本方案描述了一种无需校准的蛋白质同源寡聚化定量方法 体外 基于商用光扫描显微镜的荧光涨落光谱技术。展示了正确的数据采集设置和分析方法。
方法文章
本方案描述了一种无需校准的蛋白质同源寡聚化定量方法 体外 基于商用光扫描显微镜的荧光涨落光谱技术。展示了正确的数据采集设置和分析方法。
数目与亮度是一种无需校准的荧光涨落光谱(FFS)技术,用于检测蛋白质同源寡聚化。该技术可利用配备数字探测器的传统共聚焦显微镜进行。本文通过一个应用实例展示了该技术在体外使用的实验方案,该实例中,通过加入二聚化药物AP20187前后,数目与亮度方法能够准确量化mVenus标记的FKBP12F36V蛋白的寡聚状态。文中讨论了正确选择显微镜采集参数以及正确的数据预处理和分析方法的重要性,尤其强调了光漂白校正方法选择的关键性。这一低成本方法可用于在多种生物学背景下研究蛋白质-蛋白质相互作用。
蛋白质-蛋白质相互作用 我体外
传统上,晶体学、核磁共振实验结合冷冻电子显微镜(cryoEM)是用于精确描述蛋白质三维结构并通过对高分辨率结构细节的分析推断其功能的主要技术。然而,蛋白质并非静态结构,它们在时间和空间上可发生多种构象变化和振动。因此,晶体学或冷冻电镜(CryoEM)提供的结构信息需要与其他技术(例如,分子动力学模拟和单分子技术)相互补充:蛋白质的功能与其构象变化及相互作用密切相关,而这些信息无法从静态结构中获得。为了探测分子内的动力学行为,基于单分子 Förster 共振能量转移(smFRET)的技术非常有效1。这些方法能够在复杂介质中评估不同分子亚群的存在状态。这一点极为重要,因为这些构象变化发生迅速,且贯穿数据采集的全过程(即 纳秒至秒级范围)。
检测和定量这些变化通常采用两种主要方法:溶液中的蛋白质和表面固定化蛋白质。对于分子间相互作用的检测,特别是配体诱导的二聚化过程,单分子荧光共振能量转移(smFRET)并不总是最佳工具。事实上,FRET不仅依赖于距离(约10 nm),还依赖于两个偶极子(供体和受体,χ)的取向2供体发射光谱与受体吸收光谱的重叠部分2,但若实验者能够选择合适的FRET对,则最后一个条件可能不那么重要。smFRET在研究同源二聚化时的一个特殊缺点源于目标蛋白的标记:对于异源smFRET,二聚化的检测上限仅为50%(即, 异源FRET仅能检测供体-受体和受体-供体的同源二聚体,而无法检测供体-供体或受体-受体这两种占二聚体总数另外50%的组合。荧光相关光谱(FCS)及其衍生技术(FCCS, 等等。3以确定蛋白质扩散常数和结合常数 体外 是另一种替代方法。这些方法同样无法完全定量同源二聚化,因为在荧光相关光谱(FCS)中测量的是浓度和扩散,而扩散粒子的半径和扩散系数对分子量的依赖性非常弱;例如,分子量增加10倍,仅导致扩散系数改变2.15倍。4在双色FCS或FCCS的情况下,由于上述相同原因,仅能检测到50%的同源二聚体。检测同源二聚化的最实用且定量的方法 体外 和 体内 是均相FRET5 和数密度与亮度(N&B)6. 鉴于同源FRET需要特定的仪器才能恢复各向异性值(即, 光学元件/分析器(用于恢复平行和垂直偏振),N&B 被呈现为一种检测蛋白质同源二聚化和聚集的有利技术。该方法既可用于 体外 和 体内 采用商业化的配置。
数量与亮度
N&B 技术最近已被综述7。该综述主要关注该技术在活细胞中的应用。在此重现其数学形式体系是值得的,因为这些方程将被应用于体外(in vitro)实验所获得的数据。首先,需要定义一些术语和数学量:
然后,使用光子计数探测器,并假设存在可移动实体且无背景信号,


其中 N 为表观星等,B 为表观亮度。由此可得


Dalal 等8 表明,使用模拟设备时需要三个校正项:S 因子、背景偏移量(offset)以及读出噪声 σ02。随后,再次假设为可移动实体,


给予


请注意,上述公式与 Dalal et al.8 中以及后续综述7 中给出的公式有所不同。在 Dalal et al. 中,分母中的 S 因笔误被遗漏,而该错误在综述中也被沿用。上述公式才是正确的。关于测量 S、偏移量和 σ02 的操作说明及其含义的解释,参见 Dalal et al.8。
亮度 ε 与扩散实体的寡聚状态成正比:二聚体的 ε 值是单体的两倍,三聚体的 ε 值是单体的三倍,六聚体的 ε 值是三聚体的两倍,依此类推。因此,通过测量亮度 ε,可以定量分析各种类型的多聚化过程。
如果存在多种寡聚状态的混合物,数目与亮度分析法无法解析出其中各自独立的寡聚状态。这是该技术的一个局限性。
去趋势算法与 nandb 软件
校正光漂白效应的重要性此前已被多次强调9光漂白在延时模式的光学显微镜实验中不可避免,无论是在活细胞中还是 体外文献中已描述了多种方法来校正漂白效应7指数滤波技术结合去趋势参数的自动选择 T 是目前最佳选择。它已集成到免费的开源软件 nandb 中9确实,需要用户手动选择去趋势参数的软件可能导致错误的结果,因为该参数的选择很可能是随意且不准确的。 自动的 算法会自动分析数据并确定其合适的参数,无需用户干预9即使选择了最优的平滑参数,去趋势处理仍存在局限性,仅在光漂白程度低于25%时效果良好,这一点已通过模拟结果得到证实9有趣的是,当使用自动去趋势程序时,其精度之高使得即使在低亮度值下也能进行有效工作(甚至 B <1.01),因此信号强度较低,但仍具有足够的精确度来定量同源二聚化。
光漂白还会引发另一个问题:多聚体复合物中存在光漂白的荧光分子。这使得 例如, 当三聚体中的三个亚基之一不具荧光性时,该三聚体在检测中会呈现为二聚体。Hur 和 Mueller10 展示了如何对此进行校正,且后续综述也强调了这一校正方法7nandb 软件包含此项校正9.
FKBP12F36V 系统
FKBP12F36V 是一种在自然界中不会发生寡聚化的蛋白质,但已知在加入 AP20187 药物(俗称 BB 二聚化配体)后会发生二聚化11,12。这使其成为进行数目与亮度分析的理想测试对象:在标记 FKBP12F36V 后,加入 BB 应可观察到其寡聚状态加倍。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
1. FKBP12 F36V -mVenus 纯化
2. 多孔板阵列的制备
3. 无需校准的共聚焦采集
4. 使用 R 软件包 nandb 进行去趋势和亮度分析
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
去趋势与单体亮度
数据采集完成后,即可开始进行亮度计算,以确定目标蛋白在溶液中的寡聚状态。尽管溶液中光漂白的影响可能不如在其他情况下显著 体内,强度轨迹可能仍然不具有平稳均值,这可能是由于与荧光分子相关的光物理效应所致,18 但其背后的原因尚未完全明确。这在计算亮度时会产生影响;在试图确定单体-二聚体转变时,这一因素尤为关键。通过对所示数据应用自动去趋势算法 图2a在加入BB之前,未进行去趋势处理时,强度轨迹经过适当校正,可提供溶液中FKBP12F36V-mVenus亮度的更准确数值。 B = 1.026,而去趋势后, B = 1.005 (图2b
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
N&B 是一种利用配备数字探测器的商用激光扫描共聚焦显微镜检测多聚化的技术。与单点 FCS、FCCS 和 smFRET 相比,该方法具有无需校准、亮度计算简单且不受浓度影响的优点6。然而,在进行亮度计算之前,必须对漂白效应和长期强度波动进行校正9;如果忽略或错误地执行去趋势化处理,漂白和其他伪影引起的微小亮度增加可能被误判为寡聚状态的变化(如 图 2a 所示)。采用自动去趋势算法可实现准确的亮度计算。
在采集图像时,遵循若干规则非常重要。首先,必须了解分子在共聚焦体积内的停留时间及其扩散系数,以便设置共聚焦系统的合适参数;标记分子的停留时间应介于像素驻留时间与帧时间之间7。选择合适的荧光染料至关重要。为了获得良好的信噪比并尽量减少光漂白,需要使用亮度高且稳定的荧光染料。激光功率应保持相对较低,以避免光漂白。每个像素1至2个光子计数已...
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
作者无任何利益冲突需要披露。
本工作获得了惠康信托基金(Wellcome Trust)授予 R.N. 的资助项目 105278/Z/14/2 的支持。惠康信托人类遗传学中心由惠康信托核心资助项目 203852/Z/16/2 提供经费。C.S. 研究团队的工作得到了英国癌症研究基金会(Cancer Research UK,项目编号 C20724/A14414)以及欧洲研究理事会(European Research Council)在欧盟“地平线2020”研究与创新计划下的资助项目 647278 的支持。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| RosettaTM (DE3) pLysS 细胞 | Novagen | 70956-3 | |
| 氨苄青霉素 | Sigma Aldrich | PubChem Substance ID 329824407 | |
| 氯霉素 | Sigma Aldrich | PubChem Substance ID: 24892250 | |
| LB 起始培养物 | QIAGEN | ||
| LB 培养基 | QIAGEN | https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/head/search/external-link-icon.gif | |
| IPTG | Sigma Aldrich | PubChem Substance ID 329815691 | |
| IMAC 缓冲液 | Medicago | 09-1010-10 | |
| 无 EDTA 蛋白酶抑制剂 | Sigma Aldrich | 11873580001 | |
| TALON 树脂 | Clonetech | ||
| 镍琼脂糖凝胶 | GE Healthcare | ||
| S200 16/60 层析柱 | GE Healthcare | ||
| 玻璃底 8 孔观察培养皿 | Ibidi | 80827 |
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
申请许可以重复使用本 JoVE 文章的文本或图表
申请许可