P19 小鼠胚胎癌细胞系（P19 细胞系）被广泛用于研究神经发生分子机制，相较于体内分析具有显著的简化优势。本文介绍了一种利用视黄酸诱导 P19 细胞系发生神经分化的实验方案。
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本文内容
摘要
摘要
源自小鼠胚胎畸胎瘤的P19细胞系具有分化为三个胚层的能力。在存在视黄酸（RA）的条件下，悬浮培养的P19细胞系可被诱导分化为神经元。这一现象被广泛用作体外神经发生的研究模型。因此，P19细胞系对于与神经发生相关的分子和细胞研究非常有用。然而，文献中描述的P19细胞系神经元分化的实验方案非常复杂。本研究建立的方法简便，将有助于阐明神经发育异常和神经退行性疾病的分子机制。
引言
在胚胎发育过程中，单层细胞会转化为三个独立的胚层1,2,3。为了拓展对体内发生现象的研究可能性，已开发出三维细胞聚集体（胚胎体）作为便捷的研究模型。通过该方法形成的细胞聚集体可暴露于各种诱导细胞分化的条件下，从而模拟胚胎发育过程4,5。P19 小鼠胚胎癌细胞系（P19 细胞系）常被用作体外神经发生研究的细胞模型 6,7,8。P19 细胞系具有典型的多能干细胞特征，在细胞聚集过程中加入视黄酸（RA）可诱导其分化为神经元，随后在贴壁条件下出现 neurite outgrowth。此外，在二甲基亚砜（DMSO）的作用下，未分化的 P19 细胞系也能形成类似肌细胞和心肌细胞的细胞类型9,10,11,
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方案
1. 培养物维持
- 将P19细胞系培养于维持培养基中（含4,500 mg/L葡萄糖的杜尔贝科改良伊格尔培养基，添加10%胎牛血清、100单位/mL青霉素和100单位/mL链霉素）。于37 °C、5% CO2条件下孵育。
2. 细胞传代培养
- 当细胞生长至约 80% 汇合度时，从细胞培养瓶（表面积 25 cm2）中移除用过的培养基。
- 用 2 mL 不含钙和镁的磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞。
- 向细胞单层加入 1 mL 0.25% 胰蛋白酶-EDTA（乙二胺四乙酸）溶液。
- 将培养瓶置于 CO2 培养箱（37 °C，5% CO2）中孵育 2–3 分钟。
- 观察细胞与培养瓶表面的贴附情况，确保所有细胞均已脱离并悬浮于培养基中。
- 加入 9 mL 维持培养基以终止 胰蛋白酶的酶活性。
- 用维持培养基重悬细胞。
- 将细胞转移至 15 mL 离心管中，在室温（RT）下以 200 × g 离心 5 分钟。
- 弃去上清液，并向 15 mL 离心管中加入 10 mL 新鲜维持培养基。
- 使用细胞计数仪按照制造商说明，利用细胞悬液测定细胞数量。
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结果
P19细胞系神经发生诱导方案的简化流程图如下所示 图1为了确定P19细胞系在未分化状态及神经发生过程中的特性，采用了RT-PCR（逆转录-聚合酶链式反应）方法。未分化的P19细胞系表达多能性基因，例如有机阳离子/肉碱转运蛋白4 (Oct4) 和 Nanog 同源框 (Nanog) 悬浮培养中在RA存在下由细胞聚集诱导的神经发生导致了 Oct4 和 Nanog 表达。相反，神经元标志物的表达：微管相关蛋白2（Map2, NeuN （也称为 RNA结合蛋白，fox-1同源物3 (Rbfox3) 在触发神经发生后增加（图2)6,14,15
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讨论
本文介绍了一种利用P19细胞系进行神经发生的简单实验方案。尽管已有大量相关报道，但使用P19细胞系诱导神经发生的详细方法仍不明确。此外，我们在整个实验过程中采用了成分简单的高糖（4,500 mg/L）DMEM培养基，其中添加10%胎牛血清（FBS）。该体系使神经发生实验的操作更加简便友好，并有助于拓展该方法在未来的应用范围。
本方案中最关键的环节是视黄酸（RA）浓度以及在悬浮培养过程中细胞聚集体的形成。虽然P19细胞系的神经发生刺激可以在不形成聚集体的情况下进行，但若不形成聚集体，培养中产生的神经元细胞数量将减少三分之二22。Monzo等人已证明，通过单层培养可诱导P19细胞系发生神经分化15。尽管该方法较为简便，可省去悬浮培养步骤，但仍需进一步研究以将其与其他已有详细描述的方法进行比较。与使用1 µM RA相比，培养基中使用0.5 µM RA浓度可产生更多的细胞聚集体以及更多的神经元。此外值得注意的是，在RA处理期间，若大多数聚集体已贴附于悬浮培养皿底部，则无法观察到有效的神经发生。在.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究由波兰国家科学中心（项目编号：UMO-2017/25/N/NZ3/01886）和 KNOW（领先国家研究中心）科学联合体"健康动物 - 安全食品"资助，以及波兰科学与高等教育部第 05-1/KNOW2/2015 号决议支持
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 6x DNA上样缓冲液 | EURx | E0260-01 | |
| 琼脂糖 | Sigma- Aldrich | A9539 | |
| cDNA合成试剂盒 | EURx | E0801-02 | |
| DAPI（4′,6-二脒基-2′-苯基吲哚二盐酸盐） | Sigma- Aldrich | 10236276001 | 工作浓度：1 μg/mL |
| 含L-谷氨酰胺的高糖DMEM（4.5 g/L） | Lonza | BE12-604Q | |
| 99.8%乙醇 | Chempur | CHEM*613964202 | |
| 胎牛血清（FBS） | EURx | E5050-03 | |
| MAP2抗体 | Thermo Fisher Scientific | PA517646 | 稀释比例1:100 |
| PCR反应试剂盒 | EURx | E0411-03 | |
| 青霉素/链霉素（10K/10K） | Lonza | DE17-602E | |
| 磷酸盐缓冲液（PBS），1x浓度，不含Ca2+、Mg2+ | Lonza | BE17- 517Q | |
| 视黄酸 | Sigma- Aldrich | R2625-50MG | 溶于99.8%乙醇；-20 °C保存，最长6个月 |
| 二抗（Alexa Fluor 488） | Thermo Fisher Scientific | A11034 | 稀释比例1:500 |
| 脱脂奶粉 | Sigma- Aldrich | 1153630500 | |
| TBE缓冲液 | Thermo Fisher Scientific | B52 | |
| Triton-X 100 | Sigma- Aldrich | T8787-100ML | |
| 含酚红的0.25%胰蛋白酶-EDTA（HBSS配制，不含Ca 2+、Mg2+） | biosera | LM-T1720/500 | |
| 细胞培养耗材 | |||
| 1 mL移液管 | Profilab | 515.01 | |
| 10 mL移液管 | Profilab | 515.10 | |
| 专用于悬浮培养的100 mm培养皿 | Corning | C351029 | |
| 15 mL离心管 | Sigma- Aldrich | CLS430791-500EA | |
| 5 mL移液管 | Profilab | 515.05 | |
| 6孔板 | Corning | CLS3516 | |
| 细胞培养瓶，表面积25 cm2 | Sigma- Aldrich | CLS430639-200EA |
参考文献
- Ramkumar, N., Anderson, K. V. SnapShot: mouse primitive streak. Cell. 146 (3), 488(2011).
- Solnica-Krezel, L., Sepich, D. S. Gastrulation: making and shaping germ layers. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 28, 687-717 (2012).
- Tam, P. P. L., Gad, J. M. Chapte....
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