通过在大鼠和小鼠中应用角膜缘环扎缝线诱导慢性眼压升高，导致视网膜神经节细胞出现与青光眼一致的功能性和结构性损伤。
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摘要
摘要
环角膜缝合术是一种通过持续升高眼内压（IOP）来在啮齿类动物中诱导实验性青光眼的技术，而眼内压升高是青光眼的已知危险因素。本方案以Long Evans大鼠和C57BL/6小鼠为例，逐步演示该技术的操作流程。在全身麻醉下，于眼球结膜上、赤道周围且角膜缘后方位置缝制“荷包缝合”式缝线。对侧眼作为未经处理的对照。在本研究期间（大鼠为8周，小鼠为12周），通过无表面麻醉的清醒动物反弹式眼压测量法定期检测，眼内压持续升高。在两种动物中，缝合眼的视网膜电图特征均提示以内层视网膜功能障碍为主。光学相干断层扫描显示视网膜神经纤维层出现选择性变薄。大鼠视网膜横切面的组织学检查发现节细胞层细胞密度降低，但其他细胞层无明显变化。使用视网膜节细胞特异性标记物（RBPMS）对小鼠视网膜平铺标本进行染色，证实了节细胞的丢失。环角膜缝合术是一种简单、微创且经济有效的方法，可用于在大鼠和小鼠中诱导高眼压，进而导致视网膜节细胞损伤。
引言
动物模型为研究青光眼发病机制相关的细胞过程以及评估潜在治疗干预措施提供了重要的实验平台。目前已开发出多种可诱导模型，用于产生持续的眼内压（IOP）升高，而眼内压升高是青光眼最重要的危险因素。用于升高眼内压的方法包括：巩膜上静脉注射高渗盐水1、小梁网激光光凝2或睫状带静脉激光光凝3，以及前房注射某些物质，如“鬼影”红细胞4、微珠5,6和粘弹性物质7。每种方法均有其优势与局限性。
一个理想的青光眼模型应能模拟疾病进程，同时将创伤、炎症和介质混浊等并发症降至最低。这些并发症常与用于诱导眼内压升高的操作相关，并可能干扰对实验结果的解读。例如，前房穿刺即使未引入外来物质，也已被证实可导致创伤和炎症，而这并不能代表典型的青光眼病变改变。8,9除了避免炎症的重要性之外，保持光学透明度有助于 体内 成像和电生理学技术来监测疾病进展。尽管目前尚不清楚这些并发症在多大程度上可能影响疾病研究，但在模型诱导过程中避免穿透眼球可能更为适宜。经角巩膜缘缝合法可避免眼球穿通，同时有助于 体内 对视网膜结构和功能进行纵向评估。更重要的是，该模型与以往模型的不同之处在于，可根据需要通过移除缝线使眼压（IOP）恢复至基线水平。IOP的正常化有助于研究可逆性与不可逆性视网膜神经节细胞损伤相关的细胞与分子机制。10,11,12,13,14.
本文重点介绍模型诱导技术。视网膜损伤的表征 该模型在大鼠和小鼠中诱导的效应可参见其他更详细的文献报道15,16,17,18,19.
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方案
所有实验操作均按照澳大利亚国家卫生与医学研究委员会制定的《科学用途动物护理与使用实践规范》进行。伦理批准由霍华德·弗洛里研究所动物伦理委员会提供（大鼠和小鼠的批准编号分别为13-044-UM和13-068-UM）。
1. 清醒大鼠眼内压的测量
- 将实验室回弹式眼压计设置为大鼠模式。用一块软布包裹清醒的大鼠以安抚动物，暴露其头部和颈部。用一只手轻轻握住大鼠躯干，使动物背部紧贴操作者胸部。
注意：无需局部麻醉。 - 用另一只手将回弹式眼压计靠近大鼠的眼睛，使眼压探头的尖端距离角膜顶点约2 - 3 mm，并与之垂直。用右手测量动物右眼的眼压，用左手测量左眼的眼压。
- 等待数秒，待大鼠安静后，按一次测量按钮。观察眼压探头尖端轻触角膜顶点一次，并听到回弹式眼压计发出一次蜂鸣声。
注意：眼压计发出的一声蜂鸣表示测量成功，数值可从液晶屏读取。两声蜂鸣表示测量错误。测量错误可能由以下因素引起：探头与角膜之间的距离不当、眼压计方向过度倾斜，或探头触碰到眼睑或角膜非中心区域。有关测量错误的更多详情，请参阅制造商提供的回弹式眼压计使用手册。 - 重复步骤1.3十次，每次间隔1-2秒，根据这些测量值计算该时间点的平均眼压（IOP）值。在第5次测量后重置眼压计th 读数
- 为进行连续监测，应在每天的相同时间及一致的光照条件下测量眼内压（IOP），以尽量减少因眼内压昼夜节律周期引起的变异20,21.
2. 清醒小鼠眼内压测量
- 根据制造商的说明，将回弹式眼压计设置为小鼠模式。
- 用手固定小鼠时，将小鼠置于笼盖的网格上，轻轻向后拉尾部。
注意：这会促使动物用前肢抓住金属格栅并试图向前拉动身体，从而使其身体轻微伸展。- 用另一只手抓住耳后松弛的皮肤。用无名指和中指（或小指与手掌之间）夹住动物的尾巴，以固定其下半身。
注意：尽量不要将皮肤抓得太紧，以免造成窒息或对眼睛施加压力。
- 用另一只手抓住耳后松弛的皮肤。用无名指和中指（或小指与手掌之间）夹住动物的尾巴，以固定其下半身。
- 用原本持尾的空闲手将回弹式眼压计靠近小鼠眼睛，使眼压探头尖端距离角膜顶点约2 - 3 mm，并与之垂直。测量另一只眼睛时，旋转小鼠，使另一只眼睛位于眼压计前方。
- 等待小鼠安静后，轻按一次测量按钮。观察眼压探头尖端轻触角膜顶点，听到一声蜂鸣提示测量成功。
注意：两次蜂鸣声表示测量错误。可由第二位实验人员读取并记录眼内压（IOP）读数，同时由第一位实验人员进行测量，以提高准确性。 - 重复步骤 2.4，获取十次成功读数以得出眼内压（IOP）。在第 5 次读数后重置眼压计th 读数。每次读数之间间隔1 - 2秒。
- 根据大鼠的系列测量方法，应在每天相同时间及一致的光照条件下测量小鼠眼内压。
3. 在麻醉大鼠和小鼠中诱导眼内压升高
- 用含70%乙醇的0.5%氯己定清洁手术台，并用无菌布巾覆盖。所有手术器械均需预先高压灭菌。确保所有实验人员佩戴适当的个人防护装备（外科口罩、手术服和灭菌手套）。
- 为诱导全身麻醉，将动物放入诱导室中。以氧气为载体输送3 - 3.5%异氟烷2 流速为 3 L/min。
- 以 2 L/min 的流速输送 1.5% 异氟烷维持麻醉 通过 在整个手术过程中使用啮齿类动物面罩。通过捏足无反射来确认麻醉深度是否足够。
- 必要时通过调节流速，将呼吸频率维持在约60次/分钟，以避免呼吸抑制。
- 随机选择一只眼睛诱导眼内高压，对侧眼作为未经处理的对照。滴加一滴0.5%丙氧麻黄碱滴眼液以进行局部麻醉。为清洁眼表，用3 mL无菌生理盐水冲洗眼睛。
- 用无菌有孔手术巾覆盖动物，暴露需缝合的眼部。
- 在球结膜上围绕眼球行荷包缝合。在大鼠中，将7/0尼龙缝线平行于角巩膜缘并位于其后方2 mm处穿行。图1在小鼠中，将10/0尼龙缝线置于角巩膜缘后方1 mm处。
- 注意避免穿透巩膜。术中若出现瞳孔突然散大，提示可能已穿透巩膜。
- 在大鼠中使用5-6个锚定点，在小鼠中使用4-5个锚定点，将缝线固定于结膜。
- 在缝线穿过巩膜上主要静脉交叉处时，应将缝线穿行于结膜下，避免对这些静脉造成直接压迫。
注意：尽管我们建议避免压迫大鼠的主要巩膜上静脉，但由于小鼠眼部这些静脉的可见度较低，通常不会对小鼠进行此类操作。即使主要静脉未被直接压迫，巩膜上静脉丛中的较小血管可能仍受到压力，这可能是导致眼内压持续升高的一个影响因素（详见讨论部分关于眼内压升高的机制）。
- 用滑结固定荷包缝合线，随后再打一个单结图1为避免术后眼压过高骤升，在打第二个结之前，应让助手立即测量眼压。
- 如果发现眼内压过高，可通过松开缝线一端的部分张力来调整滑结（箭头所示）。 图1A).
- 在达到理想的眼内压后（大鼠理想范围为 30 - 60 mmHg，小鼠为 30 - 40 mmHg），在持续对缝线该端施加牵拉力的同时打结固定第二个结（箭头所示）。 图1A).
- 第二个结扎紧后，剪除缝线末端，以尽量减少异物感。在动物从全身麻醉中恢复期间进行密切监测。
注意：在打第一个结时，必须使用滑结，以确保对眼球产生足够的向内压迫力。数周后，通常会观察到结的两端逐渐嵌入结膜中。
4. 监测眼内压
- 在术后2分钟、异氟烷麻醉下进行首次眼压测量。随后，按照前述步骤1和步骤2，在啮齿类动物恢复意识后监测眼压。
注意：在术后第一天监测两次眼压（2分钟和1小时），术后第一周每日监测，之后每周监测一次或两次。
5. 视网膜结构与功能的检测
- 在预定的实验终点（本实验中为大鼠8周、小鼠12周），通过腹腔注射氯胺酮/赛拉嗪进行全身麻醉，在暗适应条件下测量视网膜电图（ERG）以评估视网膜功能，具体方法详见其他文献15,16,17。
注：我们发现，在8至12周的时间范围内，可观察到明显的神经节细胞功能障碍、视网膜神经纤维层变薄以及神经节细胞丢失。其他研究者也成功采用了更长时间的眼内压升高模型14,15。 - ERG测量完成后，立即采用谱域光学相干断层扫描（SD-OCT）测量视网膜神经纤维层（RNFL）厚度及全层视网膜厚度16,18。
- 纵向研究结束后，在深度麻醉状态下处死动物。
- 取视网膜组织用于组织学分析18，例如使用视网膜神经节细胞（RGC）特异性抗体对视网膜铺片进行免疫染色，常用抗体包括多剪接RNA结合蛋白抗体（RBPMS）或脑特异性同源框/POU结构域蛋白3A（Brn3a）16,19,22。
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结果
大鼠18和小鼠16的以下结果此前已有报道，此处予以总结。环角膜缝合术在大鼠和小鼠中均诱导出相似的眼内压（IOP）升高模式（图2）。缝合术后立即出现短暂的IOP急剧升高，大鼠最高达58.1 ± 2.7 mmHg，小鼠最高达38.7 ± 2.2 mmHg。在大鼠中，IOP水平随时间逐渐下降，术后3小时和24小时分别为44 ± 6 mmHg和32 ± 2 mmHg15。在初始IOP峰值之后，IOP在数周内保持相对稳定。在整个实验期间，高眼压（OHT）眼的IOP在大鼠中持续升高约9 mmHg达8周，在小鼠中持续升高约5 mmHg达12周。
为评估视网膜神经节细胞（RGC）功能，采用极微弱刺激能量进行暗视视网膜电图（ERG）检测，可引出正向暗视阈值反应（pSTR...
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讨论
角膜缘环扎缝合是一种新的慢性眼压升高模型。除了代表性结果所来源的研究之外16,18该动物模型已在近期多项研究中被使用15,23,24,25,26比较既往研究报告表明，该方法可产生可重复的结果，包括眼内压（IOP）升高的幅度以及造模过程中短暂的IOP峰值（见后文讨论）。尽管诱导显著的视网膜神经节细胞（RGC）改变所需的IOP升高持续时间在8至12周之间，但该模型可维持更长时间，已有研究报道了持续15至16周IOP升高的实验结果。14,15除了可重复性外，该方法相对简单、成本较低，且适用...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作由澳大利亚国家健康与医学研究理事会项目资助（1046203）和澳大利亚研究理事会未来奖学金（FT130100338）资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 生理盐水 | Baxter International Inc | AHB1323 | 维持手术期间角膜的水合状态 |
| 0.5% 氯己定 | Orion Laboratories | 27411, 80085 | 手术器械的消毒 |
| 99.9% 异氟烷 | Abbott Australasia Pty Ltd | CAS 26675-46-7 | 商品名：Isoflo(TM) 吸入麻醉剂。药用级吸入麻醉剂，与氧气混合用于缝合手术 |
| 眼用润滑剂 | Alcon Laboratories | 1618611 | 商品名：Genteal，用于保持对侧眼的湿润 |
| 持针器（显微手术） | World Precision Instruments | 555419NT | 眼科手术中用于持针 |
| 0.5% 丙美卡因 | Alcon Laboratories | CAS 5875-06-9 | 局部眼用镇痛剂 |
| 剪刀（显微手术） | World Precision Instruments | 501232 | 结扎过程中剪除多余的缝线残端 |
| 手术铺巾 | Vital Medical Supplies | GM29-612EE | 确保手术期间的无菌环境 |
| 大鼠用缝合针（显微手术） | Ninbo medical needles | 151109 | 8-0 尼龙缝线连接圆针，切缘 3/8，双针，缝线长度 30 cm |
| 小鼠用缝合针（显微手术） | Ninbo medical needles | 160905 | 10-0 尼龙缝线连接圆针，切缘 3/8，双针，缝线长度 30 cm |
| 镊子（显微手术） | World Precision Instruments | 500342 | 眼科手术中用于操作组织 |
| 回弹式眼压计 | TONOLAB, iCare, Helsinki, Finland | TV02 | 用于眼内压监测 |
参考文献
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