小鼠受精卵和早期胚胎由透明带保护，透明带是一种糖蛋白基质，可形成阻碍基因递送的屏障。本文介绍了一种利用激光穿孔透明带，通过慢病毒载体转导胚胎细胞并制备转基因小鼠的实验方案。
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摘要
摘要
慢病毒是向哺乳动物细胞递送基因的高效载体。转导后，慢病毒基因组可稳定整合至宿主染色体中，并可传递给子代细胞。因此，慢病毒是构建稳定细胞系的理想载体。 体内 指示剂递送以及单细胞受精卵的转导以制备转基因动物。然而，小鼠受精卵和早期胚胎被透明带（zona pellucida）所保护，这是一种糖蛋白基质，可形成阻碍慢病毒基因递送的屏障。慢病毒颗粒过大，无法穿透透明带，通常需通过显微注射将病毒颗粒注入卵周隙（即透明带与胚胎细胞之间的空隙）。由于该操作需要高技能的技术人员和专用设备，限制了慢病毒在小鼠胚胎基因递送中的广泛应用。本文介绍一种利用激光打孔技术穿透小鼠受精卵透明带的方案。激光穿孔不会对胚胎造成损伤，并可使慢病毒进入胚胎细胞以实现基因递送。经转导的胚胎可发育至囊胚阶段 体外 若将这些细胞植入假孕小鼠体内，可发育成转基因仔鼠。本方案所用的激光设备高效且易于操作。通过慢病毒递送的基因能够稳定整合到小鼠胚胎细胞中，并可实现种系传递。该方法为转基因小鼠的制备提供了一种无需对受精卵进行显微操作和显微注射的替代方案。
引言
本方法详细介绍了如何对小鼠受精卵的透明带进行打孔处理，从而使胚胎细胞能够被慢病毒高效递送基因。慢病毒在自然界中即被设计为可高效地将基因递送至哺乳动物细胞，能够感染分裂期和非分裂期细胞，并将慢病毒基因组整合到宿主染色体中1。通过使用水疱性口炎病毒糖蛋白（VSV-G）对重组慢病毒进行假型化改造，可显著扩大其宿主细胞范围，这得益于VSV-G蛋白广泛的嗜性2。在完成转导后，慢病毒基因稳定整合并作为宿主染色体的一部分持续表达，因此成为制备转基因动物的理想工具。若将慢病毒递送至早期胚胎细胞，其基因组将在整个生物体中被复制和表达。慢病毒转导技术已成功用于制备转基因小鼠、大鼠、鸡、鹌鹑和猪等多种物种3,4,5,6,7。然而，传统的慢病毒基因递送方法通常需要熟练的技术人员和专用设备，以克服包裹早期胚胎的透明带屏障。本方法的总体目标是描述如何利用激光对透明带进行打孔处理，以促进慢病毒的基因递送。
哺乳动物的卵子被透明带包围，受精后透明带会硬化，以保护受精卵免于多精受精，并限制外界环境的相互作用8,9。透明带形成了一道屏障，可将慢病毒与胚胎细胞隔离开，直到胚胎孵化成为囊胚。体外培养的小鼠受精卵在4天后孵化，必须在孵化前植入假孕小鼠体内，才能正常发育成仔鼠。因此，为了实现转导，需在孵化前将慢病毒微量注射到卵周隙中，即透明带与胚胎细胞之间的空隙。
透明带通常会被去除以 体外 提高人类卵子受精率的受精方法10然而，化学法去除小鼠透明带会对小鼠胚胎发育产生不利影响，并对胚胎细胞造成损害11,12其他将基因导入小鼠受精卵的方法通过将DNA直接显微注射到细胞核内，以克服透明带屏障13原核显微注射是一种将基因递送至胚胎的有效方法。然而，由于每个胚胎在显微注射过程中都需要单独固定，对于初学者而言，该操作可能较为费力且耗时。
其他方法，如电穿孔和光穿孔，适用于向小鼠受精卵进行瞬时和短期的基因递送14,15,16这些方法被广泛用于递送CRISPR-Cas9组分和重组酶。然而，电穿孔和光穿孔在基因递送中无法高效地用于创建转基因生物。从小鼠附睾穿刺获取的精子也可通过慢病毒进行转导，并用于 体外 受精以产生转基因动物17,18,19,20.
在本实验方案中，通过使用激光对小鼠胚胎的透明带进行打孔以增加其通透性，从而促进慢病毒基因递送。XYClone 激光系统是为辅助该操作而开发的 体外 受精21 胚胎干细胞的培养22它是一种小型装置，安装简便，易于使用。安装在显微镜上后，它占据物镜的位置，配套软件可在通过显微镜目镜观察的同时引导激光瞄准（参见 实验方案：第3节）。一旦XYClone激光在透明带打孔后，即可将慢病毒加入培养基中以实现基因递送23可使用多种慢病毒同时递送多个基因以实现染色体整合。
本方案将介绍如何分离和培养小鼠受精卵，说明使用激光对透明带进行打孔的方法，并演示慢病毒介导的小鼠胚胎细胞转导。
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方案
本方案中使用的所有动物操作和处理均符合美国国立卫生研究院/国家环境卫生科学研究所（NIH/NIEHS）的动物护理指南，并已获得NIH/NIEHS动物护理与使用委员会（ACUC）的批准，动物实验方案编号为2010-0004。
1. 准备工作
- 制备或购买携带目的基因的非复制型慢病毒。本研究中使用了SBI511慢病毒，该病毒在延伸因子1a启动子驱动下表达桡足类绿色荧光蛋白（copepod green fluorescent protein，copGFP；简称为GFP），用于转导实验。采用标准方案2生产慢病毒，并将其滴度调整至高于1e8转导单位/毫升（TU/mL）。
注意：操作时需谨慎，所有接触过慢病毒的材料均须用漂白剂处理。请参照所在机构关于慢病毒安全使用与操作的指南。 - 在收集胚胎前一天，设置所需小鼠品系的交配对。本实验中使用的是C57BL/6J品系小鼠。用于收集卵巢和输卵管的雌性小鼠未接受任何激素处理以诱导超数排卵。
- 在收集小鼠受精卵前2–24小时，按以下步骤准备多个钾离子优化的Simplex培养基24（KSOM）液滴培养板：将50 μL KSOM培养基滴加至35 mm组织培养处理皿中央，加入2 mL二甲基聚硅氧烷（DMPS5X）覆盖，并置于37 oC、5% CO2、5% O2和90% N2环境中平衡。
注意：使用一次性无菌培养板，接触慢病毒后应丢弃。 - 从储存液（100倍浓度，30 mg/mL，-20 °C保存）中用M2培养基配制1倍浓度的透明质酸酶溶液。100倍储存液以水配制。
- 在对小鼠受精卵进行激光辅助转导后24小时，将输精管结扎的雄性小鼠与雌性小鼠配对交配，以制备假孕雌鼠。
2. 小鼠受精卵的分离
- 交配后16–24小时，选择具有阴道栓（表明成功交配）的雌性小鼠，并以人道方式实施安乐死25。本研究中使用的小鼠通过在深度CO2或异氟烷吸入麻醉下进行颈椎脱位处死。
- 根据标准操作流程分离卵巢和输卵管25。
- 将卵巢和输卵管转移至含有M2培养基的35 mm培养皿中。
- 对每个卵巢，撕开壶腹部以释放被卵丘细胞包围的受精卵。
- 将受精卵和卵丘细胞转移至含有M2培养基并添加1x透明质酸酶的35 mm培养皿中，在室温下孵育3–5分钟。
- 用移液器反复吹打受精卵，以去除卵丘细胞。
- 将受精卵转移至含有M2培养基的35 mm培养皿中，反复吹打以洗去透明质酸酶。
- 将受精卵转移至含有KSOM培养基的35 mm培养皿中，反复吹打以去除残留的M2培养基和透明质酸酶。
- 将受精卵转移至步骤1.3中准备好的KSOM液滴培养板中。
注意：在KSOM中培养的小鼠受精卵必须置于组织培养孵箱中，于37 °C、5% CO2、5% O2和90% N2条件下平衡。将培养板从孵箱中取出超过15分钟会导致胚胎受损。 - 在进行下一步操作前，让受精卵在孵箱中恢复2小时。
3. 使用 XYClone 激光穿孔小鼠受精卵
- 根据制造商的建议安装并校准 XYClone 激光系统。其他通常用于 体外 受精，可用以替代XYClone激光对受精卵进行打孔。
- 将激光控制器盒的导线连接到显微镜的激光装置上。
- 通过 USB 端口将激光控制器盒连接到运行激光软件的计算机。3.1.3. 接通激光控制器电源并打开开关。
- 通过目镜观察，穿刺测试样品（例如玻璃载片上的白板笔标记）。
- 使用激光套件中附带的小型螺丝刀，调节激光的X轴和Y轴位置，使其与通过显微镜目镜可见的LED光源重合，从而校准激光。
- 将含有小鼠受精卵的KSOM液滴培养皿置于显微镜载物台上。培养皿在培养箱外放置时间不得超过15分钟。
- 通过显微镜目镜观察，确保胚胎的透明带处于焦点位置，并且激光LED光源可见。
- 移动显微镜载物台，使 LED 光源/激光对准透明带。
- 使用计算机软件将XYClone激光器设置为250 μs。
- 将LED光源大小调整至所需尺寸（本实验中设为5档）。
- 用激光对每个受精卵的透明带进行三次穿孔。透明带可被完全穿透或部分削薄。采用上述设置时，激光将产生直径为10 μm的孔洞。图2).
注意：靠近第一极体进行操作可使激光远离胚胎细胞。 - 让受精卵在组织培养孵育箱中恢复2小时，然后再进行下一步操作。
4. 基于XYClone激光穿孔法对小鼠受精卵的转导
- 将2 μL浓缩的慢病毒（滴度大于1e8 TU/mL）加入50 μL KSOM液滴中。不要反复吹打。受精卵容易黏附在移液枪头末端。根据我们的经验，在小于3 μL的体积中加入1e5–5e5转导单位的慢病毒，是基因递送的最佳条件。
- 将受精卵在培养箱中继续培养4天，使其发育至囊胚阶段。无需更换培养基。
5. 转导小鼠胚胎向假孕小鼠的非手术移植
- 使用假孕小鼠，即在步骤1.5中制备的交配后3.5天的雌鼠。
- 使用非手术胚胎移植（NSET）装置将小鼠胚胎植入假孕小鼠体内。
- 在体视显微镜或解剖显微镜下，插入阴道扩张器以观察宫颈。
- 将非手术胚胎移植（NSET）装置插入宫颈约5 mm，并在约2 μL的体积内释放胚胎。
注意：每次移植均需使用无菌的NSET装置，操作完成后即丢弃。所有用于胚胎操作的试剂必须无菌。
- 将10–15个健康的囊胚以2 μL KSOM液滴体积移植至每只假孕小鼠体内。
- 在随后的数天内持续监测并记录假孕小鼠的体重增长情况，以判断NSET是否成功。
- 可通过让怀孕小鼠自然分娩，或在胚胎移植后第17天进行剖腹产来获得仔鼠26。若胚胎数量极少且发育过大导致无法自然分娩时，通常需要进行剖腹产。
- 采集仔鼠组织进行基因型鉴定，以确定转基因效率27。
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结果
可通过显微镜每日观察经分离/转导的小鼠受精卵的发育情况（图1）。健康的胚胎可在3–4天内发育为囊胚。在本实验方案中，未经处理的胚胎约有60–70%可发育为囊胚23。在114个经激光打孔并转导的胚胎中，有54个发育为囊胚（成胚率为47%），其中46个囊胚表达绿色荧光蛋白GFP（46/54=85%）23。
在收获当天对小鼠胚胎进行激光打孔。激光处理的最佳条件为每个受精卵打3个孔，持续250毫秒。激光操作应以减薄透明带为目的，而非直接打孔（图2）。这种方法可使发育中的胚胎在保持透明带完整包裹的同时，允许慢病毒转导的发生。在本实验中，小鼠胚胎被转导了一种重组慢病毒，该病毒在延伸因子1a启动子驱动下表达桡足类绿色荧光蛋白（简称GFP）。转导时，将2 ...
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讨论
慢病毒能够整合到宿主基因组中，这使其成为稳定基因递送的理想载体。慢病毒载体可携带长达8.5千碱基对（kbp）的遗传物质，足以容纳细胞特异性或诱导型启动子、筛选标记或荧光基团。所插入的基因组物质可随宿主基因组一同复制，并可在预定的时间点被调控表达或关闭。这些载体可在发育的各个阶段实现对基因表达的时间和空间控制，因而被视为强大的基因递送工具。
激光辅助慢病毒转基因是一种高效且易于使用的基因表达方法 体内该方法可用于 在体 蛋白质生产、遗传编码指示剂的表达或功能研究。与其他方法相比，激光辅助慢病毒基因递送技术的效果与原核显微注射相当，但无需专业技术技能或昂贵的显微注射工作站。XYClone 激光设备体积小、便于携带，可轻松在多个实验室之间共享使用。
激光辅助的慢病毒基因递送具有稳定性，而非像受精卵的电穿孔或光穿孔那样为瞬时性。对于递送CRISPR-Cas9组分或重组酶而言，瞬时基因递送更具优势，因为持续表达可能导致异常后果。在本实验方案中，可使用整合酶缺陷型慢病毒（IDLVs）实现小鼠受精卵的瞬时...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究得到了美国国立卫生研究院（NIH）国家环境卫生科学研究所（NIEHS）院内研究计划的支持。我们感谢Robert Petrovich博士和Jason Williams博士对稿件的审阅和宝贵建议。我们还要感谢并致谢Bernd Gloss博士、基因敲除核心实验室、流式细胞术实验室、荧光显微镜与成像中心以及NIEHS比较医学部门各设施在技术方面提供的支持。我们感谢NIEHS比较医学部门的David Goulding先生和成像中心的Lois Wyrick女士为我们提供照片和插图。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| CD510B-1 质粒 | System Biosciences | CD510B-1 | 用于包装表达 EF1a-copGFP 的慢病毒 |
| 二甲基聚硅氧烷 | Sigma | DMPS5X | 胚胎培养 |
| 透明质酸酶 | Sigma | H3506 | 用于去除卵丘细胞 |
| XYClone 激光系统 | Hamilton Thorne Biosciences | 对小鼠受精卵进行穿孔 | |
| 非手术胚胎移植装置（NSET） | ParaTechs | 60010 | 胚胎的 NSET 移植 |
| KSEM 培养基 | Millipore | MR-020P-5F | 胚胎培养 |
| KSEM 培养基成分： | mg/100mL | ||
| NaCl | 555 | ||
| KCl | 18.5 | ||
| KH2PO4 | 4.75 | ||
| MgSO4 7H2O | 4.95 | ||
| CaCl2 2H2O | 25 | ||
| NaHCO3 | 210 | ||
| 葡萄糖 | 3.6 | ||
| 丙酮酸钠 | 2.2 | ||
| DL-乳酸钠盐 | 0.174mL | ||
| 10 mM EDTA | 100µL | ||
| 链霉素 | 5 | ||
| 青霉素 | 6.3 | ||
| 0.5% 酚红 | 0.1mL | ||
| L-谷氨酰胺 | 14.6 | ||
| MEM 必需氨基酸 | 1mL | ||
| MEM 非必需氨基酸 | 0.5mL | ||
| BSA | 100 | ||
| M2 培养基 | Millipore | MR-015-D | 胚胎培养 |
| M2 培养基成分： | mg/100mL | ||
| 氯化钙 | 25.1 | ||
| 硫酸镁（无水） | 16.5 | ||
| 氯化钾 | 35.6 | ||
| 磷酸二氢钾 | 16.2 | ||
| 碳酸氢钠 | 35 | ||
| 氯化钠 | 553.2 | ||
| 牛血清白蛋白组分 | 400 | ||
| D-葡萄糖 | 100 | ||
| Na-HEPES | 54.3 | ||
| 酚红 | 1.1 | ||
| 丙酮酸 | 3.6 | ||
| DL-乳酸 | 295 |
参考文献
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