无需校准 体外 使用商用仪器和免费开源亮度分析软件定量检测蛋白质同源寡聚化

摘要

本方案描述了一种无需校准的蛋白质同源寡聚化定量方法 体外 基于商用光扫描显微镜的荧光涨落光谱技术。展示了正确的数据采集设置和分析方法。

摘要

数目与亮度是一种无需校准的荧光涨落光谱（FFS）技术，用于检测蛋白质同源寡聚化。该技术可利用配备数字探测器的传统共聚焦显微镜进行。本文通过一个应用实例展示了该技术在体外使用的实验方案，该实例中，通过加入二聚化药物AP20187前后，数目与亮度方法能够准确量化mVenus标记的FKBP12F36V蛋白的寡聚状态。文中讨论了正确选择显微镜采集参数以及正确的数据预处理和分析方法的重要性，尤其强调了光漂白校正方法选择的关键性。这一低成本方法可用于在多种生物学背景下研究蛋白质-蛋白质相互作用。

引言

蛋白质-蛋白质相互作用 我体外

传统上，晶体学、核磁共振实验结合冷冻电子显微镜（cryoEM）是用于精确描述蛋白质三维结构并通过对高分辨率结构细节的分析推断其功能的主要技术。然而，蛋白质并非静态结构，它们在时间和空间上可发生多种构象变化和振动。因此，晶体学或冷冻电镜（CryoEM）提供的结构信息需要与其他技术（例如，分子动力学模拟和单分子技术）相互补充：蛋白质的功能与其构象变化及相互作用密切相关，而这些信息无法从静态结构中获得。为了探测分子内的动力学行为，基于单分子 Förster 共振能量转移（smFRET）的技术非常有效¹。这些方法能够在复杂介质中评估不同分子亚群的存在状态。这一点极为重要，因为这些构象变化发生迅速，且贯穿数据采集的全过程（即 纳秒至秒级范围）。

检测和定量这些变化通常采用两种主要方法：溶液中的蛋白质和表面固定化蛋白质。对于分子间相互作用的检测，特别是配体诱导的二聚化过程，单分子荧光共振能量转移（smFRET）并不总是最佳工具。事实上，FRET不仅依赖于距离（约10 nm），还依赖于两个偶极子（供体和受体，χ）的取向²供体发射光谱与受体吸收光谱的重叠部分²

方案

1. FKBP12 F36V -mVenus 纯化

1. 将含有单体化人源 FKBP12F36V¹² 以及 N 端 His6 和 mVenus 标签的 pET22b 载体（载体可应要求提供）转化至 (DE3) pLysS 感受态细胞中。将细胞涂布于添加了 50 µg/mL 氨苄青霉素和 34 µg/mL 氯霉素的 LB 琼脂平板上。
2. 挑取转化后的单菌落接种于 100 mL LB 液体培养基中，于 37 °C 摇床培养 16 - 20 小时。
3. 将浓密的预培养液（OD600 >1）按 1:100 比例稀释至 LB 培养基中（共 2 × 500 mL），于 37 °C、200 rpm 条件下培养 2 - 3 小时，至 OD600 达 0.6 - 0.8。
4. 将培养物置于冰上冷却，加入 250 µM IPTG 诱导表达，并于 21 °C、200 rpm 条件下继续培养 16 - 20 小时。
5. 以 2,000 × g 离心 20 分钟收集菌体。
6. 将菌体沉淀重悬于 40 mL IMAC 缓冲液 A（20 mM 磷酸钠，pH 7.5，500 mM NaCl，3 mM 咪唑，1 mM β-巯基乙醇）中，同时加入无 EDTA 蛋白酶抑制剂（每份菌体沉淀加 1 片）。
7. 在冰上进行超声破碎（500 瓦，20 kHz，40% 振幅，工作 9 秒，间歇 11 秒，持续....

结果

去趋势与单体亮度

数据采集完成后，即可开始进行亮度计算，以确定目标蛋白在溶液中的寡聚状态。尽管溶液中光漂白的影响可能不如在其他情况下显著 体内，强度轨迹可能仍然不具有平稳均值，这可能是由于与荧光分子相关的光物理效应所致，¹⁸ 但其背后的原因尚未完全明确。这在计算亮度时会产生影响；在试图确定单体-二聚体转变时，这一因素尤为关键。通过对所示数据应用自动去趋势算法 图2a在加入BB之前，未进行去趋势处理时，强度轨迹经过适当校正，可提供溶液中FKBP12F36V-mVenus亮度的更准确数值。 B = 1.026，而去趋势后， B = 1.005 (图2b

讨论

N&B 是一种利用配备数字探测器的商用激光扫描共聚焦显微镜检测多聚化的技术。与单点 FCS、FCCS 和 smFRET 相比，该方法具有无需校准、亮度计算简单且不受浓度影响的优点⁶。然而，在进行亮度计算之前，必须对漂白效应和长期强度波动进行校正⁹；如果忽略或错误地执行去趋势化处理，漂白和其他伪影引起的微小亮度增加可能被误判为寡聚状态的变化（如 图 2a 所示）。采用自动去趋势算法可实现准确的亮度计算。

在采集图像时，遵循若干规则非常重要。首先，必须了解分子在共聚焦体积内的停留时间及其扩散系数，以便设置共聚焦系统的合适参数；标记分子的停留时间应介于像素驻留时间与帧时间之间⁷。选择合适的荧光染料至关重要。为了获得良好的信噪比并尽量减少光漂白，需要使用亮度高且稳定的荧光染料。激光功率应保持相对较低，以避免光漂白。每个像素1至2个光子计数已.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
RosettaTM (DE3) pLysS 细胞	Novagen	70956-3
氨苄青霉素	Sigma Aldrich	PubChem Substance ID 329824407
氯霉素	Sigma Aldrich	PubChem Substance ID: 24892250
LB 起始培养物	QIAGEN
LB 培养基	QIAGEN	https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/head/search/external-link-icon.gif
IPTG	Sigma Aldrich	PubChem Substance ID 329815691
IMAC 缓冲液	Medicago	09-1010-10
无 EDTA 蛋白酶抑制剂	Sigma Aldrich	11873580001
TALON 树脂	Clonetech
镍琼脂糖凝胶	GE Healthcare
S200 16/60 层析柱	GE Healthcare
玻璃底 8 孔观察培养皿	Ibidi	80827