无需校准 体外 使用商用仪器和免费开源亮度分析软件定量检测蛋白质同源寡聚化

摘要

本方案描述了一种无需校准的蛋白质同源寡聚化定量方法 体外 基于商用光扫描显微镜的荧光涨落光谱技术。展示了正确的数据采集设置和分析方法。

摘要

数目与亮度是一种无需校准的荧光涨落光谱（FFS）技术，用于检测蛋白质同源寡聚化。该技术可利用配备数字探测器的传统共聚焦显微镜进行。本文通过一个应用实例展示了该技术在体外使用的实验方案，该实例中，通过加入二聚化药物AP20187前后，数目与亮度方法能够准确量化mVenus标记的FKBP12F36V蛋白的寡聚状态。文中讨论了正确选择显微镜采集参数以及正确的数据预处理和分析方法的重要性，尤其强调了光漂白校正方法选择的关键性。这一低成本方法可用于在多种生物学背景下研究蛋白质-蛋白质相互作用。

引言

蛋白质-蛋白质相互作用 我体外

传统上，晶体学、核磁共振实验结合冷冻电子显微镜（cryoEM）是用于精确描述蛋白质三维结构并通过对高分辨率结构细节的分析推断其功能的主要技术。然而，蛋白质并非静态结构，它们在时间和空间上可发生多种构象变化和振动。因此，晶体学或冷冻电镜（CryoEM）提供的结构信息需要与其他技术（例如，分子动力学模拟和单分子技术）相互补充：蛋白质的功能与其构象变化及相互作用密切相关，而这些信息无法从静态结构中获得。为了探测分子内的动力学行为，基于单分子 Förster 共振能量转移（smFRET）的技术非常有效¹。这些方法能够在复杂介质中评估不同分子亚群的存在状态。这一点极为重要，因为这些构象变化发生迅速，且贯穿数据采集的全过程（即 纳秒至秒级范围）。

检测和定量这些变化通常采用两种主要方法：溶液中的蛋白质和表面固定化蛋白质。对于分子间相互作用的检测，特别是配体诱导的二聚化过程，单分子荧光共振能量转移（smFRET）并不总是最佳工具。事实上，FRET不仅依赖于距离（约10 nm），还依赖于两个偶极子（供体和受体，χ）的取向²供体发射光谱与受体吸收光谱的重叠部分²，但若实验者能够选择合适的FRET对，则最后一个条件可能不那么重要。smFRET在研究同源二聚化时的一个特殊缺点源于目标蛋白的标记：对于异源smFRET，二聚化的检测上限仅为50%（即， 异源FRET仅能检测供体-受体和受体-供体的同源二聚体，而无法检测供体-供体或受体-受体这两种占二聚体总数另外50%的组合。荧光相关光谱（FCS）及其衍生技术（FCCS， 等等。³以确定蛋白质扩散常数和结合常数 体外 是另一种替代方法。这些方法同样无法完全定量同源二聚化，因为在荧光相关光谱（FCS）中测量的是浓度和扩散，而扩散粒子的半径和扩散系数对分子量的依赖性非常弱；例如，分子量增加10倍，仅导致扩散系数改变2.15倍。⁴在双色FCS或FCCS的情况下，由于上述相同原因，仅能检测到50%的同源二聚体。检测同源二聚化的最实用且定量的方法 体外 和 体内 是均相FRET⁵ 和数密度与亮度（N&B)⁶. 鉴于同源FRET需要特定的仪器才能恢复各向异性值（即， 光学元件/分析器（用于恢复平行和垂直偏振），N&B 被呈现为一种检测蛋白质同源二聚化和聚集的有利技术。该方法既可用于 体外 和 体内 采用商业化的配置。

数量与亮度

N&B 技术最近已被综述⁷。该综述主要关注该技术在活细胞中的应用。在此重现其数学形式体系是值得的，因为这些方程将被应用于体外（in vitro）实验所获得的数据。首先，需要定义一些术语和数学量：

• 实体是指一组结合在一起的分子。
• 实体的亮度ε是指其单位时间（每帧）发射的光子数。
• n表示存在的实体数量。
• 对于图像序列中某一给定像素，为其平均强度，σ²为其强度的方差。

然后，使用光子计数探测器，并假设存在可移动实体且无背景信号，

其中 N 为表观星等，B 为表观亮度。由此可得

Dalal 等⁸ 表明，使用模拟设备时需要三个校正项：S 因子、背景偏移量（offset）以及读出噪声 σ₀²。随后，再次假设为可移动实体，

给予

请注意，上述公式与 Dalal et al.⁸ 中以及后续综述⁷ 中给出的公式有所不同。在 Dalal et al. 中，分母中的 S 因笔误被遗漏，而该错误在综述中也被沿用。上述公式才是正确的。关于测量 S、偏移量和 σ₀² 的操作说明及其含义的解释，参见 Dalal et al.⁸。

亮度 ε 与扩散实体的寡聚状态成正比：二聚体的 ε 值是单体的两倍，三聚体的 ε 值是单体的三倍，六聚体的 ε 值是三聚体的两倍，依此类推。因此，通过测量亮度 ε，可以定量分析各种类型的多聚化过程。

如果存在多种寡聚状态的混合物，数目与亮度分析法无法解析出其中各自独立的寡聚状态。这是该技术的一个局限性。

去趋势算法与 nandb 软件

校正光漂白效应的重要性此前已被多次强调⁹光漂白在延时模式的光学显微镜实验中不可避免，无论是在活细胞中还是 体外文献中已描述了多种方法来校正漂白效应⁷指数滤波技术结合去趋势参数的自动选择 T 是目前最佳选择。它已集成到免费的开源软件 nandb 中⁹确实，需要用户手动选择去趋势参数的软件可能导致错误的结果，因为该参数的选择很可能是随意且不准确的。 自动的 算法会自动分析数据并确定其合适的参数，无需用户干预⁹即使选择了最优的平滑参数，去趋势处理仍存在局限性，仅在光漂白程度低于25%时效果良好，这一点已通过模拟结果得到证实⁹有趣的是，当使用自动去趋势程序时，其精度之高使得即使在低亮度值下也能进行有效工作（甚至 B <1.01），因此信号强度较低，但仍具有足够的精确度来定量同源二聚化。

光漂白还会引发另一个问题：多聚体复合物中存在光漂白的荧光分子。这使得 例如， 当三聚体中的三个亚基之一不具荧光性时，该三聚体在检测中会呈现为二聚体。Hur 和 Mueller¹⁰ 展示了如何对此进行校正，且后续综述也强调了这一校正方法⁷nandb 软件包含此项校正⁹.

FKBP12F36V 系统

FKBP12F36V 是一种在自然界中不会发生寡聚化的蛋白质，但已知在加入 AP20187 药物（俗称 BB 二聚化配体）后会发生二聚化^11,12。这使其成为进行数目与亮度分析的理想测试对象：在标记 FKBP12F36V 后，加入 BB 应可观察到其寡聚状态加倍。

方案

1. FKBP12 F36V -mVenus 纯化

1. 将含有单体化人源 FKBP12F36V¹² 以及 N 端 His6 和 mVenus 标签的 pET22b 载体（载体可应要求提供）转化至 (DE3) pLysS 感受态细胞中。将细胞涂布于添加了 50 µg/mL 氨苄青霉素和 34 µg/mL 氯霉素的 LB 琼脂平板上。
2. 挑取转化后的单菌落接种于 100 mL LB 液体培养基中，于 37 °C 摇床培养 16 - 20 小时。
3. 将浓密的预培养液（OD600 >1）按 1:100 比例稀释至 LB 培养基中（共 2 × 500 mL），于 37 °C、200 rpm 条件下培养 2 - 3 小时，至 OD600 达 0.6 - 0.8。
4. 将培养物置于冰上冷却，加入 250 µM IPTG 诱导表达，并于 21 °C、200 rpm 条件下继续培养 16 - 20 小时。
5. 以 2,000 × g 离心 20 分钟收集菌体。
6. 将菌体沉淀重悬于 40 mL IMAC 缓冲液 A（20 mM 磷酸钠，pH 7.5，500 mM NaCl，3 mM 咪唑，1 mM β-巯基乙醇）中，同时加入无 EDTA 蛋白酶抑制剂（每份菌体沉淀加 1 片）。
7. 在冰上进行超声破碎（500 瓦，20 kHz，40% 振幅，工作 9 秒，间歇 11 秒，持续 15 分钟），随后以 20,000 × g 离心收集可溶性组分。
8. 将可溶性裂解液转移至锥形瓶中，加入 2 mL 树脂（见材料表），于 105 rpm 转速下孵育 1 小时。
   注：此步 IMAC 纯化也可使用镍琼脂糖树脂。
9. 收集树脂，先用 250 mL IMAC 缓冲液 A 洗涤，再用 500 mL IMAC 缓冲液 B（20 mM 磷酸钠，pH 7.5，500 mM NaCl，7 mM 咪唑，1 mM β-巯基乙醇）洗涤。
   注：若使用镍琼脂糖树脂，咪唑浓度可提高至 50 mM。
10. 使用 IMAC 缓冲液 C（20 mM 磷酸钠，pH 7.5，500 mM NaCl，300 mM 咪唑，1 mM β-巯基乙醇）洗脱 His6 标签蛋白。
11. 将洗脱液上样至已用 10 mM HEPES（pH 7.5）、150 mM NaCl、1 mM DTT 平衡好的凝胶过滤柱（见材料表）。在本实验所用色谱柱上，FKBP12F36V 的洗脱峰位于 87.71 mL 处。
12. 通过 SDS-PAGE 检测纯度，合并目标组分并根据需要进行浓缩。

2. 多孔板阵列的制备

1. 从 -80 °C 中解冻纯化的 FKBP12F36V（或目标标记蛋白）。
2. 配制含有 100 nM 纯化 FKBP12F36V 的溶液（缓冲液：10 mM HEPES pH 7.5，150 mM NaCl，1 mM DTT）。进行超声处理并离心（13,000 rpm 快速离心），以防止聚集体形成。
3. 将 100 - 200 µL 溶液移入底部为玻璃的 8 孔观察室中。
4. 加入 BB 二聚化诱导剂，使其终浓度分别为 10、20、40、80、100、150、300 和 500 nM^12,13。
5. 作为对照，配制仅含 100 nM mVenus 的溶液，用于评估可能的聚集和沉淀效应，并在相同的采集设置下获得单体的亮度值。

3. 无需校准的共聚焦采集

1. 启动共聚焦系统（图1）。任何配备数字探测器或经过良好表征的模拟探测器的共聚焦激光扫描显微镜系统⁸并且能够为每个采集的像素保持恒定的停留时间的设备均可使用。
2. 设置激发光束光路：
   1. 打开514 nm激光器，并将物镜出口处的功率设置为20 - 100 nW（适用于FKBP12F36V-mVenus）。
   2. 选择63X1.4NA物镜，或专为FCS设计的带校正环的水浸物镜。
   3. 打开一个 HyD、APD 或校准的 PMT 检测器。优先选择能够进行光子计数的检测器，因为在这种情况下，光子计数的计算更为准确。 S，偏移量和σ₀² 是不必要的。
   4. 选择520 - 560 nm的发射波长窗口
   5. 将针孔设为对应于发射波长约545 nm的1个艾里单位。
   6. 将采集模式设置为 16 × 16 像素
   7. 设置像素驻留时间 t_停留 使其满足 t_帧 >> T_D >> t_停留，其中 _D 是扩散蛋白的停留时间 t_帧 是帧率，这相当于将驻留时间设置为约 13 µs。
      注意：一些商业制造商的扫描仪未能保持每个像素的停留时间恒定。这种恒定性对于该方法的正常运行至关重要。
   8. 将像素大小设置为约 120 nm。
   9. 选择 xyt 采集模式，并选择每次采集每个孔所需的帧数（例如 5,000）。
   10. 如果系统配备高通量模式，输入每个孔的坐标以及每孔采集次数，以实现流程自动化。
       注意：若使用浸没物镜，请务必确保配备有供水装置。
   11. 如果系统配备了灌注装置，加载 BB 溶液并设置灌注程序，使其在5000后立即开始^th 评估二聚化动力学的同时进行采集的框架 例如， 10,000 张图像。
3. 向油浸物镜中加入一滴油；若使用专为FCS设计的带校正环的水浸物镜，则加入水。
4. 将8孔观察培养皿安装到显微镜载物台上。
5. 选择正确的孔并聚焦于溶液。
   注意：重要提示：避免在靠近底部玻璃的位置聚焦，以防止反射和散射。当需要在溶液更深处聚焦时，应断开自动聚焦选项。
6. 开始采集并将生成的图像序列以TIFF格式保存。

4. 使用 R 软件包 nandb 进行去趋势和亮度分析

1. 作为预处理的质量检查，使用 ImageJ¹⁴ 查看图像并恢复强度分布，如图 2a 所示。这有助于判断是否发生了过度的光漂白。如果漂白过于严重，则数据不适合进一步分析。
   注意：ImageJ 还可用于将图像从商业格式转换为 TIFF 格式。下文所述的 nandb 软件仅支持 TIFF 文件。
2. 下载并安装 R 和 RStudio^15,16。建议先下载并安装 R，然后再安装 RStudio。
   ​注意：以下内容描述了如何使用 nandb R 软件包。使用 nandb 无需掌握 R 语言，但了解 R 语言会使操作更加便捷。
3. 安装 nandb 软件包。
   1. 打开 RStudio，在控制台中输入 install.packages("nandb") 并等待安装完成。
4. 了解 nandb
   1. 查阅手册¹⁷。
   2. 查阅 RStudio 内置的帮助文档以了解各个函数。最常使用的函数是 brightness()。在控制台中输入 ? brightness() 即可查看该函数的帮助文件。
5. 计算亮度
   1. 假设桌面上有一个名为 img001.tif 的图像文件（注意：`nandb` 仅支持 TIFF 文件）。可以计算该图像的亮度：
      ​b <- brightness("~/Desktop/img001.tif", tau = "auto")
      1. 此命令将图像的亮度赋值给 R 中的变量 b。tau = "auto" 可确保在计算亮度前对图像进行正确的去趋势处理。接下来最常见的操作是计算图像的平均亮度或中位数亮度，可通过输入 mean(b) 或 median(b) 实现。也可以将亮度图像写入桌面，方法为输入：
         ijtiff::write_tif(b, "~/Desktop/whatever_img_name")
   2. 假设桌面上有一个名为 images_folder 的文件夹，其中包含多个图像，需要计算这些图像的亮度，并将亮度图像以 TIFF 文件形式保存。此时可查看 ?brightness_folder() 的帮助文档。该函数可一次性处理整个文件夹：
      brightness_folder("~/Desktop/images_folder", tau = "auto")
      对于偏好使用非 R 软件的用户，此功能尤为适用，因为所有文件可通过单条命令完成处理，之后即可在用户选择的软件（如 ImageJ¹⁴、Python 或其他软件）中继续处理输出的亮度 TIFF 图像。

结果

去趋势与单体亮度

数据采集完成后，即可开始进行亮度计算，以确定目标蛋白在溶液中的寡聚状态。尽管溶液中光漂白的影响可能不如在其他情况下显著 体内，强度轨迹可能仍然不具有平稳均值，这可能是由于与荧光分子相关的光物理效应所致，¹⁸ 但其背后的原因尚未完全明确。这在计算亮度时会产生影响；在试图确定单体-二聚体转变时，这一因素尤为关键。通过对所示数据应用自动去趋势算法 图2a在加入BB之前，未进行去趋势处理时，强度轨迹经过适当校正，可提供溶液中FKBP12F36V-mVenus亮度的更准确数值。 B = 1.026，而去趋势后， B = 1.005 (图2b

讨论

N&B 是一种利用配备数字探测器的商用激光扫描共聚焦显微镜检测多聚化的技术。与单点 FCS、FCCS 和 smFRET 相比，该方法具有无需校准、亮度计算简单且不受浓度影响的优点⁶。然而，在进行亮度计算之前，必须对漂白效应和长期强度波动进行校正⁹；如果忽略或错误地执行去趋势化处理，漂白和其他伪影引起的微小亮度增加可能被误判为寡聚状态的变化（如 图 2a 所示）。采用自动去趋势算法可实现准确的亮度计算。

在采集图像时，遵循若干规则非常重要。首先，必须了解分子在共聚焦体积内的停留时间及其扩散系数，以便设置共聚焦系统的合适参数；标记分子的停留时间应介于像素驻留时间与帧时间之间⁷。选择合适的荧光染料至关重要。为了获得良好的信噪比并尽量减少光漂白，需要使用亮度高且稳定的荧光染料。激光功率应保持相对较低，以避免光漂白。每个像素1至2个光子计数已...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
RosettaTM (DE3) pLysS 细胞	Novagen	70956-3
氨苄青霉素	Sigma Aldrich	PubChem Substance ID 329824407
氯霉素	Sigma Aldrich	PubChem Substance ID: 24892250
LB 起始培养物	QIAGEN
LB 培养基	QIAGEN	https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/head/search/external-link-icon.gif
IPTG	Sigma Aldrich	PubChem Substance ID 329815691
IMAC 缓冲液	Medicago	09-1010-10
无 EDTA 蛋白酶抑制剂	Sigma Aldrich	11873580001
TALON 树脂	Clonetech
镍琼脂糖凝胶	GE Healthcare
S200 16/60 层析柱	GE Healthcare
玻璃底 8 孔观察培养皿	Ibidi	80827