基于平板的大规模培养 秀丽隐杆线虫糖尿病代谢改变研究的样本制备

摘要

本方案描述了一种在固体培养基上大规模培养秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）的方法。作为液体培养的替代方案，该方法可在基于培养皿的培养条件下获得不同规模的实验参数。通过消除液体培养与固体培养之间在形态学和代谢上的差异，提高了实验结果的可比性。

摘要

在琼脂平板上大规模培养秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans，C. elegans）可能耗时且困难。本实验方案描述了一种简单且低成本的方法，可用于获得大量线虫个体，以提取蛋白质并进行蛋白质印迹（western blot）、质谱分析或进一步的蛋白质组学研究。此外，该方法还可轻松实现线虫数量的增加，以满足免疫染色需求，并在相同培养条件下整合多种分析。同时，该方法也便于在不同实验条件的平板之间进行转移。常规的平板培养技术通常使用铂金丝转移单个C. elegans，或使用解剖刀转移带有线虫的琼脂块。然而，随着线虫数量的增加，这些方法变得极为耗时。本方案详细介绍了C. elegans的大规模培养流程，包含多个关键步骤，旨在最大限度地减少样品制备过程对线虫生理状态的影响。液体环境和剪切应力可能改变C. elegans的寿命及其代谢过程，因此必须详细描述关键操作步骤，以确保获得可靠且可重复的实验结果。C. elegans是一种模式生物，其神经元细胞可占细胞总数的三分之一左右，且缺乏血管系统，因此可用于独立于血管调控机制之外的神经元变化研究。近期研究发现，在糖尿病视网膜病变中，神经退行性改变早于血管结构的变化。因此，C. elegans在研究糖尿病并发症的普遍机制方面具有特殊意义。例如，在C. elegans中可观察到晚期糖基化终末产物（AGEs）和活性氧（ROS）的生成增加，这些现象在糖尿病模型中具有良好的可重复性。本文提供了适用于多种研究目的的大规模样品处理方案，并以糖尿病诱导的生化改变研究为例进行说明。总体而言，本方案适用于需要大量C. elegans且不适合采用液体培养的研究。

引言

蛋白质分析（如蛋白质印迹或质谱分析）需要毫克级的蛋白质。要达到这一产量，需大规模培养数百份 C. elegans，可通过液体培养或在固体培养基上通过冲洗转移线虫来实现。液体环境及剪切应力可诱导上皮钠离子通道（ENaC）的表达，从而通过增加钠离子的摄取增强渗透压，可能改变 C. elegans 的寿命并影响代谢分析结果¹。因此，本实验方案中基于平板培养的方法包含若干关键步骤，旨在减少应激反应，以降低实验变异性。另一方面，液体培养会影响线虫的表型，并使精确数量线虫的培养与收集变得复杂²。此外，活性物质可能被培养基成分改变，并在到达线虫前分布不均。鉴于液体培养的上述局限性，本方案提供了一种大规模培养 C. elegans 的替代方法。

C. elegans 是一种模式生物，具有由302个神经元细胞组成的独特神经网络，占其全部细胞的三分之一³。自其进入科学研究以来，已发现大量同源和直系同源基因，进一步提升了其作为医学研究模型的价值。最近有研究提出，在糖尿病视网膜病变中，神经功能损伤早于血管损伤出现⁴。C. elegans 虽无血管系统，但具备明确的神经网络，因此是研究非血管性神经改变的理想模型。因此，C. elegans 在探索糖尿病并发症普遍机制方面具有特殊意义。糖尿病并发症中的生化改变涉及晚期糖基化终末产物（AGEs）的形成，这些产物进一步影响高血糖条件下活性氧（ROS）的生成⁵。AGEs 在 C. elegans 中已被检测到，并可导致神经损伤⁶。慢性疾病通常由复杂的多基因过程引起，需要采用多参数方法来评估其潜在机制，本文以糖尿病并发症的评估为例说明了这一点。本实验方案可用于同时或依次获取多个参数。通过避免液体与固体培养基在形态和代谢上的差异，可提高多参数方法的可比性和可重复性。

方案

注意：本方案分为五个部分。在第1至第3部分中，为主培养方案 秀丽隐杆线虫 大规模培养方案已呈现。第4和第5节提供了针对糖尿病相关代谢物中典型代谢物检测的附加实验方案。具体而言，第1节描述了基于培养板的通用大规模培养方法；第2节重点介绍了大量样品的转移操作 秀丽隐杆线虫而第3节介绍了大规模样品的收获，第4节说明了样品中蛋白质的分离，第5节描述了后续液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析的样品制备。

1. 培养皿中的大规模培养

1. 通常在无菌操作台内或靠近火焰旁操作，以避免污染。
2. 为了将线虫培养至年轻成虫阶段，请遵循此先前发表的方案⁷ 并作如下调整。
   1. 使用活体 大肠杆菌 用于喂养线虫的OP50细菌，以及为实验准备400 µM氟脱氧尿苷琼脂（非氨苄青霉素/FUdR）。
   2. 为制备同步化种群，使用未浓缩的OP50；在后续成虫实验中，通过去除70%上清液，使用3.3倍浓缩的OP50。
   3. 建议每日定时喂食。在评估氧化应激时，不同的喂食间隔和喂食量可能会影响实验结果。
   4. 接种时，取一块含有多个线虫的平板，将其切成约 0.5 x 1 cm 的小片² 用解剖刀切取两到三块，转移至直径为60 mm、含有未浓缩OP50的大肠杆菌的线虫生长培养基（NGM）平板上。
   5. 将培养皿置于适合该品系的温度下孵育（野生型N2应在20 °C下培养），直至在培养皿上可见卵。
   6. 洗去大部分卵和成体动物 用2 mL M9缓冲液重悬并收集至15 mL离心管中。将悬液在800 x g 2 分钟。同时，开始配制漂白液。
   7. 取出离心管，用10 mL移液器吸除M9缓冲液。加入10 mL漂白液，涡旋混匀，直至成年线虫完全裂解。此过程通常约需5–7分钟，但不应超过15分钟，否则后续实验中卵将无法充分发育。
   8. 将悬液在800 x g 2分钟。用10 mL M9缓冲液洗涤3次，以去除卵子上的漂白液。
   9. 现在在 OP50 平板上加入 150 µL 卵悬浮液，每个平板应达到 200–300 个卵的密度。等待线虫发育至成虫阶段。
      注意：图示实验所用的M9缓冲液（pH 7.0）包含以下物质：22 mM KH₂PO₄，42 mM Na₂HPO₄，以及 86 mM NaCl。将混合物高压灭菌后，加入 1 mM MgSO4。漂白液包含 0.5 M NaOH 和 2.3 mM NaOCl，溶于蒸馏水中。
   10. 准备无菌M9缓冲液、尖端剪开的无菌移液器吸头用于冲洗线虫，以及15 mL离心管用于收集线虫。
   11. 在平板上加入约 1 mL M9 缓冲液， 轻轻晃动以分配缓冲液，并用移液器轻柔吹打 线虫从培养皿上脱落。
   12. 现在，将线虫收集到离心管中。用剪去尖端的移液器吸头吸取150 µL悬浮液，直接加到已接种OP50的培养板上，并在显微镜下评估线虫密度（建议：每60 mm培养板接种50–100条线虫）。
   13. 如果悬液过浓，用M9缓冲液稀释，并在显微镜下观察，直至达到理想密度。如果收获量过少，让线虫自然沉降，或以800 × g离心悬液10秒。 g 去除液体。
       注意：充分密度的一个示例如下所示 图1A （宏观）和 1B （显微镜下）20倍放大观察。按所述方法进行经验性操作。
   14. 请注意，线虫会迅速沉降。为确保各培养皿间虫体分布均匀，每处理一叠培养皿（4–5个）后，需将管子颠倒混匀一次。
       注意：使用剪去尖端的移液管吸头，以及轻柔振荡和洗涤培养板，可降低剪切应力。

2. 大量转移Caenorhabditis elegans

1. 用约 500 µL M9 缓冲液冲洗线虫，具体用量根据平板的年龄和干燥程度而定。使用相同的缓冲液重复冲洗，直至大部分线虫被收集到 悬浮液
2. 用剪切过的移液器吸头缓慢吸取线虫，转移至已涂布OP50的培养皿上。让培养皿自然晾干。
   注意：切勿加入超过推荐体积的液体。尤其在长期实验中，培养板可能无法承受过多液体，导致琼脂破裂，使线虫钻入裂缝中。

3. 大量收获 秀丽隐杆线虫 样本

1. 根据所选方法，使用足量的 C. elegans 开始实验。进行 LC-MS/MS 分析时，每组准备 20 个培养板（60 mm × 15 mm），每个板上约含 100 条线虫，以确保每个样本获得至少 200 µg 的蛋白质。
   注意： 本步骤无需在无菌条件下操作，因为线虫将被收集并冷冻。 
2. 在样品采集当天，准备好液氮用于快速冷冻收集的样品。将非无菌 M9 缓冲液置于冰上，以减缓线虫的新陈代谢。
3. 通过加入 1 mL M9 缓冲液并轻轻旋转培养板，将 C. elegans 从板上冲洗下来。此操作可避免收集到死亡的线虫及大部分虫卵（如有），因为它们会黏附在细菌和琼脂上。
4. 吸取液体体积并转移至 15 mL 离心管中。
5. 完成全部样品收集后，静置使线虫沉淀，或在 800 × g 条件下短暂离心，并去除大部分 M9 缓冲液。用约 10 mL M9 缓冲液（约为样品体积的 10 倍）洗涤样品 3 次，以去除所有细菌。
   注意：为确保彻底去除死亡线虫，可选择蔗糖漂浮法。然而，在本展示实验中该方法不适用¹⁵。蔗糖会水解为葡萄糖和果糖。在本实验中，研究目的是评估葡萄糖在慢性糖尿病相关生化改变中的作用，因此使用蔗糖漂浮法可能干扰实验结果。
6. 为每个样品准备一个含有 1 mL M9 缓冲液的 1.5 mL 离心管和一个空的 1.5 mL 离心管。使用玻璃移液管 将沉淀从 15 mL 离心管转移至空的 1.5 mL 离心管中。此步骤至关重要，以确保定量转移。
   注意：与之前步骤不同，此处线虫浓度更高。由于塑料移液管 吸头可能存在黏附现象，可能导致大量样品损失。因此，应使用玻璃移液管。
7. 转移完成后，使用玻璃移液管从第二个 1.5 mL 离心管中吸取 1 mL M9 缓冲液，冲洗移液管壁上的线虫。同时，将残留在 15 mL 离心管中的线虫冲洗并转移至样品管中。
8. 将样品管在 19,000 × g 条件下离心 1 分钟，然后尽可能去除上清液。
9. 用封口膜密封离心管，并立即在液氮中快速冷冻。将样品管保存于 -80 °C，直至进行裂解液制备。

4. 用于质谱分析的蛋白质分离

注意：此处所述的蛋白质分离方法也可用于其他检测（例如，蛋白质印迹）。

1. 向冷冻样品中加入等体积的0.5 mm氧化锆 珠粒，以及至少2倍体积 的含有蛋白酶抑制剂混合物的裂解缓冲液。
   注意：图示的线虫-蛋白相关性分析使用了100 µL缓冲液。LC-MS/MS样品则使用200 µL缓冲液进行裂解。
2. 以9号速度启动匀浆器，持续1分钟。确保样品完全裂解。若裂解不完全，重复此步骤。
3. 在4 °C条件下，以19,000 × g离心30分钟。将上清液转移至冰上的新离心管中，并在-80 °C保存，直至进行后续检测。
   注意：图示实验所用的非变性缓冲液包含以下成分：20 mM Tris HCl（pH 8）、137 mM NaCl、1% Triton-X和2 mM EDTA。
   注意：按照本方案步骤并采用建议的规模操作后，约1,000条线虫可获得约500 µg的蛋白沉淀。更多比较信息请参见图2和代表性结果部分。

5. 液相色谱-串联质谱检测的样品制备

注意：根据所关注的参数不同，样品制备方法也会有所不同。本方案重点针对甲基乙二醛和晚期糖基化终末产物（AGE）的测定。

1. 采用邻苯二胺（DB）衍生化法测定细胞内甲基乙二醛，方法如前所述⁹。
   1. 在1.5 mL离心管中，将样品与20 µL预冷的20%（wt/vol）三氯乙酸、0.9%（wt/vol）氯化钠及80 µL水混合匀浆。
   2. 向样品中加入5 µL内标（¹³C₃-MG；400 nM），涡旋混匀，随后在4 °C下以21,000 × g离心5分钟。
   3. 将35 µL上清液转移至含有200 µL玻璃插件的HPLC样品瓶中。
   4. 每份样品中加入5 µL 3%叠氮化钠（wt/vol），随后加入10 µL含0.5 mM二乙烯三胺五乙酸（DETAPAC）的0.5 mM DB盐酸溶液（200 mM HCl，溶于水）。
   5. 将样品在室温下避光孵育4小时。
   6. 采用LC-MS/MS分析样品，方法如前所述⁹。
      注：如需测定晚期糖基化终末产物（AGEs），请按照本方案第4节所述方法分离蛋白质。
2. 使用Bradford法测定（解冻后）裂解液的蛋白浓度¹⁰。
   1. 配制含牛血清白蛋白（BSA）的标准曲线样品，用磷酸盐缓冲液（PBS）将BSA稀释至以下浓度：0；0.1；0.2；0.3；0.4；0.6；0.8；和1.0 mg/dL，每份取30 µL备用。
      注：若样品按推荐体积制备（参见步骤4.1中使用200 µL缓冲液制备裂解液），预计蛋白浓度约为2–7 mg/mL。此时，应在测定前用PBS将样品稀释1:10。
      注：首次使用该方法时，建议对样品进行不同稀释度（1、1:10和1:100）的测定。由于线虫数量无法精确确定，不同研究人员之间的蛋白得率可能存在差异。
   2. 使用透明的96孔板（聚苯乙烯材质），将各标准品及按选定稀释度处理的样品各取10 µL，每组设两个复孔，加入相应孔中。
   3. 将蛋白测定染料试剂浓缩液用蒸馏水（aq. dest.）按1:5稀释，每孔加入200 µL稀释后的试剂，室温孵育10分钟。
   4. 在30分钟内使用酶标仪于595 nm波长处测定吸光度，根据标准曲线对样品浓度进行插值计算。该方法的更多细节已在文献中广泛描述¹⁰。
3. 细胞内晚期糖基化终末产物（AGEs）的测定方法如前所述^11,12。
   1. 将总蛋白提取物（约200 µg）用10 kDa超滤离心管，在水中通过超速离心洗涤3次。
   2. 向回收的蛋白样品（约100 µL）中加入10 µL 100 mM HCl、10 µL胃蛋白酶（2 mg/mL，溶于20 mM HCl）和10 µL百里酚（2 mg/mL，溶于20 mM HCl），37 °C孵育24小时。
   3. 加入12.5 µL 0.5 M磷酸钾缓冲液（pH 7.4）和5 µL 260 mM KOH，将样品中和并调节至pH 7.4。
   4. 加入10 µL蛋白酶E [2 mg/mL，溶于10 mM磷酸钾缓冲液（pH 7.4）] 和10 µL青霉素-链霉素溶液，37 °C孵育24小时。
   5. 加入10 µL氨肽酶 [2 mg/mL，溶于10 mM磷酸钾缓冲液（pH 7.4）] 和10 µL脯氨酰二肽酶 [2 mg/mL，溶于10 mM磷酸钾缓冲液（pH 7.4）]，37 °C孵育48小时。
   6. 采用LC-MS/MS分析所得水解产物，方法如前所述¹²。

结果

本文展示了用于糖尿病研究的大规模 C. elegans 培养的示例。在某些情况下，将实验参数与单个动物关联可能比归一化至总蛋白浓度更具意义。在仅需少量线虫的实验中，可通过直接计数线虫实现该目的。然而，对于每个实验组包含数百条线虫的大规模 C. elegans 培养，这种方法则不够便捷。图2 展示了 C. elegans 数量与蛋白含量之间的相关性。如图所示，采用本方案可实现可重复的定量蛋白提取。

Amadori 加合物果糖基-赖氨酸是糖尿病实验动物模型中形成的多种晚期糖基化终末产物（AGE）前体之一¹³。图3展示了三次独立实验中，12日龄线虫经葡萄糖处理后及其年龄匹配的未处理对照组的LC-MS/MS检测结果。线虫加入200 µL裂解缓...

讨论

本方案介绍了一种用于大规模培养的可靠方法 秀丽隐杆线虫 以获得定量结果。文献中的研究发现可被重复验证，如图所示。 代表性结果. 尽管该大规模样本采集方案 秀丽隐杆线虫 看似是一种直接的方法，但有一些潜在问题需要注意。关于线虫群体的同步化，本方案描述了一种使用次氯酸钠和氢氧化钠进行漂白的方法，以杀死线虫并仅收获卵。需要注意的是，这种方法可能并不适用于所有实验。根据群体数量与漂白液体积的比例，漂白液的有害作用可能会影响胚胎的发育。¹⁵尤其是在研究发育过程时，这可能是一个关键步骤。在处理线虫时，整个实验过程中应尽可能减少剪切力的施加。若操作不慎，将导致大量线虫死亡。因此，离心时间和速度不得超出建议范围。在转移线虫时，应使用剪去尖端的移液枪头，以减少对线虫的损伤。转移线虫时，所用缓冲液体积不应超过推荐量，否则琼脂会因过湿而开裂，导致线虫钻入培养皿内部。在收集样品过程中，M9缓冲液必须始终保持冰上预冷，以减缓线虫的代谢速率，特别是在处理代谢物或底物时更应注意这一点。 秀丽隐杆线虫 会降解。彻底清洗样品以尽量减少先...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
E. coli OP50	CGC	n/a
C. elegans N2	CGC	n/a
C. elegans CL2166	CGC	n/a
培养皿，60 mm × 15 mm	Greiner One	628161
玻璃刻度移液管，10 mL	Neolab	E-0413
蛋白酶抑制剂混合片剂	Roche	04693124001
非变性裂解缓冲液：
Tris-HCl，pH 8	Sigma	T3253
氯化钠（NaCl）	Sigma	S7653
Triton X-100	Sigma	X-100
乙二胺四乙酸（EDTA）	Sigma	E5391
96孔板，透明底	Brand	781611
Infinite M200 酶标仪	Tecan	30017581
氧化锆珠，0.5 mm	Next advance	ZROB05-RNA
Bullet Blender 匀浆器	Next advance	BBX24
猪胃黏膜来源胃蛋白酶	Sigma	P6887
百里酚	Sigma	T0501
链霉菌蛋白酶 E / 来源于Streptomyces griseus 的蛋白酶	Sigma	P6911
青霉素-链霉素溶液	Sigma	P43339
猪肾来源脯氨酰二肽酶	Sigma	P6675
氨肽酶，来源于Aeromonas proteolytica	Sigma	A8200
Amicon Ultra-0.5 离心过滤装置	Merckmillipore	UFC501096
平板培养所需的基本材料详见参考文献6。