小鼠受精卵和早期胚胎由透明带保护，透明带是一种糖蛋白基质，可形成阻碍基因递送的屏障。本文介绍了一种利用激光穿孔透明带，通过慢病毒载体转导胚胎细胞并制备转基因小鼠的实验方案。
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摘要
摘要
慢病毒是向哺乳动物细胞递送基因的高效载体。转导后，慢病毒基因组可稳定整合至宿主染色体中，并可传递给子代细胞。因此，慢病毒是构建稳定细胞系的理想载体。 体内 指示剂递送以及单细胞受精卵的转导以制备转基因动物。然而，小鼠受精卵和早期胚胎被透明带（zona pellucida）所保护，这是一种糖蛋白基质，可形成阻碍慢病毒基因递送的屏障。慢病毒颗粒过大，无法穿透透明带，通常需通过显微注射将病毒颗粒注入卵周隙（即透明带与胚胎细胞之间的空隙）。由于该操作需要高技能的技术人员和专用设备，限制了慢病毒在小鼠胚胎基因递送中的广泛应用。本文介绍一种利用激光打孔技术穿透小鼠受精卵透明带的方案。激光穿孔不会对胚胎造成损伤，并可使慢病毒进入胚胎细胞以实现基因递送。经转导的胚胎可发育至囊胚阶段 体外 若将这些细胞植入假孕小鼠体内，可发育成转基因仔鼠。本方案所用的激光设备高效且易于操作。通过慢病毒递送的基因能够稳定整合到小鼠胚胎细胞中，并可实现种系传递。该方法为转基因小鼠的制备提供了一种无需对受精卵进行显微操作和显微注射的替代方案。
引言
本方法详细介绍了如何对小鼠受精卵的透明带进行打孔处理，从而使胚胎细胞能够被慢病毒高效递送基因。慢病毒在自然界中即被设计为可高效地将基因递送至哺乳动物细胞，能够感染分裂期和非分裂期细胞，并将慢病毒基因组整合到宿主染色体中1。通过使用水疱性口炎病毒糖蛋白（VSV-G）对重组慢病毒进行假型化改造，可显著扩大其宿主细胞范围，这得益于VSV-G蛋白广泛的嗜性2。在完成转导后，慢病毒基因稳定整合并作为宿主染色体的一部分持续表达，因此成为制备转基因动物的理想工具。若将慢病毒递送至早期胚胎细胞，其基因组将在整个生物体中被复制和表达。慢病毒转导技术已成功用于制备转基因小鼠、大鼠、鸡、鹌鹑和猪等多种物种3,4,5,6,7。然而，传统的慢病毒基因递送方法通常需要熟练的技术人员和专用设备，以克服包裹早期胚胎的透明带屏障。本方法的总体目标是描述如何利用激光对透明带进行打孔处理，以促进慢病毒的基因递送。
哺乳动物的卵子被透明带包围，受精后透明带会硬化，以保护受精卵免于多精受精，并限制外界....
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方案
本方案中使用的所有动物操作和处理均符合美国国立卫生研究院/国家环境卫生科学研究所（NIH/NIEHS）的动物护理指南，并已获得NIH/NIEHS动物护理与使用委员会（ACUC）的批准，动物实验方案编号为2010-0004。
1. 准备工作
- 制备或购买携带目的基因的非复制型慢病毒。本研究中使用了SBI511慢病毒，该病毒在延伸因子1a启动子驱动下表达桡足类绿色荧光蛋白（copepod green fluorescent protein，copGFP；简称为GFP），用于转导实验。采用标准方案2生产慢病毒，并将其滴度调整至高于1e8转导单位/毫升（TU/mL）。
注意：操作时需谨慎，所有接触过慢病毒的材料均须用漂白剂处理。请参照所在机构关于慢病毒安全使用与操作的指南。 - 在收集胚胎前一天，设置所需小鼠品系的交配对。本实验中使用的是C57BL/6J品系小鼠。用于收集卵巢和输卵管的雌性小鼠未接受任何激素处理以诱导超数排卵。
- 在收集小鼠受精卵前2–24小时，按以下步骤准备多个钾离子优化的Simplex培养基24（KSOM）液滴培养板：将50 μL KSOM培养基滴加至35 mm组织培养处理皿中央，加入2 mL二甲基聚硅氧烷（DMPS5X）覆盖，并置于37 oC、5% CO2....
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结果
可通过显微镜每日观察经分离/转导的小鼠受精卵的发育情况（图1）。健康的胚胎可在3–4天内发育为囊胚。在本实验方案中，未经处理的胚胎约有60–70%可发育为囊胚23。在114个经激光打孔并转导的胚胎中，有54个发育为囊胚（成胚率为47%），其中46个囊胚表达绿色荧光蛋白GFP（46/54=85%）23。
在收获当天对小鼠胚胎进行激光打孔。激光处理的最佳条件为每个受精卵打3个孔，持续250毫秒。激光操作应以减薄透明带为目的，而非直接打孔（图2）。这种方法可使发育中的胚胎在保持透明带完整包裹的同时，允许慢病毒转导的发生。在本实验中，小鼠胚胎被转导了一种重组慢病毒，该病毒在延伸因子1a启动子驱动下表达桡足类绿色荧光蛋白（简称GFP）。转导时，将2 .......
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讨论
慢病毒能够整合到宿主基因组中，这使其成为稳定基因递送的理想载体。慢病毒载体可携带长达8.5千碱基对（kbp）的遗传物质，足以容纳细胞特异性或诱导型启动子、筛选标记或荧光基团。所插入的基因组物质可随宿主基因组一同复制，并可在预定的时间点被调控表达或关闭。这些载体可在发育的各个阶段实现对基因表达的时间和空间控制，因而被视为强大的基因递送工具。
激光辅助慢病毒转基因是一种高效且易于使用的基因表达方法 体内该方法可用于 在体 蛋白质生产、遗传编码指示剂的表达或功能研究。与其他方法相比，激光辅助慢病毒基因递送技术的效果与原核显微注射相当，但无需专业技术技能或昂贵的显微注射工作站。XYClone 激光设备体积小、便于携带，可轻松在多个实验室之间共享使用。
激光辅助的慢病毒基因递送具有稳定性，而非像受精卵的电穿孔或光穿孔那样为瞬时性。对于递送CRISPR-Cas9组分或重组酶而言，瞬时基因递送更具优势，因为持续表达可能导致异常后果。在本实验方案中，可使用整合酶缺陷型慢病毒（IDLVs）实现小鼠受精卵的瞬时.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究得到了美国国立卫生研究院（NIH）国家环境卫生科学研究所（NIEHS）院内研究计划的支持。我们感谢Robert Petrovich博士和Jason Williams博士对稿件的审阅和宝贵建议。我们还要感谢并致谢Bernd Gloss博士、基因敲除核心实验室、流式细胞术实验室、荧光显微镜与成像中心以及NIEHS比较医学部门各设施在技术方面提供的支持。我们感谢NIEHS比较医学部门的David Goulding先生和成像中心的Lois Wyrick女士为我们提供照片和插图。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| CD510B-1 质粒 | System Biosciences | CD510B-1 | 用于包装表达 EF1a-copGFP 的慢病毒 |
| 二甲基聚硅氧烷 | Sigma | DMPS5X | 胚胎培养 |
| 透明质酸酶 | Sigma | H3506 | 用于去除卵丘细胞 |
| XYClone 激光系统 | Hamilton Thorne Biosciences | 对小鼠受精卵进行穿孔 | |
| 非手术胚胎移植装置（NSET） | ParaTechs | 60010 | 胚胎的 NSET 移植 |
| KSEM 培养基 | Millipore | MR-020P-5F | 胚胎培养 |
| KSEM 培养基成分： | mg/100mL | ||
| NaCl | 555 | ||
| KCl | 18.5 | ||
| KH2PO4 | 4.75 | ||
| MgSO4 7H2O | 4.95 | ||
| CaCl2 2H2O | 25 | ||
| NaHCO3 | 210 | ||
| 葡萄糖 | 3.6 | ||
| 丙酮酸钠 | 2.2 | ||
| DL-乳酸钠盐 | 0.174mL | ||
| 10 mM EDTA | 100µL | ||
| 链霉素 | 5 | ||
| 青霉素 | 6.3 | ||
| 0.5% 酚红 | 0.1mL | ||
| L-谷氨酰胺 | 14.6 | ||
| MEM 必需氨基酸 | 1mL | ||
| MEM 非必需氨基酸 | 0.5mL | ||
| BSA | 100 | ||
| M2 培养基 | Millipore | MR-015-D | 胚胎培养 |
| M2 培养基成分： | mg/100mL | ||
| 氯化钙 | 25.1 | ||
| 硫酸镁（无水） | 16.5 | ||
| 氯化钾 | 35.6 | ||
| 磷酸二氢钾 | 16.2 | ||
| 碳酸氢钠 | 35 | ||
| 氯化钠 | 553.2 | ||
| 牛血清白蛋白组分 | 400 | ||
| D-葡萄糖 | 100 | ||
| Na-HEPES | 54.3 | ||
| 酚红 | 1.1 | ||
| 丙酮酸 | 3.6 | ||
| DL-乳酸 | 295 |
参考文献
- Sakuma, T., Barry, M. A., Ikeda, Y. Lentiviral vectors: basic to translational. Biochemical Journal. 443 (3), 603-618 (2012).
- Salmon, P., Trono, D. Production and titration of lentiviral vectors. Current Protocols in Human Genetics. , Chapter 12 Unit 12 10 (2007).
- Lois, C., ....
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重印与许可
