方法文章

人诱导的多潜能干细胞源性心室心肌细胞亚型特异光学动作电位记录

DOI：

10.3791/58134

⸱

2018年9月27日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Medical Department I, University Hospital Klinikum rechts der Isar, Technical University of Munich, 2German Centre for Cardiovascular Research (DZHK), Munich Heart Alliance, 3Beth Israel Deaconess Medical Center, Harvard Medical School

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

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在这里, 我们提出了一种光学图像动作电位的方法, 特别是在心室样诱导多潜能干细胞衍生心肌细胞。该方法基于对电压敏感的荧光蛋白的启动子驱动表达式。

摘要

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由人类诱导的多潜能干细胞 (iPSC CMs) 产生的心肌细胞是心血管研究的新兴工具。目前的分化协议所产生的 iPSC-CMs, 与其说是同质的细胞群, 不如说是细胞与心室、心房和结节样表型的混合体, 这就复杂了对表型的分析。本文提出了一种从心室样 iPSC-CMs 的光学记录动作电位的方法。这是通过慢病毒载体转导与一个结构, 其中一个基因编码的电压指示器是在一个心室特定的启动子元素的控制。当 iPSC CMs 与此构造转基因时, 电压传感器只表达在心室样细胞中, 使用时间失效荧光显微镜使亚型特定的光学膜电位记录得以实现。

引言

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由诱导多能干细胞 (iPSCs) 衍生的心肌细胞 (CMs) 是一种新的工具, 用于解剖心脏疾病的分子机制, 研究新的治疗方法, 并筛查1、2 的不良心脏药物效应。,3。从一开始, 致心律失常疾病如 channelopathies 已经成为这个研究领域的一个重要的焦点4。因此, 研究 CMs 电子表型的方法, 如心律失常或动作电位 (AP) 形态的变化, 是该技术的核心。

在应用 iPSC CMs 的一个重要的考虑是, 目前的心脏分化协议并没有导致细胞的同源种群。相反, 它们是在不同的成熟度5,6,7,8, 类似窦房结, 心房和心室 CMs 的细胞的混合物。这种异质性可能是实验变异性的相关来源, 特别是如果研究了 AP 持续时间 (apd) 的参数, 这在 CM 亚型 (例如, 在心房的 APD 比心室 CMs 短)。解决这一问题的常规方法是使用膜片钳方法调查单个 iPSC....

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方案

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1. iPSC 心肌细胞成像的制备

注: 在12、13、14之前已经公布了 iPSC 培养和心脏分化的方法, 并没有详细讨论。采用人工显微切割、磁性细胞分离或乳酸选择的方法纯化 iPSC CMs, 这取决于所使用的鉴别协议。对于以下的协议, microdissected 外植体从殴打地区, 产生使用单层分化协议13, 被采取在15天的心脏分化和培养, 直到30天的纤维粘连蛋白涂层板, 如所述在10之前。

  1. 将细胞培养皿从孵化器中取出, 用200µL 吸管手动将心脏外植体收集到离心管中。沉淀后, 吸入细胞培养上清液, 用汉克平衡盐溶液 (HBSS) 轻轻冲洗外植体2x。
  2. 游离 iPSC-CMs, 加入胶原酶 II 型 (430 U/毫升在 HBSS) 和孵化他们在37°c 30 分钟。
  3. 在剩余的大细胞团簇沉淀后, 收集含有分离的单 iPSC CMs 的上清液, 并将其添加到含有高胎牛血清浓度 (DMEM-F12, 20%, 2 毫米的新鲜 CM 维持培养基中)。l-谷氨酰胺, 1:100 的非必需氨基酸, 100 毫升青霉素-链霉素, 0.1....

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结果

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在图 4a中, 用白色虚线标明了在 RFP (左侧) 和 GFP (右侧) 通道中的图像分析过程中绘制的 ROI, 并描述了一个代表的单 iPSC CM。从 RFP 通道发出的信号显示每次动作电位期间荧光强度的周期性增加 (图 4b, 上部板)。如导言所述, 这是由于膜电位的变化引起的焦虑加剧 (图 1)。和谐, GFP 信号显示荧光强度周期性下降 (图 4b, 中间板)。RFP/GFP 比值 (图 4b, 下板) 是用于下游分析的生物信号, 如 apd50和 apd90测量。使用这种方法, 30 天老心室状 iPSC CMs 节奏在0.5 赫兹显示了平均 apd50 (持续时间从行动电位开始直到复极化完成 50.......

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讨论

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此处描述的方法允许从人类 iPSCs 生成 CMs 的特定子类型 (即心室样细胞) 中的 ap 进行光学记录。人类 iPSC-CMs 是一个新兴的工具, 以解决巨大的各种生物和医学问题, 和分化不同的 CM 亚型是一个重要的来源的实验变异性。通过使用特定的启动子元素, GEVI 的表达式在 CMs 中具体实现, 表示感兴趣的子类型, 然后进行光学成像。

从单 iPSC CMs 中成功获取 ap 取决于分离后的补种密度。如果这些细胞的 reseeded 太密, 那么找到不属于电子合胞体的孤立的单 iPSC CMs 是很耗时的。但是, 太低的播种密度对细胞的存活有负面影响。因此, 建议对不同播种密度进行系统测试, 特别是在从事依赖高通量成像的实验之前。

在图像采集过程中, VSFP 经历漂白, 这可能对信噪比产生负面影响, 特别是在较长的实验中。如果在实验过程中存在快速漂白, 请确保只有在图像采集过程中或在必要的准备步骤 (搜索和聚焦于 VSFP 表达式细胞) 中打开激发光快门, 这应该是尽快完成。另外, 将励磁.......

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披露

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作者没有什么可透露的。

致谢

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这项工作得到了德国研究基金会 (Si 1747/1-1)、其他 Kröner-费森尤斯基金会和德意志基金会的资助。

....

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
ß-巯基乙醇Invitrogen21985023
DMEM-F12 培养基Invitrogen21331046
FBS（胎牛血清）Invitrogen16141079
MEM 非必需氨基酸Invitrogen11140050
GlutaMax-I 补充剂Invitrogen35050061替代品 L-谷氨酰胺
青霉素-链霉素Invitrogen15140122
纤连蛋白牛血浆Sigma-AldrichF1141 
II型胶原酶Worthington BiochemLS004174
溴化己二甲铵（聚凝胺）Sigma-AldrichH9268增强慢病毒感染
3.5 cm玻璃底微培养皿MatTek corporation，美国马萨诸塞州阿什兰P35G-1.5-14-C
显微镜支架Leica Microsystems，Wetzlar，德国DMI6000B
显微镜物镜徕卡显微系统公司，德国韦茨拉HCX PL APO 63X/1.4-0.6 油
sCMOS 相机Andor Technology，英国贝尔法斯特Zyla V
显微镜滤光片立方体：激发滤光片Chroma Technology Corp，美国佛蒙特州波ET480/40X带通 480/40
显微镜滤光片立方体：二向色镜Chroma Technology Corp，美国佛蒙特州波纹管瀑布T505lpxr长波通 505 nm
图像分配器 Cairn Research，英国法弗舍姆OptoSplit II
图像分流器滤光片立方体：二向色镜AHF Analysentechnik GmbH，Tübigen， 德国568LPXR长波通 568 nm
图像分流器滤光片立方体：发射滤光片 1（GFP 发射）AHF Analysentechnik GmbH， Tübigen， 德国520/28 BrightLine HC带通 520/28 nm
图像分流器滤光片立方体：发射滤光片 2（RFP 发射）AHF Analysentechnik GmbH， TüBigen，德国630/75 ET 带通带通 630/75 nm
起搏嵌入Warner Instruments，美国康涅狄格州哈姆登RC-37FS
尔 纹管瀑布

参考文献

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  1. Sinnecker, D., Laugwitz, K. L., Moretti, A. Induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for drug development and toxicity testing. Pharmacology & Therapeutics. 143 (2), 246-252 (2014).
  2. Goedel, A., My, I., Sinnecker, D., Moretti, A.

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