噬可能在调控细胞功能中发挥更为主动的作用。

尽管最近已证实线粒体自噬（mitophagy）在线粒体质量控制和人类疾病中均发挥重要作用，但其分子机制仍不甚清楚。虽然线粒体自噬相关机制已在酵母中得到系统研究，但针对哺乳动物细胞中线粒体自噬机制的研究主要集中在PINK1-Parkin通路。先前的研究已确立，PINK1-Parkin通路主要负责通过线粒体自噬选择性清除受损的线粒体12,20,21。然而，最近的研究报道，在某些模型中，即使缺乏功能性PINK1，线粒体自噬仍可被激活22,23,24。这些结果提示，除PINK1-Parkin通路外，还存在另一条尚未明确的通路可激活线粒体自噬。

缺乏一种便捷的方法来评估线粒体自噬活性，是探索调控线粒体自噬的通路及其在病理生理过程中的作用的主要障碍。透射电子显微镜是一种可直接观察被自噬体包裹的线粒体的强大工具。然而，电子显微镜在定量分析线粒体自噬活性方面存在局限性。尽管目前最广泛使用的方法是基于微管相关蛋白1轻链3（LC3）偶联的荧光探针策略，例如GFP-LC325基于LC3的信号具有瞬时性，且假阳性信号率较高，这限制了其在细胞中检测线粒体自噬的灵敏度26结合使用蛋白质印迹法检测线粒体蛋白水平、线粒体DNA定量以及荧光显微镜分析线粒体与自噬小体或溶酶体的共定位，是评估线粒体自噬的有效方法。然而，现有方法在定量方面的局限性及操作不便性促使人们寻求新的技术手段。一种新型pH依赖性荧光蛋白——线粒体靶向Keima（mt-Keima）的引入，显著提升了检测线粒体自噬的能力27通过将细胞色素c氧化酶亚基VIII（COX VIII）的线粒体靶向序列与Keima融合，mt-Keima可被靶向至线粒体基质。Keima的激发峰从440 nm（对应pH 7）显著偏移至586 nm（对应pH 4），该特性可用于高灵敏度地检测线粒体自噬，适用于两种 体外 和 体内 实验28,29更重要的是，mt-Keima 对溶酶体降解具有抗性，导致其信号在溶酶体中累积，从而便于对线粒体自噬活性进行定量检测。mt-Keima 的荧光变化可通过共聚焦显微镜或流式细胞术进行分析。28,29然而，迄今为止尚未详细提供基于流式细胞术、利用mt-Keima检测线粒体自噬活性的方法。

本文介绍了一种基于流式细胞术检测细胞中线粒体自噬活性的详细实验方案，该方法利用mt-Keima进行检测。尽管本文已证明流式细胞术能够成功检测表达Parkin的HeLa细胞中由CCCP诱导的线粒体自噬，但该技术可广泛应用于多种不同类型的细胞。

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方案

1. 表达线粒体Keima（mt-Keima）的HeLa细胞的制备

  1. mt-Keima 慢病毒的制备
    1. 向100 mm培养皿中加入2 mL 0.001%的多聚赖氨酸/磷酸盐缓冲液（PBS），室温孵育5分钟，以包被培养皿。
    2. 使用连接真空泵的玻璃移液管吸除多聚赖氨酸溶液，并加入2 mL 1× PBS洗涤培养皿。
    3. 在包被后的培养皿中接种1.5 × 106个HEK293T细胞，加入含10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素/链霉素的10 mL DMEM培养基，于37 °C、CO2细胞培养箱中培养1天。
    4. 根据转染试剂说明书，使用转染试剂将2 µg mt-Keima慢病毒质粒29 DNA与包装质粒DNA（psPAX 2 µg和pVSVG 0.25 µg）共转染，转染时间为8小时。
    5. 移除转染后的培养基，加入8 mL新鲜培养基。
    6. 48小时后收集含有病毒颗粒的培养基。将收集的培养基在500 × g条件下离心5分钟以去除细胞碎片，并用0.45 µm注射器滤器过滤。
      注意：如需长期保存，可将慢病毒颗粒分装后于-80 °C保存。为保证病毒感染效率，应避免反复冻融。
  2. 用mt-Keima慢病毒感染HeLa-Parkin细胞
    1. 在收获mt-Keima慢病毒的前一天，将5 × 104个表达Parkin的HeLa细胞（HeLa-Parkin）接种于60 mm培养皿中，加入含10% FBS和1%青霉素/链霉素的4 mL DMEM培养基，于37 °C培养1天。
      注意：由于HeLa细胞本身不表达内源性Parkin30，因此本实验采用HeLa-Parkin细胞以更清晰地展示CCCP诱导的线粒体自噬。该方法也可适用于其他原代细胞或永生化细胞系。
    2. 次日移除生长培养基，加入1 mL含mt-Keima慢病毒的培养基，并额外加入含3 µL聚凝胺储存液（8 mg/mL，溶于蒸馏水）的2 mL生长培养基。在CO2细胞培养箱中孵育1天。
    3. 次日移除mt-Keima慢病毒混合液，用1× PBS洗涤细胞两次，加入4 mL生长培养基，并加入2 µg/mL嘌呤霉素处理细胞2天。
    4. 嘌呤霉素筛选2天后，移除生长培养基，用1× PBS洗涤细胞两次，更换新鲜生长培养基，将细胞置于CO2培养箱中继续培养，待后续使用。
      注意：该方法可用于构建稳定表达mt-Keima的细胞系，包括其他细胞系及原代细胞。

2. 使用 CCCP 处理诱导线粒体自噬并制备 FACS 样品

  1. 在60 mm培养皿中接种5 × 104个表达mt-Keima的HeLa-Parkin细胞，加入4 mL含10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素/链霉素的DMEM培养基，于37 °C、CO2细胞培养箱中培养1天。
  2. 次日弃去培养基，加入4 mL含10 µM羰基氰化物间氯苯腙（CCCP）的新鲜DMEM培养基，将HeLa-Parkin-mt-Keima细胞置于CO2培养箱中孵育6小时。
  3. 6小时后弃去培养基，用2 mL 1× PBS洗涤细胞，加入胰蛋白酶/EDTA溶液消化使细胞脱落，随后加入含10% FBS的培养基终止胰酶反应，将细胞转移至15 mL锥形离心管中。
  4. 以500 × g离心5分钟。
  5. 小心吸除上清液，用1 mL预冷的1× PBS重悬细胞沉淀。
  6. 将细胞转移至适当的FACS管中，置于冰上。
    注意：以未转染的HeLa细胞作为阴性对照。
    注意：细胞在冰上可保持数小时的活性，mt-Keima荧光信号亦保持稳定。

3. 线粒体自噬的流式细胞术分析

注意：本研究中，使用配备405 nm和561 nm激光器的流式细胞仪对细胞进行分析。细胞同时用紫光激光（405 nm）激发，其发射光通过BV605检测器在610 ± 10 nm波长处检测；同时用黄绿光激光（561 nm）激发，其发射光通过PE-CF594检测器在610 ± 10 nm波长处检测（图1）。

  1. 圈选活细胞
    1. 打开流式细胞仪和计算机，登录分析软件。
    2. 新建一个实验或复制一个已有实验。若需使用紫光（405 nm）和黄绿光（561 nm）激光激发细胞，并在610 ± 10 nm检测器上检测发射光，则在参数窗口中选择BV605和PE-CF594，同时根据需要选择前向散射光（FSC）和侧向散射光（SSC）作为荧光染料。
      注意：所有荧光染料应在参数设置中以线性模式添加。
    3. 将每个细胞样品短暂涡旋震荡，以分散细胞团块。
    4. 将未感染mt-Keima慢病毒的对照HeLa-Parkin细胞样品管置于进样口，按下细胞仪上的 "run" 按钮。
    5. 在FSC与SSC的散点图中，调节FSC和SSC电压，使细胞位于散点图中央。
    6. 使用多边形（Polygon）工具在活细胞周围绘制P1门，排除死细胞和细胞碎片（图2A）。
  2. 调节紫光和绿光激光的电压
    1. 将感染了mt-Keima慢病毒的HeLa-Parkin细胞样品管置于进样口，按下细胞仪上的 "run" 按钮。
    2. 在BV605（405 nm）与SSC的散点图中，调节BV605电压，使表达mt-Keima的HeLa-Parkin细胞与不表达mt-Keima的对照细胞明显区分开（图2B）。
    3. 在PE-CF594（561 nm）与SSC的散点图中，调节PE-CF594电压，使表达mt-Keima的HeLa-Parkin细胞与对照细胞明显区分开（图2B）。
  3. 评估发生线粒体自噬的细胞百分比
    1. 使用线性刻度获取BV605与PE-CF594的散点图。使用多边形工具在表达mt-Keima的细胞周围绘制门控区域，排除不表达mt-Keima的细胞（图3A）。该mt-Keima荧光阳性细胞群称为 "mt-Keima" 门。
    2. 创建另一个仅显示 "mt-Keima" 门控细胞的BV605与PE-CF594散点图。在此图中，围绕未处理的mt-Keima阳性细胞绘制一个门控区域。对照HeLa细胞的基础线粒体自噬活性较低，其PE-CF594/BV605发射光比值小于1，因此该门控区域称为 "low" 门。
    3. 在 "low" 门区域上方绘制另一个门控区域。该门控区域称为 "high" 门，因其包含线粒体自噬活性较高的细胞，即PE-CF594/BV605发射光比值较高的细胞（图3B）。
    4. 为计算位于 "high" 门中的细胞百分比，选择 "Show Population Hierarchy" 菜单。"Percent of Parent"（%Parent）值表示在mt-Keima阳性细胞群中，位于 "high" 门中的细胞百分比。
    5. 在 "mt-Keima" 停止门中设定至少记录10,000个事件，并运行每个样品。

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结果

HeLa-Parkin 细胞中由 CCCP 诱导的线粒体自噬流式细胞术分析示例见图4。采用上述流式细胞术分析方法，我们可检测到“高”门控区域中发生线粒体自噬的细胞数量显著增加。与未处理的对照细胞相比，“高”门控区域中的细胞比例增加了10倍以上（图4A）。共处理巴佛洛霉素A（BFA）后，线粒体自噬活性的这一增加被完全抑制（图4A 和 4B）。

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讨论

本文介绍了一种利用流式细胞术快速、灵敏地检测表达mt-Keima的细胞中线粒体自噬活性的方法。经历高水平线粒体自噬的细胞表现出更高的PE-CF594（561 nm）/BV605（405 nm）激发光比率。因此，线粒体自噬活性可表示为具有高561/405比值的细胞百分比。我们计算了在PE-CF594（561 nm）与BV605（405 nm）的散点图中位于"高"门区的细胞百分比，结果显示，CCCP处理可诱导HeLa-Parkin细胞中线粒体自噬的增加。我们先前已证实，通过慢病毒介导的mt-Keima过表达本身不会影响线粒体功能或细胞生理状态31。尽管我们在论文中展示了流式细胞术能够成功检测表达Parkin的HeLa细胞中由CCCP诱导的线粒体自噬，但该技术在引入mt-Keima后可适用于任何类型的细胞。我们此前还证明，在无需外源性表达Parkin的情况下，也可在HeLa细胞中检测到缺氧诱导的线粒体自噬29。此外，包括我们团队及其他研究小组在内的先前研究均表明，mt-Keima荧光分析可用于检测原代细胞（如小鼠胚胎成纤维细胞，ME...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作由韩国国家研究基金会资助（2016R1D1A1B03931949）（资助对象：J. U.），以及由韩国国家研究基金会（NRF）根据韩国政府（MSIT）资助的项目（编号：2016R1A2B2008887，编号：2016R1A5A2007009）（资助对象：J.Y.）提供支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
试剂
poly-L-lysineSigma-AldrichP2636
FBSGIBCO16000-044
青霉素/链霉素wellgeneLS202-02
PBSHycloneSH30013.02
HEK293TATCCCRL-3216
DMEMGIBCO12800-082
OPTI-MEM GIBCO31985-070
TurbofectThermos scientificR0531
0.45 μm 注射器滤器sartorius16555
HeLaATCCCCL-2
polybreneSigma-AldrichH92688 mg/ml
嘌呤霉素Sigma-AldrichP88332 mg/ml 
羰基氰基间氯苯腙（CCCP）Sigma-AldrichC275910 mM
胰蛋白酶-EDTAwellgeneLS015-01
仪器
BD LSRFortessaBD BioscienceLSRFortessa
FACSDIVABD BioscienceFACSDIVA (v8.0.1)

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