高架十字迷宫实验结合视频追踪软件研究外源性生酮补充剂的抗焦虑作用

摘要

本文介绍了一种用于研究啮齿类动物模型焦虑水平变化的实验方案。高架十字迷宫（EPM）测试结合视频追踪软件，为记录各种潜在抗焦虑治疗在临床前实验室环境中的效果提供了一种可靠的方法。

摘要

本研究的总体目标是描述高架十字迷宫（EPM）实验结合视频追踪软件的方法学。该方法旨在记录各种潜在抗焦虑治疗对实验啮齿类动物模型的影响。EPM实验基于啮齿类动物偏好受保护、封闭且黑暗空间的天性，以及其对开阔空间和高度的非条件性恐惧，同时结合其探索新环境的强烈内在动机。EPM实验是一种广泛使用的行为学测试方法，用于研究已知影响行为的药物对啮齿类动物产生的抗焦虑或促焦虑反应。在EPM实验中，若观察到动物在闭臂停留时间比例减少、在开臂停留时间比例增加、进入闭臂次数减少、进入开臂次数增多，则可能反映其焦虑水平降低。本研究利用该方法检测外源性酮类补充剂对Sprague Dawley（SPD）大鼠焦虑相关行为的影响。在进行EPM实验前，将外源性酮类补充剂长期饲喂大鼠83天，或在短期内连续7天每日经口灌胃给予。实验结束时，由不知分组情况的观察者使用SMART视频追踪系统采集行为学数据。主要研究结果表明，EPM实验是一种有效检测酮类补充剂诱导抗焦虑效应的方法，可作为评估药物或代谢干预疗法引起焦虑行为变化的敏感指标。

引言

本文的目的是描述高架十字迷宫（EPM）测试与视频追踪软件结合使用的方法，以监测实验啮齿类动物模型中与焦虑相关行为的变化及新疗法的效果。EPM测试是一种相对简单的行为评估方法，最初开发用于量化药物处理后大鼠的焦虑行为水平和焦虑反应¹。事实上，已有研究表明，EPM测试是一种广泛应用且有效的行为检测方法，可用于研究啮齿类动物焦虑水平的变化^1,2。EPM测试在啮齿类动物（主要是大鼠和小鼠）中的适用性基于它们对封闭、黑暗空间的偏好（趋近行为）、对开阔空间/高度的无条件恐惧（回避行为），以及其探索新环境的强烈先天动机。因此，EPM测试是一种建立在趋近-回避冲突基础上的成熟方法学^2,3。

高架十字迷宫（EPM）是一种呈十字形的装置，由四个抬高的臂组成，该装置由Handley和Mithani⁴首次描述（图1），其中两个相对的臂是开放的，与周围环境相通（开放臂），而另外两个相对的臂则设有侧壁（闭合臂）。在给予处理后，若实验动物在开放臂上停留的时间较对照组（未处理动物）更长和/或进入开放臂的次数更多，则表明具有抗焦虑效应^2,3。研究表明，在EPM实验开始后的前5分钟内（即将大鼠放置于EPM四个臂交叉处后），回避反应最为显著⁵；因此，通常在EPM上记录给药后5分钟内的行为表现。此外，还可记录其他反映焦虑水平的指标，如探头次数、直立次数（啮齿类动物以后肢垂直站立）、排便颗粒数、总臂进入次数（自发运动活性）以及不同姿势（伸展或僵直）等²。因此，可通过整合多种行为参数，对与焦虑相关的行为进行全面评估。

为了提高实验结果的可靠性，通常联合使用两到三种行为学检测方法，例如明暗选择实验、社交互动实验和高架十字迷宫（EPM）实验，以评估不同动物模型的焦虑水平⁶。单独在啮齿类动物上进行的EPM实验也是研究不同药物抗焦虑或促焦虑作用的合适方法⁷。EPM实验不仅对苯二氮䓬类抗焦虑药（例如，地西泮）⁸敏感，而且对其他多种化合物也具有敏感性，包括氨基酸类、单胺类、肽类和核苷类物质（例如，N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）拮抗剂AP7、α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异噁唑丙酸（AMPA）拮抗剂CNQX、μ-阿片受体激动剂吗啡、NPY1拮抗剂BIBP3226、P物质、胃饥饿素、催产素、5-羟色胺受体激动剂和拮抗剂如8-OH-DPAT和WAY-100635，以及β1-肾上腺素能受体拮抗剂贝他洛尔）^9,10,11,12。因此，在啮齿类动物上进行的EPM实验是一种合适且敏感的方法，可用于研究不同干预措施对与抗焦虑作用相关的大脑区域（例如，杏仁核、海马和边缘系统区域）以及焦虑相关作用机制（例如，5-羟色胺能、GABA能和腺苷能系统）的影响²。这些EPM研究中测试的物质包括外源性酮类补充剂，其以细微方式改变脑内信号传导，可能需要敏感的方法来检测行为变化。

本文介绍了高架十字迷宫实验（EPM）与视频追踪软件结合使用的方法，该方法有助于消除实验偏差，并便于收集和分析针对新型抗焦虑治疗所引起的行为改变。

方案

动物处理和测量程序均按照南佛罗里达大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）指南（方案编号 #0006R）进行。所有努力均旨在减少所用动物的数量。

1. 准备工作

注意：该实验方案通常需要使用实验室培育的大鼠或小鼠进行高架十字迷宫（EPM）测试。然而，其他动物（如豚鼠）也已被用于EPM测试。¹³使用视频追踪时，需考虑迷宫中动物与迷宫背景颜色之间的色彩对比度。对于直接观察动物行为的研究人员而言，这种对比度的重要性较低 通过 视频。视频追踪软件的设置需要进行配置，以确保能够记录动物在黑色或白色迷宫背景上的黑色或白色体色。使用透明亚克力迷宫时可能出现配置问题，而使用哑光灰色迷宫则对两种毛色的啮齿类动物均较为理想。

1. 根据潜在的影响因素（如品系、性别、动情周期、年龄以及体重）选择用于实验的动物²。
2. 根据具体实验确定每组所需的动物数量。
   注意：组大小取决于测试处理预期产生的效应量。通常在实验开始前进行功效分析，以确定在给定动物对任何特定任务反应的变异性以及实验组/条件数量的情况下，所需包含的最少受试对象数量。
3. 仔细设计实验（将使用一系列不同的行为学测试，如旷场实验、高架十字迷宫实验、洞板实验和强迫游泳实验）。
   注意：在高架十字迷宫实验前立即让啮齿类动物预先暴露于新的测试环境（如旷场实验）可能会改变其在高架十字迷宫中的行为表现^1,2。
4. 在高架十字迷宫实验前以相同方式处理所有动物。
   注意：已有研究表明，不同的应激因素、药物应用（例如，注射）、运输应激和操作处理均可改变啮齿类动物在高架十字迷宫中的行为及行为反应¹⁶。因此，有必要使动物适应动物房环境（例如，运输后在高架十字迷宫实验前适应1–2周）、实验条件和处理程序（例如，灌胃）。此外，重要的是在测试前尤其是临近测试时，各动物及处理组之间的操作方式和先前应激经历应保持一致。
5. 对夜行性动物（如大鼠和小鼠）进行行为学研究时，应采用倒置光照周期，以便在动物处于黑暗活跃期时进行行为评估。
   注意：先前已证明不同饲养条件和光照周期/昼夜节律对行为的影响及其对高架十字迷宫实验结果的作用¹⁷，因为动物的激素水平受光照周期调节。
6. 实验过程中应由相同的实验人员操作，并要求他们避免使用气味强烈的香水或肥皂。
7. 要求实验人员在实验期间不要在动物附近交谈或在高架十字迷宫环境附近移动物体。
   注意：在采集行为学数据时，观察者应尽量减少动作并避免发出噪音，这一点至关重要。
8. 每次试验后彻底清洁整个高架十字迷宫，以消除先前动物留下的任何气味，防止其干扰后续测试动物的探索行为。
9. （推荐）在高架十字迷宫实验前数天对动物进行操作处理（轻轻抓住躯干并握住一分钟或两分钟），使其适应实验人员。
10. 将动物放置于高架十字迷宫时，确保以一致的方式操作所有动物，并将每只啮齿类动物以相同姿势置于相同位置（例如，置于中心区域，面朝远离实验者的开放臂）。

2. 外源性酮补充剂的应用

1. 在开始任何处理之前，测量动物的体质量，以确定处理的剂量计算（例如，经口胃内灌注）
2. 通过灌胃法给予水，使动物适应灌胃操作（适应期）5天，之后再进行酮类物质补充（标准啮齿类动物饲料/标准饮食 [SD] + 水灌胃）； 例如，每日2.5 g/kg体重的水）。排除任何无法适应经胃灌注法的动物。
3. 经过适应期后，分别以标准饮食（SD）对动物进行为期83天的慢性喂养和为期7天的亚慢性喂养，并每天经口灌胃给予水（例如，5 克/千克体重/天；对照组： n = 8），酮补充剂如酮酯（KE；1,3-丁二醇-乙酰乙酸二酯； 例如，5 g/kg 体重/天； n = 8），酮盐（KS；Na⁺/⁺β-羟丁酸盐矿物盐； 例如，5 g/kg 体重/天； n = 8），或中链甘油三酯（1:1 比例，KSMCT； n = 8)^18,19,20.
   注意：接受经口灌胃的动物在处理后1小时进行高架十字迷宫（EPM）测试。以标准啮齿类动物饲料喂养并灌胃给予水（不含酮类补充剂）的大鼠作为对照组。

3. 焦虑行为检测

1. 高架十字迷宫装置
   1. 在一项研究中应使用相同的装置以标准化结果。EPM 是一种呈十字形的装置，由四条臂组成（例如，臂部宽10 cm、长50 cm）：两个相对的臂开放，两个相对的闭合臂装有高（例如，30 cm）的墙壁。该装置被抬高至离地面一定高度（例如，55 厘米）².
      注意：最常用的参数是动物在开放臂中累积停留的时间和进入开放臂的次数；然而，也会测量动物在闭合臂和中心区域的停留时间、进入闭合臂和中心区域的次数，以及在各区域中移动的距离。
   2. 使用间接照明点亮高架十字迷宫（EPM）即，将光源朝向天花板，而不是直接照射高架十字迷宫装置），并确保四个臂的光照均匀（无阴影，参见 图2).
      注意：光照强度的变化会影响啮齿类动物在高架十字迷宫（EPM）中的行为表现。因此，连续实验中的动物及不同实验日之间需保持相似的照明条件。例如，房间内2,800流明）².
2. 视频追踪系统
   注意：使用带有计算机接口和视频摄像机的视频追踪系统进行数据采集，该系统可自动收集大鼠的行为学数据（图3）。对于视频追踪系统，可使用多种标准模拟相机或用户自定义的图像源（如红外相机、摄像机、符合WIA标准的USB相机、网络摄像头， 等等。) 可被使用。在分析录制的视频时，运动追踪软件支持所有常见的视频格式，例如 .avi、.vob、.wmv、.asf、.mov、.qt、.mpg、.mpeg、.mp4、.3gp 和 .mkv。如果视频无法正常播放，可能需要安装特定的编解码器；只要系统中安装了相应的编解码器，其他视频格式也可被支持。该运动追踪软件还可用于分析先前获取的视频，并处理来自不同来源的图像，例如 DVD/HD 录像机、数字视频文件（.avi、.divx、.mpeg） 等。）、网络摄像头、DV 摄像机以及 WIA 兼容成像设备。
   1. 系统设置
      1. 将运动追踪软件的安装密钥插入 USB 2.0 端口，并启动安装工具。
      2. 将相机固定在实验区域上方，并确保其在实验过程中保持静止不动。
      3. 使用说明书在运动追踪软件系统中设置一个新实验。选择 新 实验. 双击新实验应遵循的方案图标（图3, 补充文件 1).
      4. 输入详细信息以标记/描述实验 实验信息 对话。
      5. 指定要处理的视频序列的来源。
      6. 定义正确距离测量的转换规则。校准过程可使运动追踪软件获知实验区域的实际尺寸，从而获得准确的距离和速度数值。
      7. 确定工作区域中的感兴趣区域（区域）。
      8. 调整检测过程的参数。
         1. 为了使运动追踪软件精确定位图像中动物的位置，必须设置一些检测参数。
         2. 追踪过程需要通过精细调整整体亮度和对比度参数，获得清晰且对比度良好的图像 亮度 & 对比度 部分 检测设置 面板。可根据需要，针对整张图像或用户自定义区域调整这些设置。
      9. 将一只大鼠放入每个实验区域，以测试检测过程。
      10. 按压 开始测试 点击按钮以验证检测过程是否能正确识别受试者。通过屏幕上出现的圆点确认检测已激活。测试开始前必须完成校准过程。
      11. 当播放器中显示的唯一黑点为被追踪动物时，视为检测确认成功。红色追踪线需紧密跟随动物的所有位移。通过显示动物编号及基于位移对应坐标的白色标签，可进一步确认追踪是否准确。若未获得此类检测结果，应调整 阈值 和 侵蚀 优化检测与追踪过程的参数。
      12. 调节 阈值 和 侵蚀 参数以获得更清晰且无噪声的测试图像。
      13. 如果跟踪路径被正确检测到，请按 停止测试 按钮（图4）。如果这些调整将用于每个新的实验文件，请按下 保存为默认设置 按钮。按下 接受 单击按钮以保存新的检测设置。
      14. 设定试验的时间条件。
      15. 如果实验方案要求在将受试对象放入实验区域的同时开始轨迹采集过程，则可以设置随软件附带的远程控制单元，或使用无线鼠标。
          注意：此选项提供了远程控制启动和停止的可能性。
   2. 受试者在系统中的设置
      1. 管理实验对象数据库。要创建实验对象数据库，请输入 受试者数据库 通过按下管理器 受试者 按钮在 实验助手 巴
      2. 按压 + 单击按钮以向数据库添加新受试者。
      3. 在已选择单个受试者选项的情况下，输入该受试者的编码。
      4. 填写受试者的其余信息 受试者属性 部分
      5. 按压 创建 单击按钮以添加新受试者。
      6. 定义实验方案。使用 调度器 用于定义实验项目中计划执行的不同阶段、会话、试验和受试者。试验将自动选择为即将执行的“下一个试验”。该属性在试验名称左侧显示为一个绿色对勾。
   3. 同步记录与追踪的数据采集
      注意：当选择实时图像源时， 播放器 面板提供了一个嵌入式录制模块，可轻松捕获所选摄像头的视频。
      1. 准备用于数据采集的运动追踪软件（校准、区域定义、检测设置、时间设置、调度程序）。
      2. 打开 数据采集 面板
      3. 开始录制实验视频，此时不包含动物，通过按下 开始记录 软件中可用的按钮。
      4. 将动物放入实验区域。
      5. 通过按下按钮启动数据采集过程 开始 按钮 时间控制 面板。追踪过程将与记录过程同时进行。根据需要，要求实验人员手动记录行为学变量，例如直立、探头和跌落（图5).
      6. 在测试室内，由经过遮帘与EPM隔开的盲法观察者以及实验人员手动收集EPM数据。
      7. 等待追踪过程记录结束，或按下 停止 按钮 时间控制 面板
      8. 将动物移出实验区域。通过按下按钮停止视频录制过程 停止 运动追踪软件播放器上的按钮。
      9. 清洗并擦干实验区域，为下一只动物做准备。重复上述步骤。
   4. 数据分析
      1. 要访问 分析 工具，按下 分析 按钮在 实验助手 巴
      2. 要生成已完成试验的分析报告，请选择待分析的试验。配置并选择分析报告类型。设置需分析的时间区间。生成报告并进行审阅。将结果导出为电子表格或图像格式图6).
3. 用于焦虑水平测量的高架十字迷宫实验
   1. 在口服灌胃后，于低光照且安静的非应激条件下进行高架十字迷宫实验。
      注意：确保实验在较短的时间间隔内进行（例如，介于1200至1400之间，因为昼夜节律可能影响啮齿类动物在高架十字迷宫中的行为^15,17避免在实验过程中产生不必要的移动和噪音。
   2. 测试开始前，确保高架十字迷宫已清洁并晾干，且视频追踪系统已准备就绪可供使用。
   3. 将大鼠连同其饲养笼一起转移至实验室内，于实验开始前30分钟放置。
   4. 将一只大鼠置于高架十字迷宫四臂交叉处，使其朝向与实验者相对的开放臂。
   5. 运行视频追踪软件，同时人工记录动物行为，持续5分钟。
   6. 若动物从高架十字迷宫（EPM）掉落，应将其拾起并放回掉落的同一位置。该动物的行为学数据应从分析中剔除。
      注意：较大的噪音或突然的动作可能导致动物在开放臂上出现僵直/静止。若实验过程中出现较大噪音，应将当时正在接受实验的动物的行为学数据从分析中剔除。
   7. 5分钟测试结束后，停止视频追踪软件，将动物从高架十字迷宫中取出，并放回其所在的饲养笼中。
   8. 下次实验/动物使用前，用消毒清洁剂清洁高架十字迷宫（EPM）例如，四联杀菌剂）处理，随后用自来水冲洗。用纸巾将装置擦干。

4. 视频追踪系统采集数据的分析

1. 根据记录的数据，分析动物在开放臂和闭合臂中停留的时间、进入开放臂、闭合臂以及中心区域的次数、首次进入闭合臂的潜伏期，以及在开放臂、闭合臂和中心区域中移动的距离。
   注：当动物身体质量中心位于某一区域时，即视为处于该区域。
2. 采用方差分析（ANOVA）结合Fisher最小显著性差异（LSD）检验或Tukey多重比较检验，确定不同处理对行为的影响。

结果

本实验旨在验证外源性酮补充剂是否对两个月大雄性Sprague-Dawley（SPD）大鼠（250–350 g）具有抗焦虑作用，补充方式包括长期给药（持续喂养83天）或亚急性给药（口服灌胃7天）。长期给药组包括以下酮补充剂：低剂量酮酯（LKE；1,3-丁二醇-乙酰乙酸二酯，约10 g/kg/天，LKE）、高剂量酮酯（HKE；约25 g/kg/天，HKE）、β-羟基丁酸矿物盐（bHB-S；约25 g/kg/天，KS）以及bHB-S联合中链甘油三酯（MCT；约25 g/kg/天，KSMCT）。亚急性实验中采用以下处理组：KE、KS和KSMCT（5 g/kg/天）。对照组包括标准饲料组（SD）或标准饲料加水灌胃组（对照）。所有数据均以均值±均值标准误（SEM）表示。当p < 0.05时认为差异具有统计学意义，显著性通过单因素方差分析（one-way ANOVA）结合Fisher's LSD检验确定。

长期喂养后，KSMCT组大鼠在开放臂停留的时间显著长于对照组（p = 0.0094）。LKE、KS和KSMCT组在闭合臂停留的时间显著缩短（p = 0.0389、0.0077 和 0.0019， respectively），而KS组在中央区域停留的时间显著长于对照（SD）组（p = 0.0239）（图7A）¹⁸。

与对照组（SD）相比，KS组和KSMCT组大鼠在开放臂中行走的距离显著更长（p = 0.036 和 0.0165）；而LKE、KS和KSMCT组大鼠在闭合臂中行走的距离显著缩短（p = 0.0252、0.00041 和 0.0032）（图7B）。与对照组相比，KS组和KSMCT组在中心区域行走的距离更长（p = 0.0206 和 0.0482）；而在KSMCT组中，经长期喂养后首次进入闭合臂的潜伏期显著延长（p = 0.0038）¹⁸（图7C）。

经7天灌胃后，KE组在开放臂停留的时间更长（p = 0.0281），而KE、KS和KSMCT组在中心区域停留的时间均减少（分别为p = 0.0005、< 0.0001 和 = 0.023），与对照组相比（图8A）¹⁸。在KE和KS组中，进入闭合臂的次数在给药7天后显著降低（分别为p = 0.0436 和 0.0234）（图8B），而KS组大鼠进入中心区域的频率也低于对照（SD）组（p = 0.0193）。

图1：用于测试大鼠的高架十字迷宫（EPM）。 每个臂宽10 cm，长50 cm，其中相对的两个臂为开放臂，边缘略升高；另外两个相对的闭合臂配有高30 cm的侧壁。迷宫距离地面的高度为55 cm。 请点击此处查看该图的放大版本。

图2：直接照明与间接照明的示例。确保光源朝向天花板，同时遮挡实验区域上方的直射光。在高架十字迷宫（EPM）实验过程中，使用间接照明至关重要，以实现对四个臂均匀照明，避免产生阴影。请点击此处查看此图的放大版本。

图3：运动追踪软件的实验助手工具栏。 该工具栏旨在提供对主要操作的访问。按钮对应典型实验流程中的各项任务，仅当前允许执行的任务按钮处于激活状态。请点击此处查看该图的放大版本。

图4：受试动物的运动轨迹由一条红线标记，跟随动物的移动路径。 通过调整阈值，可降低背景干扰，直至仅动物本体被红线检测并追踪。该轨迹追踪的是受试动物质量中心的位置，并标示出当前坐标。 请点击此处查看此图的放大版本。

图5：Sprague Dawley (SPD) 大鼠位于开放臂中的高架十字迷宫（EPM）。 展示了一个实验装置的示例。 请点击此处查看此图的放大版本。

图6：实验期间动物累积运动轨迹。 作为数据分析的一部分，可显示受试对象在追踪区域中采集到的轨迹路径。请点击此处查看该图的放大版本。

图7：外源性酮补充剂长期喂养83天后SPD大鼠在高架十字迷宫（EPM）中的行为反应。 这些图示展示了通过EPM及运动追踪系统¹⁸收集的代表性结果。(A) KSMCT组在开放臂中停留的时间百分比更高，而LKE、KS和KSMCT组在闭合臂中停留的时间较对照组（SD）更少。(B) KS和KSMCT组在开放臂中移动的距离更长，而LKE、KS和KSMCT组在闭合臂中移动的距离较对照组（SD）更短，表明其焦虑水平低于对照组。(C) KSMCT组进入闭合臂的时间更晚，表明其焦虑水平低于对照组（SD）。缩写：SD = 标准啮齿类动物饲料 + 水（每日25 g/kg体重（b.w.）水）；LKE = SD + LKE（1,3-丁二醇-乙酰乙酸酯二酯，每日10 g/kg b.w.）；HKE = SD + HKE（每日25 g/kg b.w.）；KS = SD + β-羟基丁酸矿物盐（bHB-S；每日25 g/kg b.w.）；KSMCT = SD + bHB-S + 中链甘油三酯（MCT；每日25 g/kg b.w.）；SPD = Sprague-Dawley大鼠；EPM = 高架十字迷宫（* p < 0.05；** p < 0.01；*** p < 0.001；**** p < 0.0001）。该图已根据Ari et al.¹⁸修改。 请点击此处查看此图的放大版本。

图8：外源性酮补充物经口灌胃7天后SPD大鼠的行为反应。 代表性结果通过高架十字迷宫（EPM）实验并利用运动轨迹追踪软件系统获得¹⁸。(A) KE组在开放臂中停留的时间百分比更高，而KE、KS和KSMCT组在中心区域停留的时间较对照组（SD组）更少，表明焦虑水平降低。(B) 与对照组（SD组）相比，KE组和KS组大鼠进入封闭臂的次数减少。缩写：SD = 标准啮齿类动物饲料 + 水（5 g/kg 体重/天）；KE = SD + 酮酯（1,3-丁二醇-乙酰乙酸二酯，5 g/kg 体重/天）；KS = SD + β-羟基丁酸矿物盐（bHB-S；5 g/kg 体重/天）；KSMCT = SD + bHB-S + 中链甘油三酯（MCT）（5 g/kg 体重/天）；SPD = Sprague-Dawley大鼠；EPM = 高架十字迷宫（* p < 0.05；*** p < 0.001；**** p < 0.0001）。该图改编自Ari et al.¹⁸。请点击此处查看此图的放大版本。

讨论

通常，有几种常用的测试方法，例如明暗选择实验、社交互动实验和高架十字迷宫（EPM）实验，可用于评估不同动物模型的焦虑水平。然而，仅使用EPM实验即是一种合适的方法，可用于研究外源性酮类补充剂对啮齿类动物焦虑水平的影响^18,20。

EPM 方法的主要优势在于 它依赖于啮齿类动物对黑暗、封闭空间的本能偏好，以及对高处的非条件性恐惧和对开阔空间的回避。另一方面，其他用于研究类焦虑行为的方法则是基于动物对某些有害刺激的行为反应，例如电击、食物/饮水剥夺、巨大噪音以及暴露于捕食者气味。³。这些测试通常会引发条件化反应，而高架十字迷宫还是一种更为人道的替代方法。此外，高架十字迷宫可作为研究不同脑区参与功能的有用工具（例如，边缘区域，海马）及其潜在机制（例如，γ-氨基丁酸（GABA）、谷氨酸、5-羟色胺、腺苷）与焦虑行为的关系².

当施加对动物具有较大应激性的处理时（例如, 口服灌胃）时，所有动物应以相同方式由同一人操作，尤其是在评估潜在的微弱抗焦虑效应时。如果可能，可将药物/化合物加入饮水中给予 通过 一种可口的“零食”可能是更理想的方法。为确保每只动物接受相同剂量，可使用经口灌胃法。根据化合物的药代动力学特性，通常建议在灌胃后1小时内进行高架十字迷宫（EPM）测试。在选择实验动物时，应根据实验目的和受试物质，综合考虑其品系、性别、动情周期、年龄以及体重等因素。²关于年龄，在设计高架十字迷宫实验研究和解释数据时，需要考虑到进入开放臂的百分比随年龄呈线性增加²¹ 且EPM行为中与衰老相关的变化具有品系特异性²².

在进行高架十字迷宫实验时，可能会遇到一些需要解决的问题。有时由于动物表现出极端行为倾向，需将其排除在分析之外（例如，动物始终停留在被放置的区域，几乎从装置上跌落，或被装置外的噪音或事件所干扰）。EPM测试的其他复杂因素可能包括引起镇静或过度活跃的处理，因为这类效应也需要进行评估 通过 高架十字迷宫参数

仅应让动物接受一次高架十字迷宫（EPM）测试，因为在第二次（重复）暴露时，啮齿类动物在开放臂上的活动减少，且在中央平台停留的总时间较第一次暴露时缩短^14,15。因此，强烈建议对啮齿类动物仅进行一次EPM测试。然而，如果第一次与第二次EPM测试之间至少间隔三周，且EPM装置被移至另一个房间（不同环境），则可对动物进行多次EPM测试²。

高架十字迷宫可采用不同材质、尺寸（例如，适用于小鼠或大鼠）和颜色，选择实验动物时需考虑这些因素。需要注意的是，前一只动物在装置上留下的气味可能会影响后续动物的行为。因此，我们建议使用易于清洁的材料制成的高架十字迷宫，例如不透明的丙烯酸玻璃，这种材料在清洗后不会残留气味。应避免使用木质的高架十字迷宫。最好选用与在高架十字迷宫上测试的动物毛色不同的哑光颜色（例如，测试白色动物时选用黑色）。动物与装置之间的对比度越高，动物的识别效果越好，所获得结果的可靠性和精确性也越高（如移动距离、速度、轨迹追踪）。采用哑光灰色材料制成的高架十字迷宫适用于白色、黑色以及黑白相间的动物。

视频追踪系统的另一个优势是，除了高架十字迷宫实验（EPM）外，它还能灵活、简便地与多种行为学实验结合使用，例如水迷宫、旷场、加号/放射臂/T-Y迷宫、位置偏爱、强迫游泳和悬尾实验。

综上所述，本文旨在描述高架十字迷宫实验（EPM）与视频追踪软件结合使用的方法，以收集和分析针对新型抗焦虑治疗所引起的行为改变。EPM 的可能应用包括对新开发的药理学制剂进行预筛选，用于治疗与焦虑相关的疾病。除了抗焦虑和致焦虑物质外，还可研究不同激素和滥用药物的行为效应。此外，也可评估衰老及暴露于各种应激源的影响。本研究得出结论：在采取适当操作步骤的前提下，EPM 已被证实是一种敏感的方法，可用于评估与酮类补充相关的行为变化^18,20。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
小鼠和大鼠高架十字迷宫	Coulbourn Instruments	H10-35-EPM
SMART 视频追踪软件	Harvard Apparatus	SMART 3.0