制备用于血管生成的68Ga标记的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）肽

摘要

α_vβ₃ 整合素是一种黏附蛋白，其在发生血管生成的活化内皮细胞上高表达。因此，评估该整合素的完整性在肿瘤学研究中具有重要意义。本文介绍一种制备⁶⁸Ga标记放射性多肽的方法，以及评估其生物学效应的方法。

摘要

α_vβ₃ 整合素是一种异源二聚体黏附分子，参与肿瘤细胞迁移和血管生成。在新生血管形成的肿瘤内皮细胞中，整合素呈过表达，但通常浓度较低。这种特异性表达的α_vβ₃ 使其成为抗血管生成药物和成像药物的有效生物标志物。作为一种功能成像技术，正电子发射断层扫描（PET）可提供有关生化和生理变化的信息 体内，因其在纳摩尔尺度上具有独特的高灵敏度。因此，基于放射性金属的PET放射性药物在肿瘤血管生成的无创定量评估中受到广泛关注。本文提供了一套系统性方案，用于制备一种新型放射性金属标记肽以评估血管生成。该方案包含放射化学纯度、脂溶性、细胞摄取、血清稳定性及药代动力学性质等方面的信息。 ⁶⁸Ga-RGD-多肽是靶向α的一种代表性PET配体_vβ₃ 整合素。在此，我们介绍一种制备 ⁶⁸Ga-RGD-多肽及其生物学功效评价

引言

血管生成是一种以新生血管形成为特征的生物学过程。在众多促血管生成因子中，α_vβ₃整合素与侵袭性相关，因为该整合素在血管生成性肿瘤血管中高表达，而在正常组织中则无表达¹_。

具有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）结构域的放射性标记受体结合肽对α_vβ₃整合素受体具有高亲和力，被视为有前景的血管生成显像剂^2,3,4,5,6,7。目前已开发出多种用于正电子发射断层扫描（PET）的放射性药物，并在多种动物模型中验证了其生物学特性^8,9,10,11。在放射性核素方面，⁶⁸

方案

所有动物实验均按照韩国放射医学科学研究所动物研究委员会批准的《研究用动物护理与使用指南》中的规程进行。所有试剂和溶剂均直接购入后使用，未经进一步纯化。NOTA-RGD-多肽的制备参照文献方法¹⁵。

警告：⁶⁸Ga 会发射正电子和伽马射线。所有涉及直接或间接接触放射性物质的实验，必须仅由经过培训并获得许可的人员进行。操作放射性物质时，应使用适当的防护设备、屏蔽装置、辐射剂量计胸章和指环、以及辐射巡检仪。

1. 使用⁶⁸GaCl₃对RGD肽进行放射性标记

注意：⁶⁸Ga（半衰期 t_1/2 = 68 分钟，β⁺ 衰变比例为 89%，电子俘获 EC 为 11%）由 ⁶⁸Ga/⁶⁸Ge 发生器获得。

1. 洗脱 ⁶⁸GaCl₃ 从发生器中用4 mL 0.05 M盐酸洗脱。
2. 在80 °C下用氮气吹扫30分钟以干燥 ⁶⁸GaCl₃ (333 kBq，1 mL) 置于 5 mL 反应小瓶中。
3. 将 RGD-肽溶液（100....

结果

⁶⁸GaCl₃ 与 NOTA-RGD 肽的螯合反应操作简便，放射性标记产率达 99%。反应中的杂质已成功去除，结果如图2所示。⁶⁸Ga-RGD 肽的放射化学纯度大于 99%，合成结束时的比活度为 90 - 130 MBq/nmol（图3）。

⁶⁸Ga-RGD-多肽的细胞摄取率在30、60、90和120分钟时分别为1.49%、0.85%、0.36%和0.39%。血清稳定性实验显示，⁶⁸Ga-RGD-多肽在与人或小鼠血清以及PBS孵育2小时后几乎保持完整（2小时时稳定性>92%）。其分配系数（log P）为2.96，表明具有较高的脂溶性。PET显像显示主要器官（包括肝脏、肾脏、心脏、肌肉和肿瘤）在早期有较高的摄取。然而，在后.......

讨论

在本研究中，我们介绍了一种靶向α_vβ₃整合素的放射性多肽的制备方法及其生物学评价。传统的药物开发涉及复杂的流程，需要大量参考物质以及相对较长的评价时间。尽管所提出的方法学无法替代精细的评估过程，但该系统可用于筛选目的，从而显著缩短时间和降低成本。

在过去十年中，许多放射性标记的RGD肽已被广泛研究作为肿瘤成像的放射性示踪剂¹⁶为了获得可用于临床试验的有前景放射性药物，应提供系统性的药物开发方法。放射化学可行性、对靶点的高选择性和亲和力、代谢稳定性以及合适的药代动力学是四个主要关注点。对于常规的正电子发射断层扫描（PET）研究，合理的放射化学产率可确保放射性药物的可靠性。高亲和力的问题（> nM）和选择性（> 100倍）也得到满足。在药代动力学方面，候选PET示踪剂能迅速从非靶组织中清除，并在肿瘤中长时间滞留，从而实现较高的靶组织与参考组织比值。候选放射性药物不应产生具有干扰性的代谢产物。 体内 这可能会增加非特异性结合并导致对比度较低的成像。必须评估其综合特.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
68Ga/68Ge 发生器	ITG 公司	-	10 mCi
盐酸溶液	Sigma-aldrich	84429
乙酸钠	Sigma-aldrich	S2889
C18 反相小柱	Waters	WAT020515
0.22-μm 无菌滤器	Milllipore	SLGV033RS
放射性薄层色谱扫描仪	Bioscan	AR2000
ITLC 色谱纸	Agilent	SGI001
柠檬酸	Sigma-aldrich	251275
HPLC	Waters	-	Waters 1525 系统，包含二元泵、光电二极管阵列检测器（Waters 2998）、放射性检测器（Raytest, Gabi）
乙腈	J.T. Baker	14-650-359
三氟乙酸	Sigma-aldrich	302031
杜尔贝科改良伊格尔培养基	Thermo Fisher Scientific	11965092
胎牛血清	Thermo Fisher Scientific	16000044
T175 培养瓶	Corning	CLS431080
胰蛋白酶-EDTA（0.25%）	Thermo Fisher Scientific	25200072
青霉素-链霉素	Thermo Fisher Scientific	15240112
γ-计数器	Perkin Elmer	-	1480 Wizard 3
胰岛素注射器	Becton Dickinson	326105
注射泵	哈佛仪器	70-4500
micro-PET/CT	西门子 Inveon	-