本文介绍一种利用红外温度计精确测量被动性全身过敏反应（PSA）和食物过敏小鼠模型体温差异的新方法。该方法已在先前的PSA实验结果中被准确重复。
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本文内容
摘要
摘要
小鼠体温测量对于研究过敏反应和过敏性症状至关重要。直肠探针测温法较为常见，且已被证实在此方面准确可靠、极具价值。然而，该方法需对小鼠实施麻醉，以避免插入探针时造成动物损伤。这限制了在测量体温的同时观察小鼠其他表型的能力。因此，在需要同步研究其他表型的实验中，直肠探针法并不理想，亟需另一种替代方法。本文介绍一种非侵入性体温测量方法，该方法无需对小鼠进行麻醉，同时在体温测量的可靠性方面与直肠探针法相当。我们采用一种红外测温仪，可检测距离为2至150毫米范围内的体表温度。该体温测量方法在小鼠被动全身过敏反应实验中，成功可靠地再现了体温变化趋势。我们发现，体表温度比直肠探针测量值约低2.0 °C，但体温下降的程度变化趋势一致。此外，我们还应用相同技术在食物过敏模型中同步观察小鼠的体温和活动水平。
引言
测量体温一直是监测动物模型中过敏性症状影响的基本手段1,2。传统上，小鼠的体温变化通过直肠探针温度计进行测量3,4。利用这些测量方法，研究人员能够可靠地描绘出不同变量之间的体温差异；然而，该方法耗时较长，且会对小鼠造成应激，从而导致核心体温升高。直肠探查还可能引起黏膜撕裂和感染3。此外，为了人道地插入直肠探针以测量体温，小鼠需要接受麻醉3。这一过程缓慢，且限制了在短时间内连续测量体温的可行性。同时，在麻醉完全消退之前，无法观察小鼠的活动表型，而麻醉恢复本身也是一个耗时的过程。近年来，其他可靠的体温测量方法采用了皮下植入的被动红外应答器标签或包含温度传感器的无线电发射器3,5,6。尽管部分研究人员认为这些方法是理想的操作方式，但由于初始成本较高，以及因在皮下或其他部位手术植入温度传感器而对小鼠造成的应激，这些方法尚未被广泛使用。
为了证明温度差异能够准确反映疾病模型中的症状1，2，在进行温度测量时，小鼠必须处于清醒状态，并能够在测量前后立即恢复其正常的表型活动。为此，我们寻求了一种能够实现这一目标的方法。
我们的目标是准确且低成本地测量小鼠体温，无需麻醉，也不限制其活动，从而能够在体温测量期间及之后观察其行为表型。为实现这一目标，显然需要一种比标准直肠温度探针侵入性更小的技术。红外体温计已在临床医学中使用数十年，尤其在儿科领域，可获得准确的体温读数。该方法已成为一种替代手段，使临床医生能够快速、准确地对活动频繁的婴儿和烦躁儿童进行体温测量。我们将这一技术应用于小鼠，成功建立了一种无需麻醉即可获取体温的测量方法。重要的是，我们证明该方法能够重现已确立的被动性全身过敏反应中关于体温变化的结果，同时可在测量过程中持续观察小鼠的活动情况。此外，我们采用相同方法评估食物过敏小鼠的体温，并同步考察其他症状，以证明体温确实能准确反映小鼠的活动水平和整体表型。
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方案
所有动物实验均经拉霍亚过敏与免疫学研究所动物护理和使用委员会批准。
1. 麻醉期间小鼠体温测量
- 将小鼠放入麻醉诱导箱中，使用1 L/min的氧气流速和5%异氟烷进行麻醉。
注意：当小鼠停止自主运动并保持静止超过30秒时，表明已达到麻醉状态。或者，可通过监测呼吸频率来判断：当小鼠每2秒或更长时间呼吸一次时，确认已麻醉。 - 用食指和拇指捏住小鼠颈背部皮肤，用小指夹住尾巴，以暴露下腹部区域。
- 手持小鼠使其身体与地面平行，同时将红外温度计传感器置于下腹部下方。
注意：温度计的外部平面（非传感器表面）应距离腹部表面约2–5 mm。此操作可模拟小鼠未麻醉状态下的测温结果（见第2节描述）。确定腹部目标测量位置非常重要，瞄准上方两个乳头之间的区域可获得一致的结果。 - 按住触发按钮测量温度，确保小鼠和温度计均保持稳定不动。
2. 无需麻醉的小鼠体温测量
- 用手指捏住小鼠尾巴的中段。
- 暴露小鼠的腹部。
- 让小鼠用前肢抓住一个直边表面，例如打开的笼子边缘或笼盖边缘。
注：这可以使小鼠伸展上半身，从而暴露腹部。 - 或者，让小鼠用前肢抓住体温计的上部直边，并使其坐在体温计的外侧平面上，腹部正好位于红外传感器上方。
注：任何时候当后肢接触体温计表面时，应确保脚部不会遮挡传感器与腹部之间的接触。若脚部遮挡传感器，测得的温度将低于实际腹部温度。
- 让小鼠用前肢抓住一个直边表面，例如打开的笼子边缘或笼盖边缘。
- 按住触发按钮以测量体温。
注：小鼠容易移动；建议在小鼠相对静止时测量体温，以确保每次测量身体同一部位，提高一致性。
3. 被动全身性过敏反应7
- 第0天：用免疫球蛋白E（IgE）致敏。
- 在PBS中配制抗二硝基苯（DNP）IgE溶液，浓度为100 µg/mL，每只小鼠准备200 µL。
- 每只小鼠腹腔注射200 µL在步骤3.1.1中配制的抗二硝基苯（DNP）IgE，或仅注射PBS（仅PBS组作为阴性对照）。使用26 G针头进行注射，注射部位位于腹中线外侧，大约在最下方两对乳头之间。
- 第1天：用DNP-HSA诱导过敏性休克。
- 在0.9% NaCl溶液中配制DNP-HSA溶液，浓度为10 mg/mL，每只小鼠准备100 µL。
- 按照步骤1.1所述方法对小鼠进行麻醉。
- 使用步骤1中描述的技术测量小鼠体温。
- 通过静脉注射100 µL在步骤3.2.1中配制的DNP-HSA。使用30 G针头，经眼后静脉窦注射。将针头从眼睛内侧以浅角度刺入，方向朝向眼球后方。
- 注射后，将小鼠分别放入单独的笼子中，确保其从麻醉状态恢复，观察其苏醒并能够自主活动。
- 使用红外体温计每10分钟测量一次体温，并观察其活动情况，持续70分钟。
4. 食物过敏小鼠模型8,9
注意：示意图见图2。
- 第0天：用OVA/氢氧化铝佐剂对小鼠进行致敏。
- 在PBS中配制OVA（0.5 mg/mL）和氢氧化铝佐剂（10 mg/mL）的混合液，每只小鼠准备100 µL。低速涡旋振荡30分钟。
- 按照步骤1.1所述方法对小鼠进行麻醉。
- 使用26 G针头，对每只小鼠腹腔注射100 µL步骤4.1.1中配制的OVA/氢氧化铝混合液。
注意：每次注射前应再次短暂涡旋振荡OVA/氢氧化铝混合液，以确保混合均匀。有关注射部位的详细信息，请参见步骤3.1.3。 - 注射后，将小鼠放回原笼中。确保小鼠从麻醉中恢复，观察其苏醒并能自主活动。
- 第14天：用OVA/氢氧化铝进行第二次致敏。
- 重复步骤4.1.1、4.1.2和4.1.3。
- 第28–46天：每隔一天用OVA对小鼠进行一次激发。
- 在PBS中配制OVA溶液，浓度为250 mg/mL，每只小鼠准备100 µL。
注意：该混合液应通过手动轻轻来回摇动配制，避免使用涡旋振荡器，以减少气泡产生。- 若使用食物过敏抑制剂，需配制抑制剂9。在PBS中配制抑制剂溶液，浓度为1 mg/mL，每只小鼠准备100 µL。这样可使每只小鼠接受100 µg的抑制剂。
注意：每只小鼠使用的抑制剂体积不得超过100 µL，因为小鼠在单次激发日仅能耐受200 µL的总灌胃体积。由于OVA激发本身需要100 µL，因此建议抑制剂使用的最大体积为100 µL。
- 若使用食物过敏抑制剂，需配制抑制剂9。在PBS中配制抑制剂溶液，浓度为1 mg/mL，每只小鼠准备100 µL。这样可使每只小鼠接受100 µg的抑制剂。
- 按照步骤1.1所述方法对小鼠进行麻醉。
- 对每只小鼠进行口服灌胃，给予100 µL步骤4.3.1中配制的OVA溶液（每只小鼠灌胃含25 mg OVA的100 µL PBS溶液）。
- 若使用抑制剂，应在OVA激发前30分钟，采用后续步骤中描述的相同技术，对步骤4.3.1.1中配制的抑制剂（或PBS对照）进行灌胃。30分钟后，进入下一步。
- 使用连接1 mL注射器的灌胃针，吸取100 µL OVA溶液。
- 将针头插入小鼠口腔，然后将针头朝向咽喉左侧或右侧，轻柔地沿食管推进。注入100 µL OVA。
注意：为确保针头未进入气管，注射前应观察小鼠是否正常呼吸。若针头误入气管而非食管，插入时会较早遇到阻力。
- 将小鼠放入各自的笼中。为便于观察粪便性状，使用无垫料的笼子。
- 确保小鼠从麻醉中恢复，观察其苏醒并能自主活动。
- 使用第2节中描述的方法，在激发后10、20、40和60分钟时间点测量小鼠体温。
- 在PBS中配制OVA溶液，浓度为250 mg/mL，每只小鼠准备100 µL。
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结果
被动性全身过敏反应：进行静脉注射时，对10周龄雌性BALB/c小鼠实施麻醉。在注射前，我们按照步骤1所述方法测量其体温（视频1）。图1展示了两组小鼠在静脉注射后的体温变化趋势。IgE致敏小鼠在20分钟时体温最大下降3.0 °C，而PBS对照组小鼠在20分钟时最大下降1.1 °C7。此外，在整个过程中，根据每只小鼠的活动能力评估其活动评分。首先在不施加刺激的情况下观察小鼠行为，随后通过将评估者的手伸入笼中并轻触小鼠以施加刺激后进行观察。根据其反应，将小鼠的活动状态按1至3分进行评分：评分为1表示无论是否受到刺激，小鼠均无活动或仅有轻微活动；评分为2表示未受刺激时无活动，受刺激后可活动，但不出现快速躲避动作；评分为3表示未受刺激时可活动或无活动，但在受刺激后能够活动并出现快速躲避动作。视频2和3提供了两组小鼠的示例，展示了体温测量方法以及相应的活动水平评估过程。使用红外...
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讨论
本方案旨在建立一种无需使用麻醉剂即可测量体温的方法。尽管获取温度读数相对简便，但该技术仍存在若干注意事项，除操作应激和不同环境温度等较明显的影响因素外，还需加以考虑。
首先，为了在整个实验过程中保持温度读数的一致性，必须利用解剖学标志预先确定测温部位，且研究人员需能够重复对该身体部位进行测量。通过将小鼠的前肢固定在平直的表面上（例如鼠笼边缘或体温计边缘），可使腹部充分暴露于体温计的红外传感器下。通常情况下，腹部表面积较大，有利于获得稳定一致的测量结果。此外，小鼠腹部的毛发较其背部稀疏，因此更有利于获得准确的体温读数。
其次，在测量体温时必须始终注意小鼠的后肢。当体温计接近腹部时，小鼠往往会将后肢放在体温计上。如果足部或脚趾位于传感器感应范围之内，测得的温度可能低于腹部实际温度，如视频 4所示。应让小鼠的后肢分别置于传感器两侧，双脚跨过传感器，同时确保除腹部表面外，传感器周围不接触任何身体部位或其他物体。
第三，测量时小鼠的腹部表面不能潮湿...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
Kawakami 实验室的研究得到了美国国立卫生研究院（NIH）基金的支持：R01 AR064418-01A1、R01 HL124283-01、R21 AI 115534-01 和 R41AI124734-01。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 非接触式红外体温计 | SinoPie | DT-8861 | |
| 抗二硝基苯基（DNP）IgE | Sigma Aldrich | D8406-.2MG | |
| PrecisionGlide 30 G 针头 | BD | 305128 | |
| PrecisionGlide 26 G 针头 | BD | 305111 | |
| 1 mL 注射器 | BD | 309659 | |
| 二硝基苯基-人血清白蛋白 | Biosearch Technologies | D-5059-10 | |
| 鸡卵清白蛋白 | Sigma Aldrich | A5503-50G | |
| Imject Alum | ThermoFisher Scientific | 77161 | |
| 动物饲喂针头，一次性 | Fisher Scientific | 01-208-87 |
参考文献
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- Newsom, D. M., Bolgos, G. L., Colby, L., Nemzek, J. A. Comparison of body surface temperature measurement and conventional methods for measuring temperature in the mouse. Contemporary Topics in Laboratory Animal Science. 43 (5), 13-18 (2004).
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重印与许可
