肠嗜铬（EC）细胞是胃肠道上皮细胞中的一个小亚群。EC细胞具有电兴奋性并可释放5-羟色胺，然而由于在培养和鉴定EC细胞方面存在困难，其生理学研究受到限制。本文所介绍的方法建立了一种适用于通过电生理学技术对单个EC细胞进行检测的原代培养模型。
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本文内容
摘要
摘要
胃肠道（GI）上皮中的肠嗜铬（EC）细胞是肠内分泌细胞中数量最多的亚群。作为特化的感受细胞，EC细胞能够感知管腔内的刺激，并将其转化为5-羟色胺（5-羟基色胺，5-HT）的释放事件。然而，这些细胞的电生理特性尚不明确，因其难以培养且不易识别。本文介绍的方法建立了一种优化用于单细胞电生理研究的原代EC细胞培养体系。该方案利用一种转基因的青色荧光蛋白（CFP）报告系统，在混合的原代培养细胞中识别小鼠EC细胞，从而改进了在电压钳和电流钳模式下获取高质量全细胞电生理记录的技术途径。
引言
胃肠道（GI）上皮由多种细胞类型组成，是一个多样化的细胞群。肠内分泌细胞约占所有上皮细胞的1%，而肠嗜铬（EC）细胞是数量最多的肠内分泌细胞亚群1。近期研究表明，肠内分泌2和EC3,4细胞具有电兴奋性。我们致力于研究原代EC细胞的电生理特性。因此，本研究的目的是建立适用于全细胞电生理记录的优化原代EC细胞培养体系。
目前已有的肠嗜铬（EC）细胞系能够产生并分泌5-羟色胺（5-HT）（例如， QGP-15、BON6、KRJ-17），并已被用于研究电生理学特性5,8，但这些细胞系通常来源于永生化的肿瘤组织。尽管从这些细胞系获得的信息具有重要价值5,8，但仍需开展对原代细胞的电生理学研究，才能更准确地理解EC细胞的生理功能。对原代EC细胞进行电生理学研究需要分离并培养单个....
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方案
本文所述所有方法均已获得梅奥诊所机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。本实验方案中的原代细胞培养部分基于此前已发表的方法，更多细节可参考相关文献10。所有实验操作必须经过机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准，并且所有实验均须依照相关指南和法规进行。
1. 培养物制备
- 培养基
- 使用高糖[4500 mg/L] Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM），添加5%胎牛血清（FBS）、1% L-谷氨酰胺和1%青霉素-链霉素，配制EC细胞完全培养基表1).
注意：培养基可在 4 °C 下保存长达一个月。 - 过滤EC细胞完全培养基，取25 mL培养基于37 °C条件下加入50 mL离心管中。
- 使用高糖[4,500 mg/L] DMEM培养基，并添加0.1%牛血清白蛋白（BSA），配制消化液表1).
- 将消化液过滤，并取四份10 mL的滤液分别加入四个50 mL离心管中，置于37 °C水浴中孵育。
注意：培养基可在 4 °C 下保存长达一个月。
- 使用高糖[4500 mg/L] Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM），添加5%胎牛血清（FBS）、1% L-谷氨酰胺和1%青霉素-链霉素，配制EC细胞完全培养基表1).
- 酶
- 称取4 mg（空肠）或24 m....
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结果
培养物：
来自转基因 Tph1-CFP 模型的原代小鼠上皮细胞在 4 小时后贴附于培养皿，24 至 72 小时之间即可用于生理学实验。在培养条件未优化时，上皮细胞培养物呈现大块细胞团、漂浮的细胞碎片、破损的细胞膜，以及肠嗜铬细胞中微弱的 CFP 信号（图 1A）。经优化用于电生理实验的培养物则主要由单个细胞和小团细胞组成。健康的肠嗜铬细胞可通过明亮的 CFP 荧光轻松识别，并在剧烈洗涤后仍牢固贴附于培养皿表面（图 1B）。
电生理学
在未添加ROCK抑制剂的结肠培养物中，仅在15 ± 4%的尝试中获得了EC全细胞（22个培养物共182次尝试中获得29个全细胞），而在添加ROCK抑制剂的.......
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讨论
要完全理解肠嗜铬细胞（EC细胞）的功能，需要一种高质量的原代培养方法，以获得适用于全细胞膜片钳电生理实验的细胞。传统上，胃肠道上皮细胞的原代培养因细胞存活率低而存在困难。本方法克服了这一干扰因素，能够从小肠或大肠组织中分离出单个EC细胞，并使其存活数天。
我们发现，以下因素对于提高培养物质量以适用于电生理学实验至关重要：（1）将黏膜翻转而非剥离，（2）在消化液中添加少量 BSA 及在培养液中添加 FBS，（3）降低 XI 型胶原酶的浓度，（4）调整机械振荡的持续时间与强度以增加单细胞的数量和活力，（5）以较低浓度包被细胞外基质，以及（6）添加 ROCK 抑制剂进行培养。
类似地，在进行膜片钳实验以获得完整细胞时，以下改进措施至关重要：（1）用无血清的细胞外溶液彻底冲洗培养物；（2）让肠嗜铬细胞在细胞外溶液中静置至少4小时；（3）将已使用过的电极（如形成封接失败的电极）重新利用，以清除通向下一个肠嗜铬细胞路径上的碎片；（4）在细胞外溶液中添加10 µM Gd3+，以阻断漏电流（如果存在），并促进哺乳动物细胞.......
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致谢
作者感谢Lyndsay Busby女士提供的行政协助，以及梅奥诊所工程部Robert Highet先生在培养皿插件设计与3D打印方面的帮助。本研究由NIH K08基金（DK106456）资助AB，梅奥诊所胃肠道细胞信号转导中心（NIH P30DK084567）向AB提供试点与可行性资助，AB还获得2015年美国胃肠病学会研究学者奖（AGA RSA），GF获得NIH R01基金（DK52766）资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 100 mm × 15 mm 培养皿 | Corning (Falcon) | 351029 | |
| 移液管 | Fisherbrand | 13-711-7M | |
| 10 mL 血清移液管 | Corning (Falcon) | 357551 | |
| 50 mL 锥形离心管 | Corning (Falcon) | 352098 | |
| 15 mL 锥形离心管 | Corning (Falcon) | 352097 | |
| 1,000 µL 带滤芯移液器吸头 | Thermo Scientific (Art) | 2079E | 保持无菌 |
| MatTek 玻底培养皿 | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C | 保持无菌 |
| 显微解剖镊子——极细、超长尖端 | Fine Science Tools | SB12630M | |
| 手术剪刀——锋利型 | Nasco | 14002-14 | |
| 显微解剖剪刀 | Nasco | SB46568M | |
| Monoject 低容量注射针头，21 G × 1" A，每盒100支 | Covidien | 8881250172 | |
| Tg(Tph1-CFP)1Able/J 小鼠 | Jackson | 库存编号 # 028366 | 使用4至7周龄的雄性或雌性小鼠 |
| Microfil 非金属注射器针头（34号，67 mm） | World Precision Instruments | MF34G-5 | |
| Parafilm "M" 实验室封口膜 | Pechiney Plastic Packaging | ||
| R6101 | Dow Corning | ||
| 6 mL 带标准鲁尔接头的注射器 | Monoject | ||
| 3 mL 带标准鲁尔接头的注射器 | Monoject | ||
| 电生理设备 | |||
| 放大器 | Molecular Devices | Axopatch 200B | |
| 数据采集系统（daq） | Molecular Devices | Digidata 1440A | |
| 信号调节器 | Molecular Devices | CyberAmp 320 | |
| 软件 | Molecular Devices | pClamp 10.6 |
参考文献
- Rindi, G., Leiter, A. B., Kopin, A. S., Bordi, C., Solcia, E. The "normal" endocrine cell of the gut: changing concepts and new evidences. Annals of the New York Academy of Sciences. 1014, 1-12 (2004).
- Rogers, G. J., et al.
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重印与许可
