介绍了一种基于阴离子交换树脂的方法，该方法适用于基于液体冲击的生物气溶胶病毒采样。当与下游分子检测技术联用时，该方法可实现对生物气溶胶中病毒的简便且灵敏的检测。
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本文内容
摘要
摘要
本方案展示了一种针对病毒的定制化生物气溶胶采样方法。该系统将阴离子交换树脂与基于液体冲击式空气采样装置相结合，可高效地从生物气溶胶中富集带负电荷的病毒。因此，树脂在生物气溶胶采样流程中起到了额外的浓缩作用。随后可直接从阴离子交换树脂中提取病毒颗粒的核酸，所得样品适用于分子分析。此外，本方案还描述了一种自行构建的生物气溶胶舱，可在多种环境条件下生成含病毒的生物气溶胶，并实现对温度、湿度、风速和气溶胶质量浓度等环境参数的连续监测。采用本方案的主要优势在于提高了病毒检测的灵敏度，这一点已通过与未经改良的传统液体冲击式采样器的直接比较得到验证。其他优势包括能够富集多种带负电荷的病毒、阴离子交换树脂成本低廉（每样本约0.14美元）以及操作简便。该方案的局限性在于无法评估树脂吸附后病毒颗粒的感染活性，且可能需要对冲击式采样器中使用的液体采样缓冲液进行优化。
引言
本方法旨在提供一种高灵敏度的生物气溶胶采样平台，以促进从生物气溶胶中对带负电的病毒进行分子检测。包括病毒颗粒在内的微生物可在生物气溶胶中存活较长时间1。生物气溶胶可传播相对较远的距离，并保持其活性和感染性，例如有证据表明，一起军团菌病暴发起源于距离受影响人群6公里远的工业冷却塔，并导致18人死亡2。通过生物气溶胶介导的病毒间接传播可在多种环境中发生，已在学校和餐厅的诺如病毒暴发事件中得到证实3,4。类似地，在养猪场和家禽养殖场等农业环境中也可能发生病毒的生物气溶胶传播，该传播途径被认为是病毒在不同生产设施之间扩散的主要因素之一5,6,7,8,9。
对含病毒的生物气溶胶进行有效采样，有助于提升快速诊断能力以及加强疫情暴发的预防准备。例如，在中国和美国的活体动物市场中，已通过实验证明可从生物气溶胶中检测到H5亚型甲型流感病毒
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方案
1. 生物气溶胶室的设置（见图2）
- 在液体冲击式采样器中预先加入 20 mL 浓度为 0.01 M、pH 7.5 的磷酸盐缓冲液（PBS）。
- 向其中一个液体冲击式采样器的 PBS 中加入 0.5 g 阴离子交换树脂并使其悬浮，另一个液体冲击式采样器作为对照。
- 使用夹具支架将液体冲击式采样器并排置于生物气溶胶舱内，采样器进气口朝向雾化器。
注：更多细节请参见 图2。 - 在液体冲击式采样器附近同时放置一台直接读数气溶胶监测仪，用于测量生物气溶胶的质量浓度（mg/m3）。
- 在液体冲击式采样器附近同时放置其他直接读数仪器（室内空气质量监测仪和热式风速计），用于监测生物气溶胶舱内的环境参数，如温度、相对湿度和风速。
- 启动生物气溶胶舱角落处的轴流风扇，以促进气溶胶的混合。
注：轴流风扇以固定转速运行，不可调节。
2. 模拟生物气溶胶实验（见图3）
- 用磷酸盐缓冲液（PBS）将MS2噬菌体和流感疫苗进行连续10倍梯度稀释，至所需浓度。
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结果
图1 通过在基于液体的冲击式采样器中加入树脂，演示了利用电荷原理从生物气溶胶中捕获病毒的方法。 图2 展示了自行搭建的生物气溶胶舱的设置。 图3 描述了建立气溶胶化实验的步骤以及确保质量控制的措施。 图 4 显示从生物气溶胶中捕获的带负电病毒经qRT-PCR检测的扩增曲线。 表1 显示了本研究中所用示例病毒进行qRT-PCR检测时使用的引物和探针。
利用流感疫苗中的MS2病毒和流感病毒作为定制生物气溶胶室中的模型，经阴离子交换树脂改良的液体冲击式采样器相较于直接检测冲击液，病毒检出率提高了约3倍至9倍，具体提升倍数取决于特定病毒22。如.......
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讨论
本方案介绍了一种利用改良液体冲击式采样器对生物气溶胶中病毒进行高灵敏度捕获的方法。该方法经过优化，适用于生物气溶胶中病毒载量的检测与定量。此处展示的具体改进是在常用液体冲击式采样器所含液体中添加阴离子交换树脂。该方法的优势在于下游样品处理过程简便，而其他样品处理技术（如离心、过滤和基于沉淀的方法）则不具备这一优点。核酸可直接从树脂中提取，无需大体积洗脱和多个样品前处理步骤，从而通过降低有效样品体积显著提高方法的检测灵敏度。此外，已有研究表明，将病毒颗粒固定于固相表面有助于增强病毒核酸的稳定性或维持病毒的感染性17,25。固定化还可能通过减少再气溶胶化导致的损失，进一步提高捕获效率16。该方法可便捷地与下游分子分析技术联用（本文展示了qRT-PCR的应用）。阴离子交换树脂可在现场采集后单独运送至参考实验室进行分析，而空气采样设备则可继续固定用于采样区域的监测。由于该方法的原理是基于非特异性捕获具有净负表面电荷的病毒，因此预期可适用于多种对人类健康和兽医学具有重要意义的致病性病.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作获得了美国疾病控制与预防中心/国家职业安全卫生研究所高地平原山地农业健康与安全中心（5U54OH008085）以及科罗拉多生物科学发现评估资助计划（14BGF-16）的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Escherichia coli 噬菌体 MS2（ATCC 15597-B1） | 美国典型培养物保藏中心 | ATCC 15597-B1 | |
| FluMist 四价流感疫苗 | 阿斯利康 | 联系制造商 | 该疫苗的病毒成分可能每年发生变更 |
| CFX96 Touch 实时荧光定量 PCR 检测系统 | Bio-Rad | 1855195 | |
| 引物和探针 | Integrated DNA Technologies | NA | |
| 0.2 µM 无菌滤器 | NA | NA | |
| 1 L 耐热玻璃瓶或等效容器 | NA | NA | |
| 1 mL 移液器吸头 | NA | NA | |
| 1 mL 移液器 | NA | NA | |
| 50 mL 血清移液管 | NA | NA | |
| PCR 管 | NA | NA | |
| 移液辅助器或等效设备 | NA | NA | |
| QIAamp 病毒 RNA 小量提取试剂盒 | Qiagen | 52904 | |
| QuantiTect 探针一步法 RT-PCR 试剂盒 | Qiagen | 204443 | |
| Amberlite IRA-900 氯化物形式 | Sigma-Aldrich | 216585-500G | |
| 磷酸盐缓冲液 | Sigma-Aldrich | P5368-10PAK | |
| 水（分子生物学级） | Sigma-Aldrich | W4502-1L | |
| Eppendorf DNA LoBind 微量离心管 | ThermoFisher | 13-698-791 | |
| Falcon 50 mL 圆锥形离心管 | ThermoFisher | 14-432-22 | |
| Falcon 聚丙烯离心管 | ThermoFisher | 05-538-62 | |
| SuperScript III Platinum 一步法 qRT-PCR 试剂盒（含 ROX） | ThermoFisher | 11745100 | |
| SKC 生物采样器 20 mL，三件套玻璃组件 | SKC 公司 | 225-9593 | |
| Vac-u-Go 样品泵 | SKC 公司 | 228-9695 | |
| Collison 雾化器（六喷嘴） | BGI 公司 | NA | |
| HEPA 滤芯 | PALL | 12144 | |
| Q-TRAK 室内空气质量监测仪 8554 | TSI 公司 | NA | |
| Alnor velometer 热式风速计 AVM440-A | TSI 公司 | NA | |
| SidePak AM510 个体气溶胶监测仪 | TSI 公司 | NA | |
| 生物气溶胶实验舱 | NA | NA |
参考文献
- Pirtle, E. C., Beran, G. W. Virus survival in the environment. Revue scientifique et technique (International Office of Epizootics). 10 (3), 733-748 (1991).
- Nguyen, T. M., et al. A community-wide outbreak of legionnaires disease linked to industrial cooling towers--how far can contaminated aerosols spre....
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重印与许可
