人诱导性多能干细胞来源的心室样心肌细胞中亚型特异性光学动作电位记录

摘要

本文介绍一种光学成像技术，用于特异性检测心室样诱导性多能干细胞来源的心肌细胞中的动作电位。该方法基于启动子驱动的电压敏感型荧光蛋白表达。

摘要

由人诱导性多能干细胞（iPSC-CMs）生成的心肌细胞是心血管研究中一种新兴的工具。目前的分化方案所产生的iPSC-CMs并非均一的细胞群体，而是包含具有心室样、心房样和结节样表型的细胞混合物，这使得表型分析变得复杂。本文介绍了一种专门从心室样iPSC-CMs中光学记录动作电位的方法。该方法通过慢病毒转导实现，所用载体中基因编码的电压指示剂受控于心室特异性启动子元件。当iPSC-CMs被该载体转导后，电压传感器仅在心室样细胞中表达，从而能够利用时间序列荧光显微镜进行亚型特异性的膜电位光学记录。

引言

由诱导性多能干细胞（iPSCs）分化而来的心肌细胞（CMs）正成为解析心脏病分子机制、研究新型疗法以及筛选药物心脏不良反应的重要工具^1,2,3。自研究初期起，致心律失常性疾病（如离子通道病）便一直是该领域的重要研究重点⁴。因此，用于研究CMs电生理表型（如心律失常或动作电位（AP）形态改变）的方法，构成了该技术的核心内容。

在应用iPSC-CMs时，一个重要的考虑因素是目前的心肌分化方案无法获得均一的细胞群体，而是产生由不同成熟程度的、类似于窦房结、心房和心室CMs的细胞混合物^5,6,7,8这种异质性可能是实验变异的一个重要来源，特别是当研究动作电位时程（APD）等参数时，这些参数在心肌细胞亚型之间本就存在内在差异。例如，心房CMs的APD比心室CMs短）。解决这一问题的传统方法是采用膜片钳技术对单个iPSC-CMs进行研究，并根据其动作电位形态将每个细胞分类为类似结状、心....

方案

1. 用于成像的iPSC来源心肌细胞的制备

注意：iPSC 培养和心肌细胞分化的方法此前已有发表^12,13,14，此处不再详细讨论。建议根据所使用的分化方案，通过手工显微解剖、磁性细胞分选或乳酸筛选法对 iPSC-CMs 进行纯化。在以下实验方案中，采用单层分化法¹³生成的搏动区域的手工显微解剖外植体，在心脏分化第15天获取，并在纤连蛋白包被的培养板上继续培养至第30天，具体操作如前所述¹⁰。

1. 从培养箱中取出细胞培养板，使用200 µL移液器手动将心脏外植体收集至微量离心管中。沉降后，吸除细胞培养上清液，并用Hank’s平衡盐溶液（HBSS）轻柔洗涤外植体2次。
2. 加入II型胶原酶（430 U/mL，溶于HBSS）以解离iPSC-CMs，并在37 °C下孵育30分钟。
3. 待剩余的大细胞团块沉降后，收集含有解离单个iPSC-CMs的上清液，并将其加入新鲜的心肌细胞维持培养基中，该培养基含有高浓度胎牛血清（FBS）（DMEM-F12，20% FBS，2 mM L-谷氨酰胺，1:100 MEM非必需氨基酸，100 U/mL青霉素-链霉素，以及0....

结果

在图4a中，显示了一个典型的单个iPSC-CM，白色虚线标出了在成像分析过程中于RFP（左侧）和GFP（右侧）通道中划定的兴趣区域（ROI）。RFP通道的信号显示，在每次动作电位期间荧光强度呈周期性升高（图4b，上图）。如引言部分所述，这是由于膜电位变化引起FRET增加所致（图1）。相应地，GFP信号显示出荧光强度的周期性降低（图4b，中图）。RFP/GFP比值（图4b，下图）是用于后续分析（如APD₅₀和APD₉₀测量）的生物学信号。采用该方法，对以0.5 Hz频率起搏的30天龄类心室样iPSC-CMs进行检测，结果显示其平均APD₅₀（从动作电位起始至复极化完成50%的持续时间）为439 ms（± 46 ms.......

讨论

此处所述方法可实现对特定亚型动作电位的光学记录（即，心室样细胞）由人iPSCs生成的心肌细胞。人iPSC-CMs是一种新兴工具，可用于解决多种生物学和医学问题，而向不同心肌细胞亚型的分化是实验变异的重要来源。通过使用特异性启动子元件，可在代表目标亚型的心肌细胞中特异性表达GEVI，随后进行光学成像。

成功获取单个iPSC-CM的动作电位（AP）取决于解离后的重铺板密度。若细胞铺板过密，则难以找到未参与电耦合合胞体的孤立单细胞，耗时较长。然而，过低的铺板密度会负面影响细胞存活率。因此，建议系统性地测试不同铺板密度，尤其是在开展依赖高通量成像的实验之前。

在图像采集过程中，VSFP 会发生光漂白，这可能会对信噪比产生不利影响，尤其是在较长时间的实验中。如果实验过程中出现快速光漂白，请确保激发光源的快门仅在图像采集期间或必要的准备步骤（如寻找并聚焦表达 VSFP 的细胞）期间打开，且这些操作应尽可能快速完成。此外，应将激发光的强度降低至满足需求的最低水平，并充分利用用于图像采集的高灵敏度相机的动态范围。

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材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
ß-巯基乙醇	Invitrogen	21985023
DMEM-F12 培养基	Invitrogen	21331046
FBS（胎牛血清）	Invitrogen	16141079
MEM 非必需氨基酸	Invitrogen	11140050
GlutaMax-I 添加剂	Invitrogen	35050061	替代 L-谷氨酰胺
青霉素-链霉素	Invitrogen	15140122
牛血浆纤维连接蛋白	Sigma-Aldrich	F1141
II 型胶原酶	Worthington Biochem	LS004174
六亚甲基溴化铵（Polybrene）	Sigma-Aldrich	H9268	增强慢病毒感染效率
3.5 cm 玻璃底培养皿	MatTek corporation, Ashland, MA, USA	P35G-1.5-14-C
显微镜支架	Leica Microsystems, Wetzlar, Germany	DMI6000B
显微镜物镜	Leica Microsystems, Wetzlar, Germany	HCX PL APO 63X/1.4-0.6 Oil
sCMOS 相机	Andor Technology, Belfast, UK	Zyla V
显微镜滤光立方体：激发滤光片	Chroma Technology Corp, Bellows Falls, VT, USA	ET480/40X	带通 480/40
显微镜滤光立方体：二向色镜	Chroma Technology Corp, Bellows Falls, VT, USA	T505lpxr	长通 505 nm
图像分光器	Cairn Research, Faversham, UK	OptoSplit II
图像分光器滤光立方体：二向色镜	AHF Analysentechnik GmbH, Tübigen, Germany	568LPXR	长通 568 nm
图像分光器滤光立方体：发射滤光片 1（GFP 发射）	AHF Analysentechnik GmbH, Tübigen, Germany	520/28 BrightLine HC	带通 520/28 nm
图像分光器滤光立方体：发射滤光片 2（RFP 发射）	AHF Analysentechnik GmbH, Tübigen, Germany	630/75 ET Bandpass	带通 630/75 nm
刺激用嵌件	Warner Instruments, Hamden, CT, USA	RC-37FS