小鼠闭合性股骨骨折的建立：一种用于研究骨愈合的模型

摘要

小鼠闭合性股骨骨折模型是研究骨折愈合及加速骨再生新型治疗策略的有力平台。本手术方案的目标是通过使用髓内钢针固定股骨，在小鼠体内建立单侧闭合性股骨骨折。

摘要

骨折不仅对患者造成巨大的社会经济负担，还显著影响其生活质量。目前尚无有效的促进骨愈合的治疗策略，而这类策略的需求极为迫切。为了理解与骨再生相关的复杂生物学过程，迫切需要建立有效且可重复的骨折愈合动物模型。多年来已开发出多种骨折愈合动物模型，但近年来小鼠骨折模型已逐渐成为研究骨愈合的有力工具。尽管已有多种开放性和闭合性模型被建立，但闭合性股骨骨折模型因其能够在生理相关条件下快速、稳定地产生可重复结果而尤为突出。本手术方案的目标是在小鼠中建立单侧闭合性股骨骨折，并通过植入髓内钢针实现骨折后股骨的稳定固定。尽管钉或螺钉等装置可提供更强的轴向和旋转稳定性，但髓内针已足以实现稳定的固定，从而获得一致的愈合结果，同时不会在骨组织中产生新的缺损或损伤邻近软组织。通过放射影像学手段监测骨痂形成、骨性连接以及后续骨痂重塑的进程。骨愈合效果通常与愈合后骨组织的力学强度相关，并通过扭转测试进行量化评估。然而，理解与骨折修复相关的早期细胞与分子事件，对于骨组织再生研究至关重要。结合髓内固定的闭合性小鼠股骨骨折模型，为研究骨折愈合机制及评估促进愈合的治疗策略提供了一个理想的平台。

引言

骨折是肌肉骨骼系统中最常见的损伤之一，伴随着巨大的社会经济负担，包括治疗费用，预计在美国每年将超过250亿美元^1,2。尽管大多数骨折能够顺利愈合，但愈合过程仍会导致显著的停工时间和生产力损失。由于年龄或其他潜在的慢性健康状况（如骨质疏松症和 糖尿病），约有5%至10%的骨折会出现愈合延迟或 不愈合^3,4,5。目前尚无经美国食品药品监督管理局（FDA）批准的药物疗法可用于促进骨骼高效愈合并缩短恢复时间。

骨折愈合是一个复杂且高度动态的过程，涉及多种细胞类型的协调作用。因此，全面理解与骨再生相关的细胞和分子事件，对于识别能够加速该过程的治疗靶点至关重要。与其他人类疾病一样，建立一个易于操作且可重复的动物模型，对于研究骨愈合至关重要。大型动物（如绵羊和猪）的骨重建特性和生物力学与人类相似，但其饲养成本高、需要较长的愈合时间，且难以进行遗传操作⁶。相比之下，小型动物模型（如大鼠和小鼠）具有诸多优势，包括易于操作、维护成本低、繁殖周期短以及愈合时间较短⁷。此外，小鼠基因组已完全测序，便于快速进行遗传操作并构建基因变异体。因此，小鼠是研究人类疾病、损伤及修复的有力模型系统⁸。在人类中，骨质疏松症和糖尿病等共病会增加骨折愈合延迟的风险。目前已存在多种小鼠模型，可用于研究骨质疏松症和糖尿病等共病对骨损伤及愈合过程的影响。患有骨质疏松症的患者在骨折愈合后期骨形成显著减少⁹。卵巢切除（OVX）小鼠表现出快速的骨量丢失和愈合延迟，类似于绝经后骨质疏松症的表现^10,11。此外，许多I型和II型糖尿病小鼠模型能够模拟人类中观察到的低骨量表型和骨折愈合障碍¹¹。同时，小鼠骨折模型也为研究骨痂中发生的复杂生物学过程，以及探索促进骨组织再生的新型治疗策略提供了多功能平台。

尽管小鼠与人类在骨结构和代谢方面存在差异，但骨折愈合的整体过程在两者之间非常相似，均涉及软骨内成骨和膜内成骨的结合，随后进行骨组织重塑。软骨内成骨过程包括祖细胞被募集至骨折间隙周围力学稳定性较低的区域，这些祖细胞分化为软骨细胞，后者发生肥大并矿化软骨，从而形成软性骨痂。第二波祖细胞浸润进入骨痂，并分化为成熟的成骨细胞，分泌新的骨基质^12,13,14,15。在膜内成骨过程中，骨膜和骨内膜表面的祖细胞直接分化为分泌基质的成骨细胞，促进骨折间隙的桥接^9,11,12,13。软骨内成骨与膜内成骨共同作用，形成硬性骨痂，随后随着时间推移进一步重塑，最终形成能够承受机械负荷的坚固的继发性骨组织^13,14,15。在健康人体中，愈合过程大约需要3个月，而在小鼠中仅需35天¹⁶。

骨折愈合的研究通常采用开放性或闭合性手术模型¹⁷。开放性手术方法，例如制造临界尺寸缺损或完全截骨，能够标准化损伤的位置和几何形态，从而减少粉碎性骨折带来的变异。截骨模型是研究骨不连机制的理想模型，因为其愈合过程通常比闭合性骨折更延迟。此外，截骨后的骨骼需要刚性外固定来维持稳定，这意味着再生过程主要依赖膜内成骨。开放性手术方法使用锁定髓内钉、针夹和锁定钢板等装置为骨折肢体提供轴向和旋转稳定性；然而，这些装置成本较高，且手术所需时间显著更长^18,19,20,21。相比之下，闭合性模型通过简单的髓内固定装置进行稳定，允许一定程度的不稳定，从而促进软骨内成骨愈合。因此，闭合性骨折模型难以直接模拟骨不连的实际情况。内固定技术，如髓内针、髓内钉和加压螺钉，具有成本低、操作简便、手术时间短等优势^21,22,23。在某些情况下，髓内针在骨折前即已插入，但髓内针的弯曲可能导致股骨骨折端成角或移位，从而引起骨痂大小和愈合情况的差异。由于闭合性模型通常采用三点弯曲装置（即在骨干上自由落重）制造骨折，其骨折位置和几何形态更难标准化。然而，若采用恰当的技术，该手术方法可获得快速且一致的结果。此外，闭合性骨折模型是研究高能量冲击或机械应力所致骨折的一种具有临床相关性的工具²²。

本手术方案改编自先前描述的方法，即使用髓内针固定大鼠和小鼠的股骨骨折^22,24,25。首先，将一根小直径的髓内针经由髁间切迹插入，以建立进入点，随后在使用依赖重力的三点弯曲装置于股骨中段产生横断骨折之前，引入导丝。成功建立闭合性股骨骨折后，将一根较大直径的髓内杆沿导丝置入，以稳定骨折的股骨。该方法避免了骨折过程中因髓内针角度偏移而导致愈合延迟的风险，因为在骨折后置入髓内杆可实现骨折股骨的重新复位和优化固定。

方案

以下操作步骤已获得印第安纳大学医学院机构动物照护与使用委员会（IACUC）的批准。所有存活手术均按照美国国立卫生研究院（NIH）指南所述的无菌条件进行。通过使用适当的镇痛药和抗生素来控制疼痛和感染风险，以确保手术成功。

1. 麻醉与准备

1. 称重小鼠，并使用氯胺酮（100 mg/kg）和赛拉嗪（10 mg/kg）混合物进行麻醉给药 通过 腹腔（I.P.）注射途径。将小鼠放入一个空笼中，并持续观察直至其完全镇静。
2. 通过脚趾捏压反射确认小鼠已处于镇静状态。在其眼睛上涂抹眼用软膏，以防止角膜干燥。
3. 去除右肢的毛发。用含碘消毒剂和70%乙醇擦拭手术区域。从膝关节中心开始，以环形方式向外周擦拭消毒。使用新的消毒材料重复此过程3次，最后用70%乙醇结束。
4. 皮下注射盐酸丁丙诺啡镇痛剂（0.03 mg/kg）作为术前用药，用于术后即刻镇痛管理。
5. 将小鼠置于覆盖无菌手术垫的加热垫上。

2. 手术入路

注意：在骨折前，应根据特定品系、年龄和性别的小鼠通过实验预先确定重量和下落高度。该手术方案针对10周龄的C57BJ6雄性小鼠进行了优化。

1. 将小鼠仰卧放置，并屈曲手术侧肢体的膝关节。使用手术刀片在膝关节中心处做一个1.5 cm长的切口。
2. 用镊子将髌骨向侧方移位，以暴露股骨远端。将一根长1.5英寸、25号不锈钢皮下注射针头插入滑车沟的中心，沿髓腔逆行方向穿过股骨全长，直至股骨近端。拍摄X光片以确认针的位置。
   注意：针头应从小鼠背侧穿出，以形成引导导丝的通路。
3. 将一根长4英寸、36号的钨制导引导丝从股骨远端的针座端插入针管，沿针道穿过，从小鼠背侧针尖斜面穿出。
4. 成功置入导引导丝后，在固定肢体和导丝位置的同时，轻柔地牵拉针座，小心取出25号针头。通过X光片确认导引导丝的位置。
5. 将一个391 g的重物置于冲击盘上方34.6 cm处（图1A）。将股骨水平放置在两个支撑点之间，使股骨的转子间区域和髁上区域分别置于支撑砧上（图1B），肢体外侧朝向加载点（图1C）。释放重物，在骨折发生后立即小心将小鼠从装置中取出。
6. 通过X光片确认骨折位置。
7. 将24号不锈钢皮下注射套管沿导引导丝插入，以稳定骨折的股骨。
   注意：由于入口是用直径较小的针头形成的，因此插入过程中可能需要施加一定力量。这种直径差异可有效防止24号套管从股骨近端移位。插入深度可通过手动感知钝性套管接触大转子皮质骨时的阻力来判断。
8. 在取出导引导丝前，通过X光片确认钢套管的位置以及骨折股骨的稳定性。
9. 使用剪线钳在股骨远端剪除多余的套管。用镊子轻轻向下施力，将暴露的套管埋入髁部表面以下，注意避免膝关节脱位。
10. 用镊子复位髌骨。使用5-0可吸收缝线缝合切口部位。

3. 术后管理

1. 手术后，可向小鼠注射最多 500 µL 无菌生理盐水 通过 腹腔注射途径，以帮助它们术后恢复。
2. 将动物置于加热恢复床上进行监测，直至从手术中苏醒。一旦能够自主活动，即放回其笼中。
3. 手术后需继续密切观察小鼠数天，以确保其正常愈合并恢复活动能力。每6小时皮下注射一次盐酸丁丙诺啡镇痛剂（0.03 mg/kg） 术后3天内每天给药，之后根据需要使用。避免使用非甾体抗炎药（NSAIDs），因其已被证明会干扰术后骨愈合。

结果

通过放射影像学检查监测手术操作的成功实施。关键步骤包括插入髓内针、置入导丝、在股骨中段诱导横行骨折，以及使用髓内钉进行适当的固定（图2Ai - 2Aiv）。术后每周通过放射影像学图像监测骨折愈合过程中骨痂的形成情况，持续至术后28天（图2B）。在骨折后第10至16天，软骨细胞发生肥大，并产生矿化软骨，形成明显的软性骨痂。

研究软骨内成骨和膜内成骨过程中早期的细胞和分子事件，对于理解骨折愈合机制具有重要意义。骨折后7天和14天，对股骨进行甲苯胺蓝染色，以观察骨折间隙中软骨基质的形成（图3A）。骨折后7天即可检测到软骨形成，至第14天时软骨组织已沿骨折间隙排列。

讨论

本手术操作的目标是在小鼠中建立标准化的闭合性股骨骨折模型。该模型的一个关键优势在于，内固定操作在骨折形成之后进行，从而避免了髓内钉发生角度偏移。本方案中可能最为关键的步骤是在股骨中段产生一个标准化的横断骨折，因为骨折的几何形态取决于施加的弯曲力以及后肢的定位。在弯曲过程中若股骨位置不当，可能导致斜行或粉碎性骨折。体重和下落高度必须通过经验预先确定，因为它们取决于小鼠的年龄、性别和品系。可使用配备三点弯曲装置的材料试验机替代落锤来进一步精确控制施加的力²⁴。然而，采用落锤致伤的方式更符合临床高能量冲击或应力相关损伤的模型。

此外，手术过程中可能会出现并发症。骨折形成后，导丝可能发生移位，导致使用髓内钉固定时受伤股骨对位不良。通过在骨折形成前和形成后进行放射影像学监测，可预防此问题。对于粉碎性骨折，应将动物排除在研究之外。此外，术后应密切监测动物髓内钉的移位情况，因为这可能影响受伤肢体的活动能力和愈合过程。该技术的一个局限性在于无法进行活体（in vivo）显微CT或磁共振成像（MRI）分析，因为不锈钢髓内钉会干扰图像质...

材料

本文使用的材料清单

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聚维酮碘	赛默飞世尔科技	395516
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