通过激活载脂蛋白E缺陷小鼠的盐皮质激素受体诱导动脉粥样硬化斑块形成

摘要

我们描述了一种通过持续释放醛固酮，在饲喂致动脉粥样硬化饮食的ApoE^-/-小鼠主动脉根部诱导动脉粥样硬化的实验方案。同时介绍了用于表征斑块成分的方法。

摘要

动脉粥样硬化是由影响血管内皮的慢性炎症反应所致，并受到高血压、血脂异常和糖尿病等多种因素的促进。迄今为止，已有证据支持循环醛固酮在心血管疾病发生中作为危险因素的作用。为研究导致动脉粥样硬化的细胞和分子过程，已建立了转基因小鼠模型。在本论文中，我们描述了一种利用醛固酮持续输注于ApoE^-/-小鼠并在治疗4周后于主动脉根部诱导形成动脉粥样硬化斑块的实验方案。因此，我们展示了一种用于定量和表征主动脉根部动脉粥样硬化病变的方法。醛固酮输注的优势在于，经过4周治疗即可形成富含脂质和炎症细胞的动脉粥样硬化病变。我们详细描述了用于定量斑块内脂质和巨噬细胞含量的染色步骤。值得注意的是，在本方案中，我们采用OCT包埋心脏组织，以保持心肌组织的抗原性，并提高目标抗原的可检测性。对斑块表型的分析是研究动脉粥样硬化发病机制以及发现新型抗动脉粥样硬化药物药理靶点的有效途径。

引言

动脉粥样硬化是全球范围内发病率和死亡率的主要原因之一¹。其特征为慢性炎症状态，血液中的脂质和白细胞浸润血管壁，导致动脉粥样硬化斑块的形成。大多数急性心脏事件与斑块破裂引发的血栓事件相关。易破裂的斑块被称为"易损"斑块，其特点为促炎性白细胞浸润增加、存在坏死核心以及纤维帽较薄²。近几十年来，临床和实验研究已阐明了该疾病的复杂病理生理机制。目前使用多种动物模型来研究动脉粥样硬化发生过程中的分子机制³。尽管在病理生理学方面存在某些物种特异性差异，小鼠仍是目前研究动脉粥样硬化最常用的动物模型。特别是，在小鼠模型中循环胆固醇主要由高密度脂蛋白（具有抗动脉粥样硬化特性）组成，而在人类中循环胆固醇主要以低密度脂蛋白（LDL）形式运输，这可能是野生型小鼠不会自发形成动脉粥样硬化的主要原因⁴。此外，野生型小鼠通常对饮食中的胆固醇吸收具有抵抗性，而人类则可吸收约50%的膳食胆固醇⁴。为克服这些局限性，已开发出多种基因修饰的小鼠模型。载脂蛋白E缺陷小鼠（ApoE^−/−）和低密度脂蛋白受体缺陷小鼠（LDLr^−/−）被广泛使用。在高脂高胆固醇饮食条件下，ApoE^−<....

方案

本研究已获得意大利国家卫生保健与使用委员会批准，批准编号为 493/2016-PR。所有操作均遵循欧洲共同体关于实验动物使用的指南（欧洲指令 2010/63/UE）。

注意：将含有载体（生理盐水中的乙醇）或醛固酮（240 µg · kg^-1 · d^-1）的渗透泵植入8至10周龄、ApoE基因缺陷的雄性小鼠皮下。通常情况下，8至10周龄的ApoE^−/−雄性小鼠体重约为25-26 g。

1. 溶解醛固酮

1. 将5 mg醛固酮粉末溶于1 mL无水乙醇中。
2. 取56.7 µL溶于乙醇的醛固酮溶液，加入68.3 µL生理盐水中，以获得2.27 µg/µL的浓度。用该溶液完全填充渗透压微型泵，每只泵填充125 µL（每只微型泵的最大容量为125 µL）。
3. 微型泵的流速设为0.11 µL/h，因此每24小时释放2.64 µL溶液。每只小鼠每日给予约6 µg · d^-1的醛固酮，持续28天。

2. 渗透泵的填充与植入

注意：泵以两个独立部件提供：泵的主体部分和流量调节器。

1. 使用外科手套填充和操作微型泵。
   注意：皮肤....

结果

在8至10周龄的Apo^-/-小鼠中，植入微型泵以输注溶剂或醛固酮（图1E-1I），并喂食致动脉粥样硬化饮食（调整热量饮食，脂肪占42%）持续4周。治疗结束时，按前述方法对小鼠实施安乐死，并用PBS和10%甲醛灌流。分离主动脉根部与心脏心尖部分，并将其包埋于OCT中（图2）。使用冷冻切片机制备主动脉根部的横切片，用于不同染色分析（图3）。

动脉粥样硬化斑块的成分可通过特异性染色来表征，从而确定斑块的发展阶段。如步骤5.1所述，采用油红O染色法测定动脉粥样硬化病变中的脂质含量；如步骤5.2所述，采用天狼星红染色法测定胶原含量；如步骤5.3所述，采用Mac3染色法测定巨噬细胞含.......

讨论

动脉粥样硬化是一种与大中型血管相关的慢性炎症性疾病，涉及多种细胞类型之间的相互作用，例如巨噬细胞、T淋巴细胞、内皮细胞和平滑肌细胞¹。尽管小鼠动脉粥样硬化模型存在局限性，但目前已有大量关于动脉粥样硬化过程的证据。这些模型的优势在于能够快速生成特定年龄和性别的实验动物群体。此外，小鼠具有明确且均一的遗传背景。

在易发生动脉粥样硬化的鼠类模型中观察到的动脉粥样硬化斑块的形成过程，在一定程度上类似于人类中的情况，但不包括不稳定斑块的形成⁴。斑块破裂及其继发性血栓形成是人类心肌梗死的主要原因，但在小鼠动脉粥样硬化模型中并未观察到这一现象。在我们近期的研究论文中，我们证明了在饲喂高脂饮食（HFD）的ApoE^-/-小鼠中，连续4周输注醛固酮可诱导形成不稳定的斑块表型¹⁰。事实上，该处理可显著增加主动脉根部水平的斑块面积、脂质含量和炎症区域，而与未处理小鼠相比，胶原含量无显著差异¹⁰。.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
调整热量饮食（脂肪占42%）	Envigo	TD.88137	致动脉粥样硬化饮食
带填充管的渗透压微型泵	Alzet	model 1004	用于持续释放
醛固酮	SIGMA	A9477	激素
乙醇	SIGMA	34852-M	溶剂
含70%异丙醇的酒精棉片	Kendal Webcol	6818	消毒剂
手术缝线（Vicryl 6.0）	Demas	500004	手术
10%聚维酮碘软膏	Aplicare-Meriden	52380-0026-1	抗菌剂
10%福尔马林	SIGMA	HT5012	用于固定血管
冷冻模具	Bio-Optica	07-MP1515	用于包埋
O.C.T. 包埋剂	Sakura Finetek	4583	用于包埋
冷冻切片机	Leica	CM1900	切片仪器
杜氏磷酸盐缓冲液	Aurogene	AU-L0615-500	缓冲溶液
多聚赖氨酸载玻片	VWR	631-0107	显微镜玻片
盖玻片	Bio-Optica	72015	盖玻片
37%甲醛	SIGMA	252549	溶剂
油红O溶液（0.5%异丙醇溶液）	SIGMA	O1391	染色液
Mayer’s 苏木精	SIGMA	MHS32	染色液
碳酸锂	SIGMA	62470	洗涤缓冲液
水溶性封片介质	Thermo Scientific	TA-125-AM	封片液
丙酮	SIGMA	179124	溶剂
磷钼酸溶液	SIGMA	HT153	用于组织学
直接红80（苦味酸天狼星红）	SIGMA	365548	染色液
Bio Clear（萜类来源的透明剂）	Bio-Optica	06-1782D	组织学样本制备产品
Eukitt 快干封片介质（聚（甲基丙烯酸丁酯-共-甲基丙烯酸甲酯））	SIGMA	3989	封片液
十二烷基硫酸钠	Fluka	71725	粉末
过氧化氢溶液（30%）	SIGMA	H1009	溶液
Vectorstain ABC 试剂盒，包含：抗兔IgG ABC、正常兔血清、生物素化抗大鼠IgG	Vector Laboratories	PK-6100	染色液
3-氨基-9-乙基咔唑	Vector Laboratories	SK-4200	染色液
Mac3 抗体	BD Biosciences	553322	抗体
ImagePro Premier 9	Media Cybernetics	050910000-2534	图像分析软件