利用P19胚胎癌细胞进行神经发生

摘要

P19 小鼠胚胎癌细胞系（P19 细胞系）被广泛用于研究神经发生分子机制，相较于体内分析具有显著的简化优势。本文介绍了一种利用视黄酸诱导 P19 细胞系发生神经分化的实验方案。

摘要

源自小鼠胚胎畸胎瘤的P19细胞系具有分化为三个胚层的能力。在存在视黄酸（RA）的条件下，悬浮培养的P19细胞系可被诱导分化为神经元。这一现象被广泛用作体外神经发生的研究模型。因此，P19细胞系对于与神经发生相关的分子和细胞研究非常有用。然而，文献中描述的P19细胞系神经元分化的实验方案非常复杂。本研究建立的方法简便，将有助于阐明神经发育异常和神经退行性疾病的分子机制。

引言

在胚胎发育过程中，单层细胞会转化为三个独立的胚层^1,2,3。为了拓展对体内发生现象的研究可能性，已开发出三维细胞聚集体（胚胎体）作为便捷的研究模型。通过该方法形成的细胞聚集体可暴露于各种诱导细胞分化的条件下，从而模拟胚胎发育过程^4,5。P19 小鼠胚胎癌细胞系（P19 细胞系）常被用作体外神经发生研究的细胞模型 ^6,7,8。P19 细胞系具有典型的多能干细胞特征，在细胞聚集过程中加入视黄酸（RA）可诱导其分化为神经元，随后在贴壁条件下出现 neurite outgrowth。此外，在二甲基亚砜（DMSO）的作用下，未分化的 P19 细胞系也能形成类似肌细胞和心肌细胞的细胞类型^9,10,11,12。

已有多种方法^13,14,15,16被报道用于神经元分化，但这些方法有时较为复杂，仅通过阅读描述难以掌握。例如，某些方案要求使用添加了小牛血清（CS）和胎牛血清（FBS）混合物的杜氏改良伊格尔培养基（Dulbecco's Modified Eagle Medium, DMEM）¹³。此外，用于神经元发育的培养基通常由Neurobasal培养基与B27添加剂组成^13,14,15,16。因此，现有方法在制备上存在复杂性，而本研究的目标是简化这些实验流程。在本研究中，我们证明了含FBS的DMEM培养基不仅可用于维持P19细胞系（DMEM + 10% FBS），也可用于神经元发育（DMEM + 5% FBS + RA）。这种利用P19细胞系的简化神经发生方法使我们能够研究神经元发育的分子机制。此外，阿尔茨海默病等神经退行性疾病的研究所也常使用P19细胞系^17,18，我们相信本研究所建立的方法将有助于阐明神经发育异常及神经退行性疾病中的分子机制。

方案

1. 培养物维持

1. 将P19细胞系培养于维持培养基中（含4,500 mg/L葡萄糖的杜尔贝科改良伊格尔培养基，添加10%胎牛血清、100单位/mL青霉素和100单位/mL链霉素）。于37 °C、5% CO₂条件下孵育。

2. 细胞传代培养

1. 当细胞生长至约 80% 汇合度时，从细胞培养瓶（表面积 25 cm²）中移除用过的培养基。
2. 用 2 mL 不含钙和镁的磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞。
3. 向细胞单层加入 1 mL 0.25% 胰蛋白酶-EDTA（乙二胺四乙酸）溶液。
4. 将培养瓶置于 CO₂ 培养箱（37 °C，5% CO₂）中孵育 2–3 分钟。
5. 观察细胞与培养瓶表面的贴附情况，确保所有细胞均已脱离并悬浮于培养基中。
6. 加入 9 mL 维持培养基以终止 胰蛋白酶的酶活性。
7. 用维持培养基重悬细胞。
8. 将细胞转移至 15 mL 离心管中，在室温（RT）下以 200 × g 离心 5 分钟。
9. 弃去上清液，并向 15 mL 离心管中加入 10 mL 新鲜维持培养基。
10. 使用细胞计数仪按照制造商说明，利用细胞悬液测定细胞数量。
11. 以每平方厘米 2 × 10⁴ 个细胞的密度，将细胞接种至新的 25 cm² 培养瓶中。
12. 加入维持培养基至总体积 10 mL。
13. 将接种细胞的培养瓶置于 CO₂ 培养箱（37 °C，5% CO₂）中培养 2–3 天。

3. 胰蛋白酶消化

1. 从细胞培养瓶中吸除维持培养基。用 2 mL 无钙、无镁的 PBS 洗涤细胞一次。
2. 加入 1 mL 0.25% 胰蛋白酶-EDTA 溶液。
3. 将细胞培养瓶放入 37 °C 的 CO₂ 培养箱中孵育 2–3 分钟。
4. 使用 1 mL 移液器反复吹打细胞 10 次，使细胞解离。
5. 向细胞中加入 9 mL 不含视黄酸（RA）的分化培养基（含 4500 mg/L 葡萄糖的 Dulbecco 改良 Eagle 培养基，添加 5% 胎牛血清、100 单位/mL 青霉素和 100 单位/mL 链霉素），以中和胰蛋白酶活性。
6. 将细胞转移至 15 mL 离心管中，在室温下以 200 × g 离心 5 分钟。
7. 弃去上清液，加入 1 mL 不含视黄酸（RA）的分化培养基，重悬细胞沉淀。
8. 使用细胞计数仪，按照制造商说明书对细胞悬液进行细胞计数。

4. 聚集体生成

1. 向10 mL分化培养基中加入5 µL RA（1 mM 储存液，溶于99.8%乙醇，-20 °C保存），充分混匀（RA终浓度为0.5 µM）。
   注意： RA对光敏感。 低浓度乙醇不影响细胞分化^19,20,21。
2. 将含RA的10 mL分化培养基加入100 mm未经处理的培养皿中（专用于悬浮培养）。
3. 将1 × 10⁶个细胞接种至100 mm培养皿中（培养皿表面积为56.5 cm²）。
4. 将含细胞的培养皿置于37 °C、5% CO₂的培养箱中培养2天，以促进细胞聚集体形成。
5. 2天后，更换分化培养基。用10 mL移液器吸取含有细胞聚集体的培养基，转移至室温下的15 mL离心管中。
6. 在室温下静置1.5分钟，使细胞聚集体依靠重力自然沉降。
7. 弃去上清液。
8. 用10 mL血清移液器加入10 mL新鲜的含0.5 µM RA的分化培养基。
   注意： 不要反复吹打细胞聚集体。
9. 将细胞聚集体接种至新的100 mm未经处理的培养皿中（专用于悬浮培养）。
10. 将培养皿置于培养箱中（37 °C，5% CO₂）继续培养2天。

5. 聚集体解离

1. 使用 10 mL 移液器吸取细胞聚集体。
2. 将聚集体转移至 15 mL 离心管中，静置 1.5 分钟，使细胞聚集体依靠重力自然沉降。
3. 吸除上清液。
4. 用不含血清和抗生素的 DMEM 洗涤聚集体。
5. 在室温下静置 1.5 分钟，使细胞聚集体通过重力沉降法沉淀。
6. 吸除上清液，加入 2 mL 0.25% 的胰蛋白酶-EDTA 溶液。
7. 将细胞聚集体放入 37 °C 水浴中孵育 10 分钟，每隔 2 分钟用手轻轻敲击管壁以轻柔振荡聚集体。
8. 加入 4 mL 维持培养基以终止胰蛋白酶消化过程。
9. 使用 1 mL 移液器将聚集体上下吹打 20 次。
10. 在室温下以 200 × g 离心 5 分钟。
11. 吸除上清液，将细胞沉淀重悬于 5 mL 维持培养基中。
12. 使用细胞计数仪测定细胞数量。

6. 细胞接种

1. 向6孔板的每个孔中加入3 mL维持培养基。
2. 以每孔0.5 × 10⁶的密度将细胞接种至6孔培养板中。
3. 在37 °C、5% CO₂浓度条件下培养。
4. 将细胞接种于6孔培养板中的盖玻片上，当细胞融合度达到20%时，使用抗MAP2抗体进行免疫染色。另取6孔板培养细胞至20%融合度，提取RNA并进行Map2、NeuN、Oct4、Nanog和Gapdh的RT-PCR分析。

结果

P19细胞系神经发生诱导实验方案的简化流程图如下所示 图1为了确定P19细胞系在未分化状态及神经发生过程中的特性，采用了RT-PCR（逆转录-聚合酶链式反应）方法。未分化的P19细胞系表达多能性基因，例如有机阳离子/肉碱转运蛋白4 （Oct4） 和 Nanog 同源盒 (Nanog) 在RA存在下，悬浮培养中细胞聚集诱导的神经发生导致了迅速下降 Oct4 和 Nanog 表达。相反，神经元标志物的表达：微管相关蛋白2（Map2, NeuN （也称为 RNA结合蛋白，fox-1同源物3 (Rbfox3) 在触发神经发生后增加（图2)^6,14,...

讨论

本文介绍了一种利用P19细胞系进行神经发生的简单实验方案。尽管已有大量相关报道，但使用P19细胞系诱导神经发生的详细方法仍不明确。此外，我们在整个实验过程中采用了成分简单的高糖（4,500 mg/L）DMEM培养基，其中添加10%胎牛血清（FBS）。该体系使神经发生实验的操作更加简便友好，并有助于拓展该方法在未来的应用范围。

本方案中最关键的环节是视黄酸（RA）浓度以及在悬浮培养过程中细胞聚集体的形成。虽然P19细胞系的神经发生刺激可以在不形成聚集体的情况下进行，但若不形成聚集体，培养中产生的神经元细胞数量将减少三分之二²²。Monzo等人已证明，通过单层培养可诱导P19细胞系发生神经分化¹⁵。尽管该方法较为简便，可省去悬浮培养步骤，但仍需进一步研究以将其与其他已有详细描述的方法进行比较。与使用1 µM RA相比，培养基中使用0.5 µM RA浓度可产生更多的细胞聚集体以及更多的神经元。此外值得注意的是，在RA处理期间，若大多数聚集体已贴附于悬浮培养皿底部，则无法观察到有效的神经发生。在...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
6x DNA上样缓冲液	EURx	E0260-01
琼脂糖	Sigma- Aldrich	A9539
cDNA合成试剂盒	EURx	E0801-02
DAPI（4′,6-二脒基-2′-苯基吲哚二盐酸盐）	Sigma- Aldrich	10236276001	工作浓度：1 μg/mL
含L-谷氨酰胺的高糖DMEM（4.5 g/L）	Lonza	BE12-604Q
99.8%乙醇	Chempur	CHEM*613964202
胎牛血清（FBS）	EURx	E5050-03
MAP2抗体	Thermo Fisher Scientific	PA517646	稀释比例1:100
PCR反应试剂盒	EURx	E0411-03
青霉素/链霉素（10K/10K）	Lonza	DE17-602E
磷酸盐缓冲液（PBS），1x浓度，不含Ca2+、Mg2+	Lonza	BE17- 517Q
视黄酸	Sigma- Aldrich	R2625-50MG	溶于99.8%乙醇；-20 °C保存，最长6个月
二抗（Alexa Fluor 488）	Thermo Fisher Scientific	A11034	稀释比例1:500
脱脂奶粉	Sigma- Aldrich	1153630500
TBE缓冲液	Thermo Fisher Scientific	B52
Triton-X 100	Sigma- Aldrich	T8787-100ML
含酚红的0.25%胰蛋白酶-EDTA（HBSS配制，不含Ca 2+、Mg2+）	biosera	LM-T1720/500
细胞培养耗材
1 mL移液管	Profilab	515.01
10 mL移液管	Profilab	515.10
专用于悬浮培养的100 mm培养皿	Corning	C351029
15 mL离心管	Sigma- Aldrich	CLS430791-500EA
5 mL移液管	Profilab	515.05
6孔板	Corning	CLS3516
细胞培养瓶，表面积25 cm2	Sigma- Aldrich	CLS430639-200EA