通过激活载脂蛋白E缺陷小鼠的盐皮质激素受体诱导动脉粥样硬化斑块形成

摘要

我们描述了一种通过持续释放醛固酮，在饲喂致动脉粥样硬化饮食的ApoE^-/-小鼠主动脉根部诱导动脉粥样硬化的实验方案。同时介绍了用于表征斑块成分的方法。

摘要

动脉粥样硬化是由影响血管内皮的慢性炎症反应所致，并受到高血压、血脂异常和糖尿病等多种因素的促进。迄今为止，已有证据支持循环醛固酮在心血管疾病发生中作为危险因素的作用。为研究导致动脉粥样硬化的细胞和分子过程，已建立了转基因小鼠模型。在本论文中，我们描述了一种利用醛固酮持续输注于ApoE^-/-小鼠并在治疗4周后于主动脉根部诱导形成动脉粥样硬化斑块的实验方案。因此，我们展示了一种用于定量和表征主动脉根部动脉粥样硬化病变的方法。醛固酮输注的优势在于，经过4周治疗即可形成富含脂质和炎症细胞的动脉粥样硬化病变。我们详细描述了用于定量斑块内脂质和巨噬细胞含量的染色步骤。值得注意的是，在本方案中，我们采用OCT包埋心脏组织，以保持心肌组织的抗原性，并提高目标抗原的可检测性。对斑块表型的分析是研究动脉粥样硬化发病机制以及发现新型抗动脉粥样硬化药物药理靶点的有效途径。

引言

动脉粥样硬化是全球范围内发病率和死亡率的主要原因之一¹。其特征为慢性炎症状态，血液中的脂质和白细胞浸润血管壁，导致动脉粥样硬化斑块的形成。大多数急性心脏事件与斑块破裂引发的血栓事件相关。易破裂的斑块被称为"易损"斑块，其特点为促炎性白细胞浸润增加、存在坏死核心以及纤维帽较薄²。近几十年来，临床和实验研究已阐明了该疾病的复杂病理生理机制。目前使用多种动物模型来研究动脉粥样硬化发生过程中的分子机制³。尽管在病理生理学方面存在某些物种特异性差异，小鼠仍是目前研究动脉粥样硬化最常用的动物模型。特别是，在小鼠模型中循环胆固醇主要由高密度脂蛋白（具有抗动脉粥样硬化特性）组成，而在人类中循环胆固醇主要以低密度脂蛋白（LDL）形式运输，这可能是野生型小鼠不会自发形成动脉粥样硬化的主要原因⁴。此外，野生型小鼠通常对饮食中的胆固醇吸收具有抵抗性，而人类则可吸收约50%的膳食胆固醇⁴。为克服这些局限性，已开发出多种基因修饰的小鼠模型。载脂蛋白E缺陷小鼠（ApoE^−/−）和低密度脂蛋白受体缺陷小鼠（LDLr^−/−）被广泛使用。在高脂高胆固醇饮食条件下，ApoE^−/−小鼠比LDLr^−/−小鼠更快形成斑块，因此ApoE^−/−小鼠的应用比LDLr^−/−小鼠更为广泛^5,6。ApoE^−/−小鼠可发展出动脉粥样硬化的各个阶段病变，且其病变与人类观察到的相似，尽管小鼠斑块不表现出不稳定表型⁷。通常情况下，ApoE^−/−小鼠可自发形成动脉粥样硬化，而西方饮食可加速这一过程³。动脉粥样硬化的严重程度可在颈动脉、肺动脉、股动脉、锁骨下动脉以及主动脉根部进行评估⁶。特别是，主动脉根部是小鼠易于形成动脉粥样硬化病变的解剖部位。因此，通常将该区域作为评估动脉粥样硬化斑块形成的常规部位。

多项研究表明，醛固酮参与动脉粥样硬化的发展^8,9,10。在饲喂致动脉粥样硬化饮食的ApoE^−/−小鼠中，输注醛固酮可加速主动脉根部动脉粥样硬化病变的发展，促进炎症性且富含脂质的斑块形成¹⁰。

综上所述，我们描述了一种包括醛固酮输注、致动脉粥样硬化饮食喂养、心脏组织包埋以及在ApoE^-/- 小鼠中对动脉粥样硬化病变进行定量和表征的实验方案。该方法可有效促进形成富含脂质且伴有炎症的动脉粥样硬化斑块，是研究动脉粥样硬化发生机制的有价值模型。

方案

本研究已获得意大利国家卫生保健与使用委员会批准，批准编号为 493/2016-PR。所有操作均遵循欧洲共同体关于实验动物使用的指南（欧洲指令 2010/63/UE）。

注意：将含有载体（生理盐水中的乙醇）或醛固酮（240 µg · kg^-1 · d^-1）的渗透泵植入8至10周龄、ApoE基因缺陷的雄性小鼠皮下。通常情况下，8至10周龄的ApoE^−/−雄性小鼠体重约为25-26 g。

1. 溶解醛固酮

1. 将5 mg醛固酮粉末溶于1 mL无水乙醇中。
2. 取56.7 µL溶于乙醇的醛固酮溶液，加入68.3 µL生理盐水中，以获得2.27 µg/µL的浓度。用该溶液完全填充渗透压微型泵，每只泵填充125 µL（每只微型泵的最大容量为125 µL）。
3. 微型泵的流速设为0.11 µL/h，因此每24小时释放2.64 µL溶液。每只小鼠每日给予约6 µg · d^-1的醛固酮，持续28天。

2. 渗透泵的填充与植入

注意：泵以两个独立部件提供：泵的主体部分和流量调节器。

1. 使用外科手套填充和操作微型泵。
   注意：皮肤油脂可能影响微型泵的性能。以下步骤应在无菌的层流罩中进行。
2. 将微型泵附带的填充管连接至1 mL注射器，并吸取醛固酮溶液或溶剂。
   注意：抽吸溶液时应避免空气进入注射器，以防泵内产生气泡。
3. 将填充管从微型泵顶部的小孔插入，直至无法再深入（图1A-1B）。缓慢向泵内注入醛固酮或溶剂。注意观察泵内显示液面的深色阴影，并观察其随填充过程逐渐上升。
   1. 当液体珠滴从泵体溢出时，停止填充。
4. 小心拔出填充管，并将流量调节器插入微型泵体内（图1C）。确保调节器紧密贴合泵体。将已填充的渗透泵置于含有无菌生理盐水的烧杯中，在37 °C下孵育最多24小时，然后植入小鼠体内（预处理步骤）。
5. 在使用70% 乙醇消毒的区域进行手术，以维持无菌环境。
6. 在切口部位滴加1-3滴0.25%布比卡因，并使用3%异氟烷麻醉 动物。打开供气开关，将流量计设置为500-1000 mL/min。将动物放入诱导室并密封顶部。开启蒸发器至5%异氟烷，并持续观察小鼠直至其侧卧不动。
   1. 切换系统使气体流向鼻罩。将动物从诱导室中取出并固定于鼻罩中。2-3分钟后，小鼠开始苏醒。重新启动气流，将流量计设为100-200 mL/min，蒸发器设为3%异氟烷。
   2. 在实施操作前，通过测试足底回缩反射和眼睑反射确认麻醉深度。在手术过程中监测呼吸及对刺激的反应，并根据需要调整蒸发器输出。
   3. 使用眼用软膏保护角膜，防止其干燥。
7. 使用剃刀去除手术区域的毛发（图1D）。微型泵皮下植入的常规部位为背部。
8. 使用浸透70%异丙醇的无纺布垫清洁手术区域。
9. 使用清洁且专用的空间（用70%乙醇消毒），并覆盖无菌布单。将器械尖端置于玻璃珠灭菌器中灭菌。使用灭菌器械开始手术，并以无菌方式操作器械。
10. 使用手术剪在距尾部约2 cm处做0.8-1 cm长的切口，如图1E-1F所示。操作过程中保持无菌，确保无菌手套或器械尖端不接触手术专用区域以外的任何物体。
11. 注意仅切割皮肤，避免损伤皮下组织。一手持镊子撑开切口，另一手持套管针分离皮肤，从背部向上至肩胛区域创建一个用于放置泵的皮下囊袋（位于小鼠左侧或右侧）。
12. 将泵插入切口，轻柔地将泵完全推入囊袋内（图1H）。应保留足够松弛的皮肤，以便无张力地闭合伤口，无需牵拉皮肤。泵植入后，使用 手术缝线（聚乙醇酸910，缝线规格6-0）缝合切口。
    注意：调节器头部必须朝向小鼠前方（图1G）。
13. 用干净的棉签涂抹10%聚维酮/碘软膏（图1I），并将动物置于加热板上。在小鼠恢复胸卧位前不得无人看管。评估其水合状态，必要时皮下注射0.5 mL 0.9%生理盐水。之后将动物送回常规饲养环境。
14. 遵循机构指南进行 记录 （例如填写包含术中和术后信息的手术表单，更新笼卡上的操作和日期信息） ，并给予镇痛药（布托啡诺，0.05 mg/kg）以减轻术后疼痛，以及抗生素（恩诺沙星  85 mg/kg）以预防 术后感染。
    1. 继续每日监测，观察疼痛迹象。注意确认伤口完全闭合，且微型泵保持在皮下囊袋内。伤口可能裂开，导致小鼠丢失微型泵。

3. 心脏解剖

1. 处死动物时，通过肌肉注射给予小鼠 80–100 mg/kg 的 Zoletil 进行麻醉。Zoletil 可诱导深度麻醉。注意：在进行操作前，应通过检测足底反射和眼睑反射确认小鼠已达到足够的麻醉深度；小鼠将在深度麻醉状态下进行灌注。使用剪刀和镊子，沿胸骨侧方剪开肋骨，将胸骨向头部方向牵拉，以打开胸腔。
2. 通过左心室进行重力灌注，先灌注 10–15 mL 冰冷的杜氏磷酸盐缓冲液（PBS），随后灌注 40–50 mL 10% 中性缓冲甲醛溶液，以固定血管系统。当小鼠出现明显的肌肉收缩并变得僵硬时，表明固定有效。
   注意：固定过程通常持续 10–20 分钟。固定后的器官和组织可用于免疫荧光或免疫组织化学分析。重要的是，此类固定组织不能用于基因表达和蛋白质印迹（western blotting）分析。
3. 用镊子夹住心脏，使用剪刀或手术刀片沿垂直于主动脉轴的方向，尽可能靠近心脏但不造成损伤处切断，将心脏与主动脉分离（图 2A）。使用手术刀片沿连接左右心房下缘的直线横向切割（图 2B）。
4. 通过心脏腔室向切开后的心脏上部填充最佳切片包埋剂（OCT）（图 2D-2E）。将组织放入冷冻切片塑料模具中，使主动脉轴垂直于矩形模具的底面，并用 OCT 完全覆盖（图 2F）。确保无气泡残留；若存在气泡，应尝试将其推至边缘。
5. 将金属板置于干冰上，然后小心地将模具放置其上（图 2G）。当 OCT 变为白色后，用锡箔纸包裹模具，并于 –80 °C 保存。

4. 主动脉根部切片

1. 将冷冻切片机温度设置为 –20 °C。切片前，将包埋的组织放入其中，静置约 15 分钟，使其适应此温度。将样本架温度设置为 -17 °C（图 3A）。
2. 将冷冻的心脏组织块放入冷冻切片机内，使其温度与切片机环境达到平衡（图 3B），然后将冷冻心脏组织块从模具中取出（图 3C）。修去冷冻组织块上多余的 OCT 包埋剂，以便使组织块尺寸更好地适配样本架（图 3D）。
3. 将冷冻心脏组织块安装在样本架上，使心室面朝外（图 3E-3I），并将样本架插入样本定位头（图 3J）。调整样本架的方向，使切割时主动脉根部与刀刃垂直（图 3K）。
4. 开始切片，弃去不需要的切片，直至暴露出主动脉根部（图 3L-3N）。连续收集切片，并将其贴附于载玻片上（图 3O）。在显微镜下观察主动脉根部的解剖轮廓，直至三个主动脉瓣均清晰可见（图 3P-3Q）。
5. 为进行 Oil Red O 和 Picro Sirius Red 染色，以每片 10 µm 厚度收集切片；为进行 MAC3 染色，以每片 6 µm 厚度收集切片（图 3R）。每个心脏收集约 6–8 张载玻片，直至三个瓣膜之一消失或不再完整为止。

5. 免疫组织化学

注意：以下方案中报告的所有染色步骤均在玻璃染色缸（Coplin staining jars）中进行。

1. 中性脂肪的油红O染色
   1. 将切片置于70 mL的37%甲醛中固定5分钟。用自来水充分清洗，并吸去多余水分。
   2. 将48 mL油红O（0.5%异丙醇溶液）与32 mL蒸馏水混合，配制成0.3%油红O溶液。
   3. 将切片置于70 mL的0.3%油红O溶液中染色10分钟。随后用自来水冲洗切片10分钟。
   4. 将切片置于70 mL Mayer苏木精溶液中染色1分钟。再用自来水冲洗切片1分钟。
   5. 将切片浸入70 mL的0.5%碳酸锂溶液中。再用自来水冲洗1分钟。
   6. 使用水溶性封片剂封片，并通过安装在光学显微镜上的数码相机采集图像。
2. 胶原染色的天狼星红-苦味酸染色法
   1. 切取10 µm厚的冷冻切片，并将其贴附于载玻片底部。
   2. 将切片置于70 mL丙酮中固定5分钟，空气干燥后用蒸馏水短暂漂洗。
   3. 将切片置于70 mL的0.2%磷钼酸溶液中5分钟。随后用蒸馏水短暂漂洗。
   4. 将切片置于70 mL的0.1%天狼星红-苦味酸溶液中染色90分钟。用70 mL的0.01 N HCl漂洗一次，弃去染液。
   5. 将切片置于70 mL的0.01 N HCl中2分钟。用蒸馏水短暂漂洗后空气干燥。
   6. 将切片短暂浸入70 mL的70%乙醇中。
   7. 待切片完全干燥后，将其置于70 mL萜烯类透明剂中，使用聚（甲基丙烯酸丁酯-co-甲基丙烯酸甲酯）封片剂封片，并通过安装在光学显微镜上的数码相机采集图像。
      注：天狼星红-苦味酸染色的一个优势在于，可通过偏振光显微镜区分I型（粗纤维，呈黄橙色双折射）和III型（细纤维，呈绿色双折射）胶原纤维网络¹¹。
3. 巨噬细胞染色的Mac3染色法
   1. 切取6 µm厚的冷冻切片，并将其贴附于载玻片底部。
   2. 将切片置于70 mL冷丙酮中固定5分钟。随后浸入70 mL PBS中2分钟。
   3. 使用移液器将1%十二烷基硫酸钠（SDS）溶液覆盖切片，室温（RT）孵育5分钟以进行抗原修复。再将切片浸入70 mL PBS中5分钟。
   4. 使用移液器将0.3%过氧化氢覆盖切片，室温孵育20分钟。随后在70 mL PBS中洗涤3次，每次5分钟。
   5. 后续步骤使用亲和素-生物素复合物（ABC）-HRP试剂盒进行。
   6. 使用移液器将正常兔血清覆盖切片，室温封闭20分钟。无需漂洗。
   7. 加入MAC3抗体（1:300稀释）室温孵育90分钟。随后在70 mL PBS中洗涤3次，每次5分钟。
   8. 加入生物素化二抗（抗大鼠IgG，1:200稀释）室温孵育45分钟。用70 mL PBS漂洗3次，每次5分钟。
   9. 将切片覆盖兔IgG ABC试剂，室温孵育30分钟。用30 mL PBS漂洗3次，每次5分钟。
   10. 将切片覆盖3-氨基-9-乙基咔唑（AEC）显色液10分钟。用70 mL蒸馏水漂洗10次。
   11. 将切片置于70 mL Mayer苏木精溶液中复染1分钟。用自来水冲洗切片1分钟。
   12. 将切片浸入70 mL的0.5%碳酸锂溶液中。再用自来水冲洗1分钟。
   13. 使用水溶性封片剂封片，并通过安装在光学显微镜上的数码相机采集图像。

6. 主动脉根部切片中动脉粥样硬化病变的图像分析

注意：用 Oil Red O 或 MAC3 染色的主动脉根部切片 感兴趣的抗体可使用以下方法进行分析 适当的软件（见文中注明） 材料表）。对目标组分染色阳性的总像素数进行斑块总面积归一化处理。图像由对处理分组设盲的研究人员采集和分析。

1. 校准
   1. 打开软件，然后选择要分析的图像（jpg格式）。
   2. 选择 主页 | 创建 | 快速校准。
   3. 通过沿图像的比例尺绘制一条线来设置图像的校准。
   4. 保存校准设置。
2. 图像分析
   1. 从 选项 菜单 | 空间校准选项 中选择已保存的校准设置。
   2. 选择 校准 | 应用。
   3. 在 选择 菜单中选择多边形工具，并沿所有动脉粥样硬化病变区域绘制轮廓。
   4. 选择 计数/尺寸 | 类型。在菜单中添加 面积 和 百分比面积。
   5. 在 计数/尺寸 菜单中选择 手动，此时将打开一个新窗口。
   6. 在该 窗口 中，点击 在图像上选取颜色 工具，并选择 HSI 模式。
   7. 将鼠标光标指向目标标记的阳性像素区域，以创建颜色范围。
   8. 点击 计数，在 测量表格 中显示的 总和 值表示该标记物所占面积的百分比（也可用 µm² 表示），相对于动脉粥样硬化病变总面积的比例。

结果

在8-10周龄的Apo^-/-小鼠中，植入微型泵以输注溶剂或醛固酮（图1E-1I），并喂食致动脉粥样硬化饮食（调整热量饮食，其中42%热量来自脂肪）持续4周。治疗结束后，小鼠被处死，并按上述方法用PBS和10%福尔马林灌注。主动脉根部从心脏心尖部分离出来，并包埋于OCT中（图2）。使用冷冻切片机制备主动脉根部的横切片，用于不同染色分析（图3）。

动脉粥样硬化斑块的组成可通过针对特定成分的染色进行表征，这些成分定义了斑块发展的阶段。如步骤5.1所述，使用油红O染色测定动脉粥样硬化病变中的脂质含量；如步骤5.2所述，采用苦味酸天狼星红染色测定胶原含量；如步骤5.3所述，采用Ma...

讨论

动脉粥样硬化是一种与大中型血管相关的慢性炎症性疾病，涉及多种细胞类型之间的相互作用，例如巨噬细胞、T淋巴细胞、内皮细胞和平滑肌细胞¹。尽管小鼠动脉粥样硬化模型存在局限性，但目前已有大量关于动脉粥样硬化过程的证据。这些模型的优势在于能够快速生成特定年龄和性别的实验动物群体。此外，小鼠具有明确且均一的遗传背景。

在易发生动脉粥样硬化的鼠类模型中观察到的动脉粥样硬化斑块的形成过程，在一定程度上类似于人类中的情况，但不包括不稳定斑块的形成⁴。斑块破裂及其继发性血栓形成是人类心肌梗死的主要原因，但在小鼠动脉粥样硬化模型中并未观察到这一现象。在我们近期的研究论文中，我们证明了在饲喂高脂饮食（HFD）的ApoE^-/-小鼠中，连续4周输注醛固酮可诱导形成不稳定的斑块表型¹⁰。事实上，该处理可显著增加主动脉根部水平的斑块面积、脂质含量和炎症区域，而与未处理小鼠相比，胶原含量无显著差异¹⁰。...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
调整热量饮食（脂肪占42%）	Envigo	TD.88137	致动脉粥样硬化饮食
带填充管的渗透压微型泵	Alzet	model 1004	用于持续释放
醛固酮	SIGMA	A9477	激素
乙醇	SIGMA	34852-M	溶剂
含70%异丙醇的酒精棉片	Kendal Webcol	6818	消毒剂
手术缝线（Vicryl 6.0）	Demas	500004	手术
10%聚维酮碘软膏	Aplicare-Meriden	52380-0026-1	抗菌剂
10%福尔马林	SIGMA	HT5012	用于固定血管
冷冻模具	Bio-Optica	07-MP1515	用于包埋
O.C.T. 包埋剂	Sakura Finetek	4583	用于包埋
冷冻切片机	Leica	CM1900	切片仪器
杜氏磷酸盐缓冲液	Aurogene	AU-L0615-500	缓冲溶液
多聚赖氨酸载玻片	VWR	631-0107	显微镜玻片
盖玻片	Bio-Optica	72015	盖玻片
37%甲醛	SIGMA	252549	溶剂
油红O溶液（0.5%异丙醇溶液）	SIGMA	O1391	染色液
Mayer’s 苏木精	SIGMA	MHS32	染色液
碳酸锂	SIGMA	62470	洗涤缓冲液
水溶性封片介质	Thermo Scientific	TA-125-AM	封片液
丙酮	SIGMA	179124	溶剂
磷钼酸溶液	SIGMA	HT153	用于组织学
直接红80（苦味酸天狼星红）	SIGMA	365548	染色液
Bio Clear（萜类来源的透明剂）	Bio-Optica	06-1782D	组织学样本制备产品
Eukitt 快干封片介质（聚（甲基丙烯酸丁酯-共-甲基丙烯酸甲酯））	SIGMA	3989	封片液
十二烷基硫酸钠	Fluka	71725	粉末
过氧化氢溶液（30%）	SIGMA	H1009	溶液
Vectorstain ABC 试剂盒，包含：抗兔IgG ABC、正常兔血清、生物素化抗大鼠IgG	Vector Laboratories	PK-6100	染色液
3-氨基-9-乙基咔唑	Vector Laboratories	SK-4200	染色液
Mac3 抗体	BD Biosciences	553322	抗体
ImagePro Premier 9	Media Cybernetics	050910000-2534	图像分析软件