需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用

方法文章

评估 c-Fos 和 Dusp1 在癌基因依赖性中作用的方法

7.9K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/58194

⸱

2019年1月7日

 ,  , 
1Cancer Blood Disease Institute, Divisions of Experimental Hematology and Cancer Pathology, Cincinnati Children's Hospital Medical Center

本文内容

摘要

本文描述了利用体外和体内遗传学方法以及人源化小鼠模型，对c-Fos和Dusp1作为白血病药物靶点进行遗传学和化学验证的实验方案。该方法可广泛应用于任何靶点的遗传学验证及治疗开发。

摘要

酪氨酸激酶抑制剂（TKIs）在治疗慢性髓性白血病（CML）中的成功应用，标志着癌症治疗进入了一个新时代。然而，仍有一小部分细胞对TKI治疗无反应，导致微小残留病（MRD）的存在；即使是效力最强的TKIs也无法根除这些细胞。这些MRD细胞可作为治疗耐药的储备库。目前尚不清楚TKI治疗为何对MRD细胞无效。已有研究表明，生长因子信号通路在TKI治疗期间支持MRD细胞的存活，但其具体机制仍不明确。近期研究发现，由于癌基因信号与生长因子信号在MRD细胞中汇聚，导致c-Fos和Dusp1表达升高，从而介导了TKI耐药性。通过遗传或化学手段抑制c-Fos和Dusp1可使CML对TKIs高度敏感，并在基因工程小鼠模型和人源化小鼠模型中实现CML的治愈。我们利用TKI敏感与耐药细胞的多个微阵列数据鉴定出这些靶基因。本文提供了在体外和体内小鼠模型中进行靶点验证的方法。这些方法可便捷地应用于任何靶基因的遗传学验证及治疗开发。

引言

BCR-ABL1 融合癌基因的组成性酪氨酸激酶活性导致慢性髓性白血病（CML），这为使用小分子抑制剂靶向该激酶活性提供了理论依据。酪氨酸激酶抑制剂（TKIs）在治疗CML患者中的成功，彻底改变了靶向治疗的概念1,2随后，针对多种其他恶性肿瘤（包括实体瘤）的抗激酶治疗作为精准医学得以发展。迄今为止，美国FDA已批准三十多种激酶抑制剂用于治疗多种恶性肿瘤。尽管酪氨酸激酶抑制剂（TKI）治疗在抑制疾病方面非常有效，但并不能实现治愈。此外，在治疗过程中仍有一小部分癌细胞持续存在：即微小残留病灶（MRD）3,4,5即使是达到完全缓解的患者仍会残留微小残留病（MRD），若不持续抑制，最终将导致疾病复发。因此，根除MRD细胞对于实现持久或治愈性疗效至关重要。慢性髓性白血病（CML）为阐明精准医学概念、肿瘤发生机制、靶向治疗的合理设计、疾病进展及药物耐药机制提供了重要的研究范式。然而，直至今日，酪氨酸激酶抑制剂（TKI）诱导癌细胞死亡的具体机制仍未完全阐明，同时也不清楚为何MRD细胞（主要由白血病干细胞[LSCs]构成）对TKIs具有内在耐药性。4,6然而，这一现象的 "癌基因依赖性" 突变型激酶癌蛋白与酪氨酸激酶抑制剂（TKI）疗效相关，TKI对靶向癌基因的急性抑制可引发癌基因休克，进而以细胞环境依赖的方式导致强烈的促凋亡反应或细胞静息状态6,7,8,9然而，癌基因依赖性的机制基础尚不明确。近期研究指出，生长因子信号通路可消除癌基因依赖性，从而导致对酪氨酸激酶抑制剂（TKI）治疗产生耐药性。10,11,12因此，为了深入了解癌基因依赖的机制，我们对具有BCR-ABL1依赖性和非依赖性（在生长因子存在下培养）的细胞进行了全基因组表达谱分析，结果表明c-Fos和Dusp1是癌基因依赖的关键介导因子。13c-Fos 和 Dusp1 的基因缺失对表达 BCR-ABL1 的细胞具有合成致死效应，实验所用小鼠未发生白血病。此外，使用小分子抑制剂抑制 c-Fos 和 DUSP1 可治愈小鼠中 BCR-ABL1 诱导的慢性髓系白血病（CML）。结果表明，c-Fos 和 Dusp1 的表达水平决定了癌细胞的凋亡阈值，较低的表达水平使细胞对药物敏感，而较高的表达水平则导致治疗耐药。13.

为了鉴定驱动癌基因依赖性的基因，我们利用小鼠来源和慢性髓性白血病（CML）患者来源的细胞（K562），在存在生长因子和酪氨酸激酶抑制剂（伊马替尼）的条件下，开展了多项全基因组表达谱分析实验。这些数据与来自CML患者CD34+细胞的数据集进行了平行分析。+ 伊马替尼处理前后造血干细胞的分析揭示了三个在酪氨酸激酶抑制剂耐药细胞中共同上调的基因（一个转录因子[c-Fos]、双特异性磷酸酶1[Dusp1]和一个RNA结合蛋白[Zfp36]）。为了验证这些基因在介导药物耐药性中的重要性，我们进行了逐步实验 体外 和 体内 分析。通过在耐药细胞中进行实时定量PCR（RT-qPCR）和蛋白质印迹实验，验证了这些基因的表达水平。进一步利用shRNA发夹结构对c-Fos、Dusp1和Zfp36进行cDNA过表达和敲低实验，结果表明，c-Fos和Dusp1表达水平的升高足以且必需介导酪氨酸激酶抑制剂（TKI）耐药性。因此，我们仅针对c-Fos和Dusp1在小鼠模型中进行了体内验证。为对c-Fos和Dusp1进行遗传学验证，我们构建了ROSACreERT诱导型c-Fosfl/fl 小鼠（条件性基因敲除）14 并与 Dusp1 杂交-/- （完全敲除）15 以制作 ROSACreERT2-c-Fosfl/flDusp1-/- 双转基因小鼠。骨髓来源的 c-Kit+ 细胞（来自 c-Fos）fl/fl-，Dusp1-/-- 和 c-Fosfl/flDusp1-/-表达BCR-ABL1的细胞被分析 体外 在菌落形成单位（CFU）实验中，以及 体内 通过将骨髓移植至致死剂量照射的小鼠体内，检测单独或联合缺失c-Fos和Dusp1对白血病发生的影响。同样，使用DFC（二氟化姜黄素）对c-Fos进行化学抑制16 以及通过BCI（苯亚甲基-3-(环己氨基)-2,3-二氢-1H-茚-1-酮）抑制Dusp117 在体外和体内利用表达BCR-ABL1的骨髓来源c-Kit+ 来自野生型（WT）小鼠的细胞。为了验证c-Fos和Dusp1在白血病干细胞中的必要性，我们采用了一种慢性髓系白血病（CML）小鼠模型，该模型通过多西环素诱导在干细胞中特异性表达BCR-ABL1（Tet-转录激活因子在小鼠干细胞白血病（SCL）基因3'增强子调控下表达）18,19我们使用了骨髓 Lin-Sca+c-Kit+ (LSK) 细胞进行体内移植实验。此外，我们分别将磷酸化 p38 水平和 IL-6 表达确立为 Dusp1 和 c-Fos 抑制作用的药效动力学生物标志物。 体内最后，为了增强研究对人类的相关性，采用患者来源的CD34+ 细胞（相当于 c-Kit）+ 来自小鼠的细胞经过长期体外培养起始细胞检测（LTCIC）以及慢性髓性白血病的人源化小鼠体内模型验证20,21将慢性髓性白血病（CML）的CD34+细胞移植到免疫缺陷小鼠体内，随后进行药物治疗并分析人源白血病细胞的存活情况。

在本项目中，我们利用遗传学和化学工具，结合不同的临床前模型，开发靶点识别与验证的方法。这些方法可成功应用于其他靶点的验证，并为治疗开发研制相应的化学干预手段。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

所有动物实验均按照辛辛那提儿童医院医疗中心（CCHMC）机构动物照护与使用委员会（IACUC）的指南进行。人类样本（正常骨髓及慢性髓性白血病（p210-BCR-ABL+）患者的骨髓）是通过经机构审查委员会批准的方案（机构审查委员会：全美范围保证编号 #00002988，辛辛那提儿童医院医疗中心）并取得来自辛辛那提儿童医院医疗中心和辛辛那提大学捐赠者的知情同意后获取的。

1. 实时定量PCR分析

  1. 从在添加了10% FBS和10% WEHI条件培养基（作为白细胞介素-3（IL-3）来源）的RPMI培养基中生长的BaF3细胞中分离总RNA。
  2. 从经处理（含IL-3和伊马替尼）及未处理的样品中收集处于对数生长期（99%存活率）的细胞，并在435 × g 条件下离心3分钟。细胞的健康状态和生长阶段至关重要，因其基因表达谱可能发生显著变化。
  3. 通过纯化方法提取总RNA22。定量总RNA后，进行DNase处理23。取等量无DNA的RNA（2 µg），使用逆转录酶合成cDNA24。
  4. 使用基因特异性引物（表1）进行qPCR。在0.2 mL薄壁带光学盖的PCR管中配制20 µL反应体系，包含1×聚合酶混合液（见材料表）、每种引物0.5 µM、1 µL DNA模板及适量水。将反应置于热循环仪中按以下程序运行：第一步，95 °C 预变性10分钟；第二步，95 °C 变性15秒；第三步，60 °C 退火延伸1分钟；第四步，重复第二至第三步共40个循环。所有qPCR实验均设三个重复，数据分析前以β-actin表达水平进行归一化处理。

2. 蛋白质印迹法

注意：全细胞提取物的制备方法如下：加入 250 µL 1x 裂解缓冲液（参照 Kesarwani 等人的描述13），并添加蛋白酶抑制剂混合物和磷酸酶抑制剂混合物 2。

  1. 通过在 4 °C 条件下以 435 × g 离心 3 分钟，从经处理（含 IL-3 和伊马替尼）和未处理的 BaF3 细胞中收集处于对数生长期（99% 活性）的五百万个细胞。用移液器将细胞重悬于 250 µL 裂解缓冲液中 1 次，随后在 80 °C 孵育 5 分钟以裂解细胞。在 4 °C 冷室中，对裂解物进行超声处理，采用 5–6 次脉冲，每次 5 秒，以降解所有 DNA。
  2. 将裂解物转移至 1.5 mL 离心管中，在 16,000 × g 离心 5 分钟以去除不溶性物质。提取物可保存于 -80 °C 直至使用。上样前，在金属浴中将样品于 80 °C 加热 5 分钟。使用加样枪头将 10 µL 样品加至 10% SDS-PAGE 凝胶中。
  3. 以 150 V 电压电泳分离蛋白，直至示踪染料迁移至凝胶底部。通过电泳转膜法在 1 安培电流下转膜 1 小时，将蛋白转移至硝酸纤维素膜。转膜后，用含 5% 脱脂奶粉的 1× Tris-缓冲盐水 + 0.1% Tween 20（TBST）封闭膜 1 小时，并在 4 °C 条件下与适当的一抗以 1:1,000 稀释度孵育过夜。
  4. 用 TBST 洗涤膜 3 至 5 次，每次 10 分钟；随后在室温下用适当 HRP 标记的二抗（1:5,000 稀释）孵育 1 小时。TBST 用量取决于容器大小，确保膜完全浸没于溶液中。再用 TBST 洗涤二抗 3 次，每次 5 分钟。
  5. 使用化学发光底物试剂显影。使用前，将两瓶中的底物溶液与缓冲液等体积混合。用 1 mL 移液器将底物加至膜表面，确保完全覆盖膜，孵育 1 分钟。应在加入底物后 1–10 分钟内对印迹进行成像。
  6. 使用钝头镊子小心将膜放置于成像系统平台（见材料表），避免带入过多液体。选择实时预览模式，并从菜单中选择“印迹”和“化学发光”选项。采用手动采集模式，在不同时间点采集多个曝光图像。这些文件可使用成像软件进行可视化分析和定量。

3. 基因敲除小鼠的制备

  1. 将 c-Fosfl/fl小鼠与ROSACreERT2小鼠杂交，以获得ROSACreERT2c-Fosfl/fl小鼠13。为构建双基因敲除（KO）小鼠，将ROSACreERT2c-Fosfl/fl 小鼠与Dusp1-/-小鼠交配，以获得ROSACreERT2c-Fosfl/fl Dusp1-/- 小鼠13。通过剪取尾尖组织并进行PCR进行基因型鉴定，具体方法如下所述。
  2. 基因型鉴定：
    1. 准备基因组DNA时，用剪刀剪取少量尾尖组织，放入1.5 mL离心管中。用加热的剪刀对尾部创口进行烧灼止血。向管中加入200 µL 50 mM NaOH，于95 °C金属浴中孵育1小时。
    2. 充分涡旋混匀后，加入50 µL 1 M Tris HCl（pH 6.8）进行中和，再次涡旋混匀。以最大转速离心1分钟。
    3. 在0.2 mL薄壁PCR管中进行20 µL反应体系的PCR扩增，反应体系包含含染料的1×Taq DNA聚合酶预混液、每种引物0.5 µM、1 µL DNA模板及去离子水。将PCR管放入热循环仪，按照表2所示程序运行相应循环。
    4. 将PCR产物在2%琼脂糖凝胶上电泳，并使用凝胶成像系统拍照记录结果。

4. 从骨髓中分离 c-Kit+ 细胞

  1. 根据机构指南处死小鼠。
    注意： 在此，小鼠暴露于二氧化碳（CO₂）中2按照美国兽医协会（AVMA）推荐的流速，使用二氧化碳安乐死，直至呼吸和心跳停止确认动物死亡，随后进行颈椎脱臼处死。
  2. 收获腿部样本骨骼 从小鼠中取出两根股骨、两根胫骨和两块髂骨。用手术刀刮除骨骼上的所有组织。将腿骨放入含有5 mL冷的1×PBS的15 mL离心管中，置于冰上。将管内内容物倒入研钵中，用研杵研碎。
  3. 将细胞悬液通过70 µm细胞滤器过滤至带有10 mL移液管的50 mL螺口管中，使用移液管操作。用预冷的1×PBS多次冲洗研钵和研杵，收集冲洗液并加入细胞悬液至50 mL管中。以1,200 x g 4 °C 下离心 5 分钟。弃去上清液 通过 用连接玻璃移液管的真空装置吸除上清。用移液器将细胞沉淀重悬于5 mL 1×PBS中。
  4. 用移液器将悬浮的骨髓缓慢加至5 mL室温（温度至关重要）的多蔗糖溶液顶部，注意不要扰动界面。在400 x g条件下离心 g 室温下，关闭离心机制动，离心20分钟。
  5. 用移液器收集浑浊的总单个核细胞（TMNC）界面，转移至新的15 mL离心管中。用1×PBS补至10 mL进行洗涤，取20 µL用于计数，然后以1,200 × g离心 g 4 °C 下离心 5 分钟。弃去上清液，将沉淀物置于冰上，用于步骤 4.6.1。
  6. 进行 c-Kit+ 细胞分离
    1. 遵循c-Kit微珠试剂盒的操作流程+ 细胞分离。将细胞沉淀重悬于80 µL的1x PBS + EDTA + BSA中，至107 细胞。向细胞悬液中加入20 µL CD117 MicroBeads/107 总细胞。涡旋振荡充分混匀，4 °C 孵育 10 分钟。加入 1× PBS + EDTA + BSA 将体积补至 10 mL，于 1,200 × g 离心 g 4 °C 下孵育 5 分钟。
    2. 通过真空抽吸去除上清液，并将细胞沉淀重悬于 500 µL/108 1× PBS + EDTA + BSA 中的总细胞。将磁力架与磁柱连接后，加入 3 mL 1× PBS + EDTA + BSA，依靠重力使其流入 15 mL 收集管中。
    3. 第一个缓冲液加入完成后流经层析柱时，将细胞悬液加至层析柱中，使其自然流下 通过 重力作用下流入15 mL收集管中。此流穿部分为不需要的细胞组分。
    4. 用 3 mL 1× PBS + EDTA + BSA 洗柱 3 次，每次让液体自然流下 通过 重力作用下流入收集管中。将柱子从磁铁上取下，置于15 mL离心管顶部。
    5. 加入5 mL 1× PBS + EDTA + BSA，立即使用随柱提供的推杆彻底冲洗。移除推杆，再用额外的5 mL 1× PBS + EDTA + BSA重复冲洗一次。采用标准方法对总体积中的细胞进行计数。
    6. 以 1,200 x g 离心细胞 g 4 °C 下离心 5 分钟。弃去上清液，将沉淀重悬于完全 IMDM 培养基（IMDM + 10% FBS + IL-6 [10 ng/mL] + mSCF [50 ng/mL] + FLT3 配体 [20 ng/mL] + IL-3 [10 ng/mL]）中进行培养。将这些细胞在 2 x 106 细胞/1 mL 细胞 IMDM 完全培养基，置于 37 °C、5% CO₂ 的培养箱中培养2.

5. 转导

  1. 逆转录病毒质粒转染
    1. 前一天下午在37 °C水浴中新鲜解冻HEK293细胞。将含有HEK细胞的冻存管在435 x g 室温孵育 3 分钟。去除上清液 通过 在真空条件下将细胞沉淀重悬于1 mL添加有10% FBS、青霉素、链霉素和谷氨酰胺的DMEM培养基中。
    2. 计数细胞，并加入适量体积至10 cm处理过的培养皿（约4 × 10⁶个细胞）6 HEK293T 细胞。向培养皿中加入 14 mL DMEM 10 培养基，通过上下轻柔晃动充分混匀以确保分布均匀。将培养皿置于 37 °C、5% CO₂ 的培养箱中。2 培养箱中孵育过夜。
    3. 次日早晨，在倒置光学显微镜下观察细胞汇合度（50%或以上即可）。
    4. 将DNA（目标逆转录病毒质粒）、PclEco（包装质粒）与2 M CaCl₂2，和 H20，置于1.5 mL离心管中（总体积为500 µL），使用微量移液器依次加入以下成分：7.5 µg DNA（BCR-ABL1-YFP）、7.5 µg pCLeco、62 µL 2 M CaCl₂2，加水至终体积为500 µL。另取一支1.5 mL离心管，加入500 µL的2×HBS。
    5. 将DNA混合液逐滴加入含有500 µL 2x HBS（280 mM NaCl，100 mM HEPES，1.5 mM Na2HPO4) 混合过程中，将涡旋振荡器调至最低转速，将 HBS 管置于其上保持持续混匀，同时加入转染混合物。
    6. 将转染混合物在室温下孵育20–30分钟。孵育期间，向HEK细胞中加入25 nM氯喹，并将细胞放回培养箱中。孵育结束后，将转染混合物逐滴加入HEK细胞中，然后轻轻摇晃培养基，使转染混合物在培养板中均匀分布。
    7. 将细胞与混合液在37 °C、5% CO₂条件下孵育约8 h2 培养箱。通过缓慢加入14 mL新鲜DMEM 10培养基来更换这些细胞的培养液。移液时沿培养皿壁缓慢加入，有助于防止HEK细胞脱落。将细胞置于37 °C、5% CO₂培养箱中过夜培养。2 培养箱
    8. 用10 mL注射器收集病毒上清液，将上清液吸入注射器中，连接0.45 µm注射器滤器。将病毒上清液推入新的收集管中。约16小时后进行第一次病毒上清液收集。
  2. 纤连蛋白病毒浓缩与转导
    1. 向未处理的6孔培养板中加入2 mL含0.1 mg重组人纤连蛋白片段的1×PBS溶液。根据细胞数量和基因型需求准备相应量的纤连蛋白。每孔足以转导1000万个c-Kit阳性细胞+ 细胞。将培养板在 4 °C 下孵育过夜。
    2. 第二天，用移液器从孔中移除纤连蛋白，每孔加入2 mL含2% BSA的无菌1×PBS以封闭孔板，在室温下孵育30分钟。通过真空泵吸除BSA溶液，再用移液器加入2 mL 1×PBS充分洗涤，随后用真空泵吸除PBS。
    3. 立即加入新鲜收集并过滤（0.45 µm）的病毒上清液，至多5 mL。在435 x g 在 32 °C 下孵育 2 小时。去除上清液 通过 抽真空，加入更多新收集的病毒上清液，重复此步骤，再次离心。移除上清液 通过 抽真空，并加入2 mL 1×PBS洗涤各孔，然后移除液体 通过 真空
    4. 加入 c-Kit+ 将过夜培养的小鼠细胞（步骤 4.6.6）加入病毒包被的孔中，充分混匀细胞悬液后，用移液器将其接种至已含浓缩病毒的纤维连接蛋白包被板中。在 1,200 x g 在25 °C下孵育90分钟。将细胞置于37 °C、5% CO₂条件下2 培养箱
    5. 转导后48小时，以1,200 x g离心力离心收集细胞。 g 4 °C 下离心 5 分钟，弃上清，将细胞重悬于 FACS 缓冲液 #1（1x PBS + 0.5% BSA）中，调整细胞浓度至 6 x 10⁶6/mL。通过流式细胞术检测YFP阳性细胞百分比，确定BCR-ABL1阳性细胞的比例。
    6. 使用标准程序采集事件。首先，根据前向散射和侧向散射对活细胞设门。然后，基于阴性对照排除YFP阴性细胞，对YFP阳性活细胞设门。图4).

6. 菌落形成单位测定

  1. 将含细胞因子的甲基纤维素在室温下解冻1–2小时。使用5 mL无针头注射器，将3 mL甲基纤维素分装至FACS管中。在细胞分选仪上分选YFP阳性细胞。
  2. 离心细胞，将沉淀重悬于IMDM完全培养基中。计数待接种的细胞，并稀释至每100 µL IMDM完全培养基中含有5,000个YFP阳性细胞。
  3. 将含5,000个YFP阳性细胞的100 µL细胞悬液及相应的抑制剂加入3 mL甲基纤维素中（参见材料表）。高速涡旋振荡10–30秒以充分混匀。
  4. 待大部分气泡逸出后，使用1 mL注射器将1 mL培养基接种至三个重复的3 cm培养皿中：将培养基从一侧注入，缓慢倾斜并旋转培养皿，使培养基均匀铺展。
  5. 所用抑制剂的终浓度分别为：伊马替尼3 µM、DFC 0.2 µM、BCI 0.5 µM，可单独或联合使用。在适当情况下，通过在甲基纤维素中添加4-羟基他莫昔芬（1 µg/mL）以实现c-Fos的删除。
  6. 接种后，将培养皿放入一个大号培养皿中，并在中央放置一个盛有2 mL无菌水的开放小皿以维持湿度。盖上大号培养皿，于37 °C、5% CO2培养箱中小心孵育。接种一周后，在显微镜下计数各培养皿中菌落总数并记录。
  7. 选取适当培养皿中的部分菌落，通过PCR分析c-Fos的删除情况。使用P1000移液枪头吸取收集菌落，通过多次冲洗枪头于500 µL 1×PBS中使细胞脱离。将细胞悬液以6,000 × g离心1分钟，使用基因组DNA提取试剂盒从细胞沉淀中提取DNA。
  8. 使用引物mFos-FP3和mFos-RP5对提取的基因组DNA进行PCR扩增（参见表2）。将PCR产物在2%琼脂糖凝胶上电泳，并使用凝胶成像系统拍照分析。
  9. 为直观展示菌落形态，可使用碘硝基四氮唑氯盐（Iodonitrotetrazolium chloride）对菌落进行染色。将10 mg碘硝基四氮唑氯盐溶于10 mL水中，配制成1 mg/mL的溶液。在超净台内无菌操作条件下，使用带0.2 µm滤膜的鲁尔锁注射器连接10 mL注射器，对溶液进行过滤除菌。
  10. 在超净台内，将100 µL染色液沿CFU培养皿边缘逐滴加入，注意避免滑动或扰动菌落。将培养皿置于37 °C、5% CO2细胞培养箱中过夜孵育。菌落将变为深红褐色。在无菌超净台内使用白色背景，对染色后的CFU培养皿进行拍照记录。

7. 移植与死亡率检测

  1. 使用基于137Cs的γ射线，以7.0 Gy剂量对小鼠进行致死性照射，3小时后追加4.75 Gy（0.5 Gy/min），分次照射完成后进行移植。
  2. 移植 4 x 104 未分选的YFP阳性（基于YFP百分比计算）细胞，数量为3 x 105 通过尾静脉注射将正常骨髓细胞作为载体注入每只小鼠体内。
  3. 移植一周后，通过流式细胞术分析外周血中YFP阳性细胞以确定移植情况。
  4. 进行尾静脉采血并进行流式细胞术分析。
    1. 在加热灯下小心加热小鼠笼子，注意避免过热或烫伤小鼠。
    2. 将小鼠固定在小鼠固定器中，用无菌刀片划破尾静脉。从前向后轻轻挤压尾部，使血液形成血滴。用肝素化毛细管收集血液，直至毛细管充满（收集约75–100 µL）。将充满血液的毛细管中的血液注入含EDTA的采血管中，并充分混匀。
    3. 通过将 30–40 µL 血液加入 3 mL 1x RBC 裂解缓冲液（150 mM 氯化铵、10 mM 碳酸氢钾和 0.13 mM EDTA）中裂解红细胞。充分混匀，反复倒置离心管数次。室温孵育 10–15 分钟。在 1,200 x g 4 °C 下离心 5 分钟。弃去上清液 通过 用真空抽吸去除上清，将沉淀重悬于2 mL 1×PBS中进行洗涤。
    4. 以 1,200 x 转速离心 g 4 °C 下离心 5 分钟。弃去上清液，并将沉淀重悬于 FACS 缓冲液 #1 中。按照上述步骤 5.2.5–5.2.66 所述进行 FACS 分析。剩余血液可短期保存于采集管中，置于 4 °C，可用于其他多种用途。
  5. 外周血中YFP阳性细胞比例为10–40%的移植小鼠用于实验。YFP阳性细胞比例低于2%的小鼠被排除在研究之外。
  6. 在60 °C条件下，将他莫昔芬以20 mg/mL的浓度溶于玉米油中，间歇性涡旋振荡至完全溶解，避光保存于4 °C，供治疗期间使用。移植后一周，删除c-Fosfl/fl 等位基因，通过腹腔注射（i.p.）将他莫昔芬（100 mg/kg，溶于玉米油中）给予小鼠，连续三天每日一次。在注射前必须称量小鼠体重，以确定所需注射的他莫昔芬剂量。在他莫昔芬处理后（如适用），将小鼠分组进行药物治疗（n = 5/组）
  7. 监测小鼠白血病进展和存活情况，并在存活小鼠中每周通过流式细胞术检测白血病负荷（YFP阳性细胞），持续八周。
  8. 根据上述第6节所述，适时分析血液中c-Fos的缺失情况。每天记录存活小鼠数量，并在实验结束时使用绘图软件绘制生存曲线。

8. BCR-ABL1 白血病的转基因小鼠模型

  1. LSK 细胞分离
    1. 将Scl-tTA转基因小鼠饲养在含多西环素的饲料中，以抑制BCR-ABL1的表达。在移植前四周，撤除多西环素饲料，以启动BCR-ABL1的表达。
    2. 按照第4节所述方法，从Scl-tTA转基因小鼠中分离TMNCs。将TMNCs重悬于FACS缓冲液#2（1x PBS + 0.5% BSA + 2 mM EDTA）中，以获得106 cells/mL
    3. 通过每 1 × 10⁷ 个胸腺基质非上皮细胞（TMNCs）加入 10 µL 生物素标记的谱系细胞检测试剂盒（含针对 CD5 [大鼠 IgG2a]、CD11b [大鼠 IgG2a]、CD45R [B220，大鼠 IgG2a]、Anti-7-4 [大鼠 IgG2a]、Anti-Gr-1 [Ly-6G/C，大鼠 IgG2a] 和 Anti-Ter-119 [大鼠 IgG2b] 的生物素偶联单克隆抗体），去除谱系阳性细胞6 细胞。将细胞于4 °C避光孵育10分钟，随后加入5 mL FACS缓冲液#2洗涤，以1,200 x g 4 °C 下离心 5 分钟。完全吸除上清液，并将细胞重悬于 400 µL FACS 缓冲液 #2 中。
    4. 加入 5 µL 抗生物素抗体-FITC 偶联物、1.2 µL Ly-6A/E (Sca1)PECy7 和 2.4 µL CD117 (c-Kit) APC 抗体，用于最多 10 个样本8 百万个细胞。室温避光孵育10分钟。用5 mL FACS缓冲液#2重悬洗涤；随后，以1,200 x g 4 °C 下离心 5 分钟。弃去上清液，将细胞沉淀重悬于 500 µL FACS 缓冲液 #2 中。
    5. 将细胞悬液过滤至带有蓝色滤帽的FACS管中。
    6. 使用前向散射和侧向散射对活细胞进行门控。随后，选择 lin- 荧光强度均值（MFI）小于10的细胞2) 以获得LSK细胞c-Kit+ 和 Sca1+ 在来自 Lin 的双指数图上- 亲本，并进行分选（图7C).
    7. 收集分选后的细胞，于1,200 x g离心 g 4 °C 下孵育 5 分钟。
  2. 移植
    1. 在移植前，对BoyJ小鼠进行致死性照射，分次给予辐射剂量，先照射7.0 Gy，3小时后再照射4.75 Gy。
    2. 注射 3 x 103 至 5 × 103 BCR-ABL1-LSK 细胞，数量为 0.3 × 106 通过尾静脉（i.v.）将来自野生型BoyJ小鼠的辅助骨髓细胞移植到经照射的BoyJ小鼠体内。
    3. 移植后四周，对受体小鼠进行CD45.1和CD45.2分析。通过尾静脉采血（如步骤7.4所述）获取外周血中的TMNC。将细胞重悬于100 µL FACS缓冲液中。在室温下，加入各1 µL的CD45.1-FITC和CD45.2-PE抗体，孵育1小时。
    4. 用FACS缓冲液将细胞悬液体积补至3 mL，洗涤细胞，然后以1,200 x g离心 g 4 °C 下离心 5 分钟。弃上清液，将沉淀重悬于 200 µL 1x PBS 中。
    5. 根据前向散射和侧向散射对活细胞进行设门，然后根据未染色样本设门 FITC 和 PE 阳性细胞，分析 CD45.1 和 CD45.2 的百分比。
    6. 将小鼠分为四组（n 每组6只。单独使用伊马替尼（75 mg/kg，每日2次）以及伊马替尼联合DFC和BCI治疗（两种药物剂量均为10 mg/kg，每日2次）。
    7. 同样，分别给予其他组小鼠伊马替尼（75 mg/kg）+ 姜黄素（150 mg/kg）+ BCI（10 mg/kg）以及伊马替尼（75 mg/kg）+ NDGA（100 mg/kg）+ BCI（10 mg/kg）的组合处理，每日两次，连续注射给药三个月。 i.p.
    8. 每月对小鼠进行一次外周血尾静脉采血，按步骤7.4所述检测外周血中CD45.2阳性细胞百分比，持续六个月，以分析白血病嵌合率。

9. BCI与DFC活性的体内评估

  1. 磷酸化p38分析
    1. 取三只已移植表达BCR-ABL1的c-Kit+细胞的白血病小鼠（8–12周龄），如第7节所述。在移植后四周，通过腹腔注射给予小鼠BCI（10 mg/kg）。
    2. 根据供应商说明书，使用磷酸化流式细胞术检测试剂盒检测外周血TMNC中磷酸化p38的水平。在给药前及给药后6小时分别采集每只小鼠的血液。通过红细胞裂解法分离TMNC，并按如下步骤进行固定。
    3. 每100 µL外周血中加入4 mL红细胞裂解液，混匀后冰上孵育5分钟以裂解红细胞。在4 °C下以1,200 × g离心5分钟，弃上清。再重复裂解一次。
    4. 第二次裂解后，用1 mL含2% BSA的PBS洗涤细胞沉淀。加入100 µL固定和透化溶液以固定细胞，在4 °C避光孵育20分钟。在4 °C下以1,200 × g离心5分钟，收集细胞沉淀。
    5. 用1 mL 1×透化洗涤液洗涤细胞沉淀。加入300 µL含2% BSA的透化洗涤缓冲液，在室温下封闭20分钟。将细胞分为三等份，每份100 µL（约1 × 106个细胞）。
    6. 向每份固定的细胞中分别加入1 µL总p38抗体、1 µL磷酸化p38抗体或1 µL同型IgG对照抗体，4 °C孵育过夜。
    7. 用5 mL含2% BSA的PBS洗涤细胞一次，然后加入1 µL Alexa Fluor-488标记的二抗，室温孵育1小时。再次洗涤一次，将细胞重悬于200 µL 1× PBS中。
    8. 使用FACS获取数据，并通过流式细胞术分析软件进行分析。
    9. 从实验样本的MFI中减去IgG对照的MFI。将磷酸化p38的MFI值相对于总p38的MFI进行归一化，以确定BCI注射后的磷酸化p38水平。
  2. c-Fos靶基因的定量基因表达分析
    1. 取三只已移植表达BCR-ABL1的c-Kit+细胞的白血病小鼠（8–12周龄），如第7节所述。采集每只小鼠的外周血，然后给予每只小鼠DFC和BCI各10 mg/kg。
    2. 在给药后6小时采集外周血。如上所述通过红细胞裂解法分离TMNC。收集TMNC沉淀，并将其悬浮于基于酚的裂解缓冲液中（见材料表）。
    3. 使用基因特异性引物（见表1），对Bcl2l11、Lif和IL-6进行RT-qPCR分析（如第1节所述）。

10. 长期培养起始细胞检测

注意： LTCIC 实验按先前所述方法进行25。

  1. 在T175细胞培养瓶中，使用MEMα培养基将小鼠成纤维细胞系MS-5培养至完全汇合。按照前述HEK293T细胞的方法进行胰酶消化。将细胞重悬于MEMα培养基中，浓度为2 × 106 个细胞/mL。取10 × 106 个细胞置于50 mL锥形管中，以80 Gy剂量辐照。随后将细胞用添加10%胎牛血清（FBS）的MEMα培养基（M10）稀释至0.5 × 106 个细胞/mL。每孔加入2 mL接种于12孔板中，置于37 °C、5% CO2培养箱中过夜培养。
  2. 次日，在生物安全柜中将2.5 mg氢化可的松琥珀酸钠溶于5 mL MEMα中（1 M溶液），使用0.2 µm注射器滤器过滤除菌。用MEM培养基进行系列稀释，获得100 µM的工作液。在使用前，取250 µL该溶液加入25 mL人长期培养基（HLTM）中（见材料表），使终浓度为1 µM。
  3. 离心收集CML-CD34+细胞和UCP3 TMNCs，通过短暂涡旋将其重悬于HLTM培养基中，并用血细胞计数板进行细胞计数。
  4. 吸除接种了基质细胞的12孔板中的M10培养基，每孔加入1 mL含患者细胞（CML-CD34+ [10,000个] 和 UCP3 TMNCs [1 × 106个]）的HLTM细胞悬液。每种细胞类型每种药物组合设三个复孔。
  5. 将药物储备液用HLTM培养基稀释至所需浓度的2倍。向上述细胞中加入1 mL含药物的培养基，使终浓度为1倍浓度。每周更换一半培养基，使用新配制的HLTM培养基，持续五周。
  6. 六周LTC-IC实验结束后，收集各培养孔中的非贴壁细胞至离心管中。用胰酶消化贴壁细胞，并将其与对应的非贴壁细胞合并。
  7. 洗涤细胞后，在含30%胎牛血清、促红细胞生成素（3单位/mL）、SF（50 ng/mL）、IL-3（20 ng/mL）、IL-6（20 ng/mL）、G-CSF（20 ng/mL）以及粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）（20 ng/mL）的甲基纤维素培养基中进行CFU集落形成检测。使用血细胞计数板进行细胞计数。
  8. 每组取5 × 104 个细胞接种，设三个重复孔。剩余细胞用含20% FBS和10% DMSO的冻存液冻存。将培养板置于一个大号培养皿中，中间放置一个盛有水的开放小皿以维持湿度。小心盖上大培养皿，置于37 °C、5% CO2培养箱中培养两周。
  9. 两周后对集落进行计数（在某些情况下，仅对部分收获细胞进行CFU检测）。根据部分细胞收获物所获得的CFU数量进行外推，计算初始细胞悬液中LTC-IC的总数。每个LTC-IC平均可产生8个CFU。
    注意：例如，若初始每孔接种1 × 106 个细胞，五周后收获0.5 × 106 个细胞，进行CFU检测时接种5 × 104 个细胞并获得50个CFU，则相当于每百万接种细胞产生500个CFU。将该数值除以8，得到LTC-IC数量为62.5。

11. 利用慢性髓性白血病 CD34+ 细胞构建人源化小鼠模型

  1. 使用7.0 Gy（700 rad）单次剂量、50 rad/min的照射率，对表达人IL3、GM-CSF和SCF的8周龄NOD scid gamma小鼠（NSGS）进行亚致死性照射。
  2. 通过静脉注射，将来自BCR-ABL1阳性慢性期慢性髓系白血病（CML）患者的3 × 106个CD34+筛选细胞注入经照射的小鼠体内。
  3. 移植两周后，使用针对CD45的小鼠和人特异性抗体，通过FACS检测骨髓中的白血病细胞植入情况。
  4. 进行FACS分析。
    1. 采集移植小鼠股骨中的骨髓穿刺液。如上所述使用红细胞裂解缓冲液裂解红细胞，并通过离心收集TMNCs。用冷的1×PBS洗涤沉淀物一次。
    2. 使用人FcR阻断剂和小鼠FcR阻断剂对细胞进行封闭，随后在4 °C条件下过夜孵育抗人CD45-FITC和抗小鼠CD45-APCCy7抗体。在LSRII仪器上进行FACS分析，并使用流式细胞术分析软件处理数据。
  5. 将小鼠分为四组不同队列（n = 6/组），分别给予溶剂对照、伊马替尼（75 mg/kg）、DFC + BCI（均为10 mg/kg）或伊马替尼（75 mg/kg）联合DFC + BCI（均为10 mg/kg）治疗。将储备药物溶于1×PBS（溶剂）中，并通过腹腔注射方式每日给药两次。
  6. 持续治疗小鼠六周，并每两周检测一次白血病负荷，直至移植后第八周，检测方法同上文11.4所述。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

癌基因成瘾被认为是酪氨酸激酶抑制剂（TKIs）治疗有效的机制之一。然而，驱动癌基因依赖性的具体机制尚不清楚。我们进行了多项无偏倚的基因表达分析，以鉴定参与调控这种成瘾状态的遗传组分。这些分析揭示了在不依赖癌基因信号通路存活、因而对TKI治疗不敏感的癌细胞中，c-Fos、Dusp1和Zfp36三个基因的表达上调。通过shRNA介导的敲低使c-Fos和Dusp1表达下调，足以恢复原本对TKI耐药细胞的药物敏感性。

为了验证c-Fos和Dusp1在白血病中作为治疗靶点的作用，首先使用表达BCR-ABL1癌基因的BaF3细胞确认了它们的过表达。在BaF3-BA细胞中，生长因子信号通路消除了对癌基因的依赖性；因此，这些细胞对酪氨酸激酶抑制剂（TKI）治疗无反应。通过RT-qPCR和蛋白质印迹法进行的定量表达分析证实，c-Fos和Dusp1均受BCR-ABL1诱导，并且其表达在生长因子IL-3存在下进一步增强（图 1A

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

对于大多数癌细胞而言，酪氨酸激酶抑制剂（TKI）的治疗反应是通过阻断肿瘤所依赖的酪氨酸激酶癌蛋白信号通路介导的。然而，关于导致微小残留病（MRD）的少数癌细胞如何逃逸癌基因依赖性及治疗作用，目前了解仍较少4。近期研究表明，生长因子信号通路在白血病和实体瘤中均介导了药物耐药性，提示多种分子机制可能参与内在耐药性的形成10,11,12。为了阐明其机制并鉴定可用于治疗开发的基因靶点，我们利用小鼠（BaF3）和人源（K562）细胞进行了全面的全基因组表达谱分析。本研究未使用来自白血病小鼠或慢性髓系白血病（CML）患者的原始样本，因为我们推测，由于原始骨髓样本具有显著的异质性，可能会掩盖相关基因/靶点的真实特征。即使通过抗体介导分选获得的细胞（如干细胞前体细胞）也表现出明显的异质性。因此，使用纯化的细胞系可能更适用于靶点鉴定，以避免由遗传异质性带来的非预期复杂性。全基因组表达分析发现，c-Fos、Dusp1 和 Z...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者感谢 G. Q. Daley 提供 BaF3 和 WEHI 细胞，感谢 T. Reya 提供 MSCV-BCR-ABL-Ires-YFP 载体。作者感谢 M. Carroll 提供慢性髓系白血病急变期患者的样本。本研究获得了美国国家癌症研究所（NCI，资助号 1RO1CA155091）、白血病研究基金会、V 基金会以及美国国家心肺血液研究所（NHLBI，资助号 R21HL114074-01）对 M.A. 的资助支持。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
<强>生物材料
RPMICellgro（康宁）15-040-CV
DMEMCellgro（康宁）15-013-CV
IMDMCellgro（康宁）15-016-CVR
RetroNectin 重组人纤连蛋白片段TakaraT100B
MethoCult GF M3434（小鼠CFU用甲基纤维素）干细胞3434
经典甲基纤维素人类集落形成单位培养基（MethoCult H4434 Classic）干细胞4434
4-羟基他莫昔芬SigmaH6278
重组小鼠 SCFProspecCYT-275
重组小鼠 Flt3-配体ProspecCYT-340
重组小鼠 IL-6ProspecCYT-350
重组小鼠 IL-7Peprotech217-17
DFCLKT Laboratories Inc.D3420
BCIChemzon ScientificNZ-06-195
伊马替尼LC实验室I-5508
姜黄素Sigma458-37-7
NDGASigma500-38-9
青霉素/链霉素Cellgro（康宁）30-002-CI
FBS亚特兰大生物制品S11150
胰蛋白酶EDTA 1×Cellgro（康宁）25-052-CI
1× PBSCellgro（康宁）21-040-CV
L-谷氨酰胺Cellgro（康宁）25-005-CL5 mg/mL 储存液（溶于水）
嘌呤霉素Gibco（Life Technologies）A11138-03
HEPESSigmaH7006
Na2HPO4.7H2OSigmaS9390
硫酸鱼精蛋白SigmaP33695 mg/mL 水溶液储存液
0.4% 台盼蓝溶液SigmaT8154
DMSOCellgro（康宁）25-950-CQC
WST-1罗氏11644807001
0.45 μ大孔径圆盘滤器PALL2016-10
70 μm 尼龙细胞滤网Becton Dickinson352350
FICOL（Histopaque 1083）（多蔗糖）Simga1083
PBS康宁21040CV
LS 柱Miltenyi130-042-401
蛋白酶抑制剂混合物罗氏CO-RO
磷酸酶抑制剂混合物 2SigmaP5762
硝酸纤维素膜伯乐（Bio-Rad）1620115
SuperSignal West Dura 化学发光底物（化学发光底物）赛默飞世尔科技34075
CD5eBioscience13-0051-82
CD11beBioscience13-0112-75
CD45R（B220）BD 生物科学553092
CD45.1-FITCeBioscience11-0453-85
CD45.2-PEeBioscience12-0454-83
hCD45-FITCBD 生物科学555482
抗生物素-FITCMiltenyi130-090-857 
抗-7-4eBioscienceMA5-16539
抗Gr-1（Ly-6G/c）eBioscience13-5931-82
抗Ter-119eBioscience13-5921-75
Ly-6 A/E (Sca1) PE Cy7BD 558612
CD117 APC BD 553356
BD Pharm LyseBD 555899
BD Cytofix/Cytoperm（固定和破膜溶液）BD 554714
BD 固定/破膜缓冲液  （磷酸流式检测用的透化与洗涤液）BD 554723
磷酸化 p38细胞信号传导技术4511S
总p38细胞信号传导技术9212
小鼠 IgG 对照BD 554121
Alexa Fluor 488 标记 InvitrogenA-11034
氯化钙InvitrogenK278001
2x HBSInvitrogenK278002
EDTAAmbionAM9261
BSASigmaA7906
毛细血管采血管Fisher22-260-950
采血管Giene Bio-One450480
新生牛血清亚特兰大生物S11295
促红细胞生成素安进5513-267-10
人 SCFProspecCYT-255
人IL-3ProspecCYT-210
G-SCFProspecCYT-220
GM-CSFProspecCYT-221
MyeloCult（LTCIC 检测用培养基）干细胞技术5100
氢化可的松琥珀酸钠干细胞技术7904
MEM αGibco12561-056
1/2 cc 低剂量U-100胰岛素注射器，28 G1/2Becton Dickinson329461
研钵和研杵Coor tek 60316 和 60317
异氟烷（Isothesia TM）Butler Schien29405
SOCNew England BiolabsB90920s
氨苄青霉素SigmaA0166100 mg/mL 水溶液储存液
Bacto 琼脂（琼脂）Difco214050
优质肉汤Becton Dickinson243820
琼脂糖GenemateE-3119-500
多西环素饲料TestDiet.com52662改良型 RMH1500，可高压灭菌 5LK8  含 0.0625% 多西环素 
他莫昔芬SigmaT5648
碘硝基四唑氯化物 SigmaI10406
<强>试剂盒
Dneasy 血液 &；组织试剂盒Qiagen69506
GoTaq Green（含Green上样染料的Taq DNA聚合酶）PromegaM1722
miRNeasy Mini Kit  （RNA提取试剂盒）Qiagen217084
DNA酶去DNA试剂盒（用于RT-PCR的DNA酶处理）Ambion，Life TechnologiesAM1906
Superscript III 第一链合成（用于 cDNA 合成的逆转录酶）Invitrogen18080051
SYBR Green（用于qPCR的含绿色嵌入染料的taq聚合酶混合物）伯乐（Bio-Rad）1725270
CD117 MicroBead 试剂盒Miltenyi130-091-224
人类长期培养起始细胞检测干细胞技术
<强>仪器
NAPCO 系列 8000 WJ CO2 培养箱赛默飞世尔科技
摆桶式转子离心机 5810REppendorf
TC-10 自动细胞计数仪伯乐（Bio-RAD）
C-1000 梯度PCR仪伯乐（Bio-RAD）
Mastercycler Real Plex 2Eppendorf
ChemiDoc 成像系统（凝胶和蛋白质印迹成像系统）伯乐（Bio-RAD）17001401
Hemavet（血细胞计数仪）Drew-Scientific
LSR II（流式细胞仪）BD 
Fortessa I（流式细胞分析仪）BD 
FACSAriaII（FACS 分选仪）BD 
磁力架Miltenyi
辐照仪 J.L. Shepherd 和 Associates，美国加利福尼亚州圣费尔南多Mark I Model 68A铯-137 源
<强>小鼠
ROSACreERT2杰克逊实验室
Scl-tTA Dr. Claudia Huettner’s 实验室
BoyJ 辛辛那提儿童医院医学中心小鼠核心设施
C57Bl/6 杰克逊实验室
NSGS辛辛那提儿童医院医学中心小鼠核心设施
ROSACreERT2/c-Fosfl/fl Dusp1-/- 自制
ROSACreERT2/c-Fosfl/fl自制
<强>细胞
BaF3哈佛医学院波士顿分校 George Daley 惠赠
WEHI哈佛医学院波士顿分校 George Daley 惠赠
CML-CD34+ 和正常 CD34+ 细胞辛辛那提大学医院，辛辛那提大学

参考文献

  1. Daley, G. Q., Van Etten, R. A., Baltimore, D. Induction of chronic myelogenous leukemia in mice by the P210bcr/abl gene of the Philadelphia chromosome. Science. 247, 824-830 (1990).
  2. Druker, B. J., et al. Effects of a selective inhibitor of the Abl tyrosine kinase on the growth of Bcr-Abl positive cells. Nature Medicine. 2, 561-566 (1996).
  3. Mahon, F. X., et al. Discontinuation of imatinib in patients with chronic myeloid leukaemia who have maintained complete molecular remission for at least 2 years: the prospective, multicentre Stop Imatinib (STIM) trial. Lancet Oncology. 11, 1029-1035 (2010).
  4. O'Hare, T., Zabriskie, M. S., Eiring, A. M., Deininger, M. W. Pushing the limits of targeted therapy in chronic myeloid leukaemia. Nature Reviews Cancer. 12, 513-526 (2012).
  5. Rousselot, P., et al. Imatinib mesylate discontinuation in patients with chronic myelogenous leukemia in complete molecular remission for more than 2 years. Blood. 109, 58-60 (2007).
  6. Krause, D. S., Van Etten, R. A. Tyrosine kinases as targets for cancer therapy. The New England Journal of Medicine. 353, 172-187 (2005).
  7. Sharma, S. V., Settleman, J. Exploiting the balance between life and death: targeted cancer therapy and "oncogenic shock". Biochemical Pharmacology. 80, 666-673 (2010).
  8. Sharma, S. V., Settleman, J. Oncogene addiction: setting the stage for molecularly targeted cancer therapy. Genes & Development. 21, 3214-3231 (2007).
  9. Weinstein, I. B. Cancer. Addiction to oncogenes--the Achilles heal of cancer. Science. 297, 63-64 (2002).
  10. Corbin, A. S., et al. Human chronic myeloid leukemia stem cells are insensitive to imatinib despite inhibition of BCR-ABL activity. The Journal of Clinical Investigation. 121, 396-409 (2011).
  11. Straussman, R., et al. Tumour micro-environment elicits innate resistance to RAF inhibitors through HGF secretion. Nature. 487, 500-504 (2012).
  12. Wilson, T. R., et al. Widespread potential for growth-factor-driven resistance to anticancer kinase inhibitors. Nature. 487, 505-509 (2012).
  13. Kesarwani, M., et al. Targeting c-FOS and DUSP1 abrogates intrinsic resistance to tyrosine-kinase inhibitor therapy in BCR-ABL-induced leukemia. Nature Medicine. 23, 472-482 (2017).
  14. Zhang, J., et al. c-fos regulates neuronal excitability and survival. Nature Genetics. 30, 416-420 (2002).
  15. Dorfman, K. Disruption of the erp/mkp-1 gene does not affect mouse development: normal MAP kinase activity in ERP/MKP-1-deficient fibroblasts. Oncogene. 13, 925-931 (1996).
  16. Padhye, S., et al. Fluorocurcumins as cyclooxygenase-2 inhibitor: molecular docking, pharmacokinetics and tissue distribution in mice. Pharmaceutical Research. 26, 2438-2445 (2009).
  17. Molina, G., et al. Zebrafish chemical screening reveals an inhibitor of Dusp6 that expands cardiac cell lineages. Nature Chemical Biology. 5, 680-687 (2009).
  18. Zhang, B., et al. Effective targeting of quiescent chronic myelogenous leukemia stem cells by histone deacetylase inhibitors in combination with imatinib mesylate. Cancer Cell. 17, 427-442 (2010).
  19. Koschmieder, S., et al. Inducible chronic phase of myeloid leukemia with expansion of hematopoietic stem cells in a transgenic model of BCR-ABL leukemogenesis. Blood. 105, 324-334 (2005).
  20. Abraham, S. A., et al. Dual targeting of p53 and c-MYC selectively eliminates leukaemic stem cells. Nature. 534, 341-346 (2016).
  21. Li, L., et al. Activation of p53 by SIRT1 inhibition enhances elimination of CML leukemia stem cells in combination with imatinib. Cancer Cell. 21, 266-281 (2012).
  22. Qiagen-miRNAeasy kit. , Available from: https://www.qiagen.com/us/shop/sample-technologies/rna/mirna/mirneasy-mini-kit/#resources (2018).
  23. DNA-free DNA removal kit. , Available from: https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/AM1906?gclid=EAIaIQobChMIg4D-_ZvC2wIVx5-zCh00Cg8fEAAYASAAEgIv6vD_BwE&s_kwcid=AL!3652!3!264318446624!b!!g!!&ef_id=V7SO5AAAAck3ba89:20180607185004:s (2018).
  24. SuperScript™ III First-Strand Synthesis System. , Available from: https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/18080051 (2018).
  25. Human Long Term Culture Initiating Cell Itc-ic Assay. , Available from: https://www.stemcell.com/human-long-term-culture-initiating-cell-ltc-ic-assay.html (2018).
  26. Abarrategi, A., et al. Modeling the human bone marrow niche in mice: From host bone marrow engraftment to bioengineering approaches. Journal of Experimental Medicine. 215, 729-743 (2018).
  27. Kesarwani, M., Huber, E., Kincaid, Z., Azam, M. A method for screening and validation of resistant mutations against kinase inhibitors. Journal of Visualized Experiments. , (2014).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

标签

c Fos Dusp1 PCR
评估 c-Fos 和 Dusp1 在癌基因依赖性中作用的方法
联系我们
向图书馆推荐

隐私

使用条款

政策

版权所有 © 2026 MyJoVE Corporation。保留所有权利。