本文介绍了一种通过逆转录病毒转导法生产小鼠CD19 CAR T细胞并进行临床前测试的实验方案，用于治疗经建立的同系A20 B细胞淋巴瘤模型，实验在BALB/c小鼠中进行，可选择是否进行淋巴细胞清除性预处理。
本文内容
摘要
摘要
CD19嵌合抗原受体（CAR）T细胞疗法在临床上取得了令人瞩目的成功，已促成两种第二代嵌合抗原受体（CAR）被批准用于治疗急性淋巴细胞白血病（ALL）和非霍奇金淋巴瘤（NHL）。目前该领域的研究重点是将此类成功推广至其他血液系统恶性肿瘤，因为在这些疾病中，完全缓解率尚不理想。通过进一步改造CAR T细胞，或联合使用其他治疗方式，可能成功克服在其他癌症治疗中面临的障碍。
因此，我们提出了一种模型，可供其他研究者开展CD19 CAR T细胞的临床前测试。这一经过充分验证的B细胞淋巴瘤模型所得结果，很可能对CAR T细胞治疗具有普遍的指导意义。
该方案通过使用MP71逆转录病毒载体和pCL-Eco包装质粒对Plat-E包装细胞进行磷酸钙转染，随后收集分泌的逆转录病毒颗粒，并利用重组人纤维连接蛋白片段和离心法进行转导，从而可重复地制备小鼠CAR T细胞。该方法可用于验证逆转录病毒的转导效率，并确认CAR T细胞杀伤靶向淋巴瘤细胞的能力。 离体通过流式细胞术、发光检测和酶联免疫吸附测定（ELISA）进行的方法也进行了描述。
CAR T细胞检测方案 体内 在携带已建立的系统性淋巴瘤的免疫健全和免疫耗竭同系小鼠中的实验方法被描述。抗癌活性通过监测 体内 生物发光与疾病进展。我们展示了利用1根除已建立的B细胞淋巴瘤的典型结果st 或 2nd 在使用表达IL-12的CAR T细胞治疗免疫系统完整的荷瘤小鼠时，仅少数小鼠在未进行淋巴清除预处理的情况下实现长期缓解。
这些方案可用于评估具有不同附加修饰的CD19 CAR T细胞、CAR T细胞与其他治疗剂的联合应用，或适用于针对不同靶抗原的CAR T细胞。
引言
嵌合抗原受体（CAR）T细胞疗法在治疗CD19+恶性肿瘤方面已显示出显著的临床疗效，由此在2017年批准了替沙仑勒细胞（tisagenlecleucel）用于复发性急性淋巴细胞白血病1，以及阿基仑赛细胞（axicabtagene ciloleucel）用于进展性大B细胞非霍奇金淋巴瘤2。
癌症与免疫系统之间的相互作用在疾病进展和治疗机制中的重要性正日益受到重视3,4,5。例如，已有充分文献记载，肿瘤微环境（TME）中存在大量可抑制免疫细胞效应功能的因子6,7,8。另一方面，内源性免疫细胞的异源活化以及表位扩散在肿瘤清除和长期抵抗肿瘤攻击中可能起关键作用9,10。这两种现象均无法在缺乏免疫系统的异种移植模型中进行评估。同样，使用转基因蛋白的系统也无法准确反映打破免疫耐受这一表位扩散所必需的挑战11,12。因此，具有完整功能性免疫系统的同源性模型对于模拟癌症疾病进展和免疫治疗中的这些重要方面至关重要。
CAR T细胞治疗的一个重要局限性在于，治疗成功需要进行淋巴细胞清除性预处理13,14。在临床患者中，这通常通过在输注CAR T细胞前给予化疗来实现15,16。作为一种标准方法，为了模拟患者治疗中所采用的淋巴细胞清除，我们在给予治疗性CAR T细胞之前，对荷有系统性A20 B细胞淋巴瘤的小鼠实施5 Gy全身照射（TBI），以实现淋巴细胞清除。
尽管淋巴细胞清除预处理对大多数患者并非问题，但化疗药物带来的毒性使得体能状态较差的患者无法接受CAR T细胞治疗。为了建立一个代表不适合进行淋巴细胞清除患者的测试系统，我们构建了一个淋巴细胞充足的同系小鼠模型，用于模拟淋巴瘤的CAR T细胞治疗。在该模型中，我们证明了CAR T细胞内分泌IL-12可导致已建立的淋巴瘤被清除，成功率约为25%17。此外，我们还发现内源性免疫细胞参与了肿瘤的清除过程。
本文详细描述了小鼠CAR T细胞的制备方案，同系小鼠淋巴瘤模型的建立，以及使用CAR T细胞（联合或不联合淋巴清除性预处理）治疗淋巴瘤的方法。该方案可用于CAR T细胞与其他药物的联合研究、携带其他转基因的CAR T细胞的功能测试，或用于评估其他过继性细胞治疗及免疫治疗策略在淋巴瘤中的应用。
方案
所有动物实验均在《1986年动物（科学程序）法》以及英国癌症研究协调委员会指南的监管下进行。所有动物研究均在英国癌症研究中心曼彻斯特研究所开展，并经当地动物福利与伦理审查机构（CRUK-MI AWERB）批准。
1. 准备工作
- 大量制备pMP71逆转录病毒构建质粒和pCL-Eco逆转录病毒包装质粒18。
注意：pMP71编码mCherry和由FMDV2A序列分隔的CAR。该质粒可与其他逆转录病毒构建体互换。pCL-Eco编码gag、pol以及嗜鼠性包膜蛋白。 - 使用RPMI 1640培养基、10% FCS、1% 100x青霉素-链霉素-谷氨酰胺（PSG）配制完全T细胞培养基（TCM），用于培养小鼠T细胞。
注意：该溶液含有100 IU/mL青霉素、100 µg/mL链霉素、2 mM L-谷氨酰胺、50 μM β-巯基乙醇以及25 mM 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）。 - 在37 °C、5% CO2条件下，使用RPMI 1640、10% FCS和0.05 mM β-巯基乙醇培养A20细胞。
- 在37 °C、5% CO2条件下，使用完全杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）（含10%胎牛血清（FCS）、2 mM L-谷氨酰胺、1 μg/mL嘌呤霉素和10 μg/mL杀稻瘟菌素的DMEM）培养Platinum-E（Plat-E）细胞。
注意：Plat-E细胞源自293T细胞，表达gag、pol以及嗜鼠性包膜逆转录病毒蛋白。 - 转染前立即配制转染用培养基溶液1和溶液2。配制溶液1（pH 7.9），含DMEM + 10% FCS + 25 mM HEPES；配制溶液2（pH 7.1），含DMEM + 25 mM HEPES。
- 用无菌磷酸盐缓冲液（PBS）稀释，配制10 μg/mL重组人纤连蛋白片段溶液，并于-20 °C保存至使用。
- 所有培养基在使用前经0.2 μm滤器无菌过滤（重组人纤连蛋白片段除外）。
2. T细胞的逆转录病毒转导
- 第1天：转染前准备
- 接种 7.5 × 106 15 厘米的 Platinum-E（Plat-E）细胞2 在18 mL完全DMEM中培养组织培养皿，于37 °C、5% CO₂条件下过夜培养2.
- 第2天：Plat-E逆转录病毒包装细胞系的转染
- 准备 20.4 μg pcl-Eco 包装载体 DNA、39.6 μg 编码逆转录病毒 CAR 结构的质粒 DNA 以及 150 μL 1 M CaCl2 至终体积为每15 cm培养皿3 mL转染溶液22 将待转染的培养皿置于漩涡振荡器上，振荡10秒，静置5分钟。
- 从15 cm培养皿中移除DMEM培养基2 培养皿中更换为 12 mL 转染溶液 1。
警告 更换培养基时，15 cm2 培养皿中心可能变干，这会导致转染的Plat-E细胞大量死亡。操作应迅速，每次仅从1-2个培养皿中移除培养基。 - 加入含有 DNA 和 CaCl₂ 的 3 mL 转染溶液 22 每15厘米2 将液体逐滴均匀加入每块培养板中。轻轻左右摇动培养板10秒。于37 °C、5% CO₂条件下孵育2 过夜。
- 第3天：制备用于转导的含病毒上清液
- 将转染的Plate-E细胞的培养基更换为18 mL完全TCM，放回培养箱中。
警告 更换培养基时，15 cm2 培养皿中心可能变干，这会导致转染的Plat-E细胞大量死亡。操作应迅速，每次仅从1-2个培养皿中移除培养基。
- 将转染的Plate-E细胞的培养基更换为18 mL完全TCM，放回培养箱中。
- 第3天：分离与 体外 小鼠脾脏T细胞的活化
- 按照 Parkinson 之前所述的方法，取出 6 至 8 周龄 BALB/c 小鼠的脾脏 等19 并将它们浸入盛有无菌、预冷PBS的50 mL锥形管中。
- 使用镊子将脾脏转移至1.5 mL微量离心管中，并用研杵以最小力度进行匀浆。
- 使用1000 μL移液器，加入约800 μL PBS，将匀浆液转移至固定在含有5 mL PBS的50 mL离心管上的100 μm孔径细胞筛，以获得单细胞悬液。对其他脾脏重复步骤2.4.2。每管不得超过3个脾脏。
警告 滤器过滤后的脾细胞若静置可能发生结块。处理多个脾脏时，应间歇性手动轻柔旋转离心管，以避免细胞聚集。细胞筛网上残留的组织碎片可用5 mL注射器的推杆施加最小力度进一步研磨。 - 用 PBS 定容至 20 mL。将 20 mL 细胞悬液轻轻铺加到 20 mL 密度梯度介质上材料表在50 mL离心管中。将所得的叠加悬液在800 × g下离心20分钟，不启用刹车。
- 使用无菌巴斯德吸管收集界面层细胞，转移至50 mL离心管中。用PBS补至50 mL，800 × g离心10分钟以洗涤。弃去上清液，将细胞重悬于完全TCM培养基中。
- 使用血细胞计数板对细胞数量进行计数。
- 以 5 x 10 的密度培养细胞6 细胞/mL，加入完全TCM培养基，含30 ng/mL抗-CD3ε抗体（克隆145-2C11）、30 ng/mL抗-CD28抗体（克隆37.51）、100 U/mL重组人IL-2和2 ng/mL重组小鼠IL-7。根据收获的细胞体积，使用适当大小的组织培养瓶。
注意： 抗原-抗原提呈细胞对于通过CD3和CD28抗体激活T细胞是必需的；若使用纯化的T细胞，则必须用抗体包被培养板，或使用磁珠。材料表) - 将小鼠脾细胞在37 °C、5% CO₂条件下孵育2 过夜。
- 第3天：转导用培养板的制备
- 用 2 mL 浓度为 10 μg/mL 的重组人纤连蛋白片段包被非组织培养用 6 孔板，4 °C 过夜孵育。
- 第4天：小鼠T细胞的转导
- 将重组人纤连蛋白片段从包被板转移至新的非组织培养6孔板中。于4 °C孵育过夜，进行第二轮转导。
- 向原始重组人纤连蛋白片段包被的孔板的每个孔中加入 2 mL TCM，在室温下孵育 30 分钟，以阻断非特异性结合。
- 从转染的Plat-E细胞的15 cm组织培养皿中收集含逆转录病毒的上清液，并加入18 mL完全TCM替代。
警告 迅速操作，避免Plat-E细胞干燥。
注意： 如果使用荧光标记基因（如 mCherry），可在该阶段通过荧光显微镜检测转染效果图1). - 通过0.45 μm滤器过滤含逆转录病毒的上清液，以去除细胞碎片。吸除已包被重组人纤连蛋白片段的6孔板中的TCM，每孔加入2.5 mL过滤后的含逆转录病毒上清液（对照孔加入完全TCM作为假转染对照）。标记每孔所加入的病毒或假转染培养基类型。
- 将培养板在室温下以1200 × g离心30分钟。
- 在平板旋转的同时，收集活化的T细胞，并使用血细胞计数板进行计数。
- 转导使用 5 x 106 每孔加入总共 5 mL 激活的脾细胞。通过在 500 × g 离心 5 分钟，将用于模拟处理/转导的所需数量的脾细胞分别沉淀至不同的离心管中。
- 以 5 × 10⁶ 个细胞/mL 的密度重悬脾细胞6 每2.5 mL来自步骤2.6.4的含过滤逆转录病毒上清液的细胞数 TCM 作为阴性对照。加入重组人 IL-2（hIL-2）和重组小鼠 IL-7（mIL-7），终浓度分别为 200 IU/mL 和 4 ng/mL。
- 在完成步骤2.6.5后，从离心机中取出6孔板，每孔加入2.5 mL重悬的脾细胞，使每孔终体积为5 mL，终浓度为100 U/mL hIL-2和2 ng/mL mIL-7。
- 将培养板在室温下以 1200 x g 离心 90 分钟。离心后，将培养板在 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育2 过夜。
- 第5天：第二轮转导
- 从培养板中收集重组人纤连蛋白片段，因其可重复使用。重复步骤 2.6.2 - 2.6.5。
- 在平板旋转的同时，从1中收集细胞st 使用巴斯德移液管进行一轮转导。每孔用 2 mL PBS 清洗，轻轻晃动并收集每孔中残留的细胞。
注意： 用移液器反复吹打以重悬已沉淀的细胞。将各对照组/转导组分别收集于不同的离心管中。 - 以500 × g离心5分钟。每孔用2.5 mL转导培养基重悬细胞，其中含200 IU/mL IL-2和4 ng/mL IL-7。重复步骤2.6.7至2.6.8。
- 从离心机中取出细胞，在37 °C、5% CO₂条件下孵育2 孵育4小时。按照步骤2.7.2-2.7.3收集转导细胞。
- 计数细胞，以500 × g离心5分钟，然后重悬于完全TCM中，细胞密度为1 × 106 细胞/mL，加入100 U/mL hIL-2和2 ng/mL mIL-7。转移至适当大小的培养瓶中，于37 °C、5% CO₂条件下培养2.
- 每2天加入含有100 U/mL hIL-2和2 ng/mL mIL-7的新鲜TCM培养基，维持细胞密度为1 × 10⁶ cells/mL6 cells/mL
注意： 收获的脾细胞包含多种细胞类型。在这些培养条件下，非T细胞会在2-3天内逐渐死亡。细胞培养约4天后，T细胞的数量通常与第0天收获的脾细胞总数相当。
3. 转导效率的测定
- 转导后第4天，收集转导或未转导的T细胞样本（约3 × 105 个细胞）。将细胞悬液在500 × g下离心5分钟，弃去上清液，用PBS洗涤沉淀细胞一次，再次离心。
- 弃去上清液，每孔加入含适当胺反应性染料（例如，活/死染料，1:100稀释）的PBS 100 μL。室温避光孵育15分钟。
- 用PBS洗涤两次，500 × g离心5分钟。弃去上清液，加入含抗小鼠CD16/CD32抗体（用于Fc受体阻断，1:100稀释）的FACS缓冲液50 μL，4 °C孵育10分钟。
- 直接加入含抗小鼠CD4-BV786和CD8-BV711抗体的抗体染色主混合液50 μL（最终浓度为每孔1 μL，溶于FACS缓冲液中）。4 °C避光孵育30分钟。重复步骤3.3。将细胞重悬于1%多聚甲醛（PFA）缓冲液中，4 °C避光保存，直至进行流式细胞术分析。
- 使用适当的流式细胞仪进行分析，以BV711、BV785和mCherry荧光信号分别作为CD4和CD8亚群及CAR表达的标记物，并参照（图2）设定门控策略。
4. 体外 CAR T细胞活性的验证
- 种子同系靶向 CD19+ 表达或不表达荧光素酶的肿瘤细胞，密度为 1 x 104 100 μL TCM/孔，置于96孔U型底组织培养板中
- 加入 1 x 104 每孔加入体积为100 μL的CD19 CAR T细胞，使效应细胞与靶细胞（E:T）比例达到1:1。
注意： 应针对每种CAR结构和靶细胞系确定E:T比例。 - 单独使用T细胞和肿瘤细胞作为干扰素γ（IFNγ）释放的阴性对照，使用佛波酯-豆蔻酸-乙酸盐（PMA）（50 ng/mL）和离子霉素（ionomycin）（1 μg/mL）刺激的T细胞作为阳性对照。将共培养细胞置于37 °C、5% CO₂条件下培养。2 16-24 小时。
- 共培养后，将培养板在500 × g下离心5分钟，收集上清液用于进一步的IFNγ和IL-12p70 ELISA分析。
注意： 可保存于 -80 °C。 - 将细胞沉淀重悬于 100 μL 含有荧光素（终浓度为 1.5 mg/mL）的 PBS 中。37 °C 孵育 10 分钟，然后使用合适的发光检测仪测定各孔的发光强度。
注意： 曝光时间必须根据细胞系和细胞密度进行优化。代表性结果如下所示 图3a. 离体 通过将CAR T细胞与表达靶抗原的细胞系共培养，可使其产生细胞毒性并表达荧光素酶。当CAR T细胞杀伤靶细胞时，荧光素被释放，因此发光信号的降低与细胞杀伤程度呈正相关。非转导的细胞在长时间孵育过程中常会对靶细胞的存活率产生影响。根据试剂盒制造商提供的ELISA操作说明，检测上清液中鼠源IFNγ和IL-12p70的浓度。代表性结果如图（所示图3b 和 3c). 离体 通过将表达靶抗原的细胞系与CAR T细胞共培养，可利用ELISA检测上清液成分以评估CAR T细胞的激活情况。CAR T细胞与靶细胞的比例及共培养时间需针对每种CAR结构、靶细胞系和待测分析物进行优化。PMA与离子霉素处理可作为阳性对照，用于确认T细胞的质量及其应答能力。
5. 在小鼠中评估抗癌活性
- 方案1
- 对6至8周龄BALB/c小鼠进行100 mg/kg剂量的环磷酰胺静脉注射。该处理可在不引起显著淋巴细胞耗竭的情况下促进肿瘤移植存活。17 (图4).
注意： 建立A20淋巴瘤模型可能需要超过2个月的时间，且成瘤率不理想。通过在接种淋巴瘤细胞前1天使用环磷酰胺，可提高成瘤效率。为了研究淋巴细胞充足的模型小鼠，我们确定了一个环磷酰胺剂量，该剂量可提高淋巴瘤成瘤效率，同时不引起淋巴细胞耗竭。 - 第二天，注射 100 µL 的 5 x 105 通过静脉注射将表达荧光素酶和绿色荧光蛋白（GFP）的同源A20 B细胞淋巴瘤细胞注入小鼠体内。
- 让小鼠全身性淋巴瘤发展约17天。
- 通过腹腔内（IP）注射 100 μL 浓度为 30 mg/mL 的荧光素并利用成像系统检测，确认系统性淋巴瘤的存在 在体内 生物发光成像系统
- 使用分隔器以避免信号溢出至相邻小鼠。将小鼠腹侧朝上暴露1分钟，且每次照射区域大小保持恒定。
- 以每秒光子数（p/s）显示相对光单位（RLU）。每种肿瘤模型均需优化设置；曝光条件应能检测到早期肿瘤信号，同时避免肿瘤达到终点时信号饱和。
- 使用大小恒定的兴趣区域记录每只小鼠的总RLU。图5a 和 b).
- 注射单剂量 1 x 106 通过静脉注射将CAR T细胞注入已建立淋巴瘤的淋巴细胞充足的鼠体内。
注意：（重要） 必须为每种CAR构建体建立给药剂量，采用剂量递增方案，以确保能够表征并应对由CAR T细胞可能引发的任何毒性。尽管抗小鼠CD19 CAR T细胞未表现出毒性，但CAR T细胞仍可能产生意外的毒性反应。当不同CAR构建体之间的转导效率不完全相同时，应通过向细胞制剂中添加未转导的T细胞，使所给予的T细胞总数保持一致。 - 每周通过腹腔注射 100 μL 浓度为 30 mg/mL 的荧光素，并利用成像系统监测疾病进展 体内 生物发光成像系统（图5c).
- 密切监测小鼠的毒性迹象，一旦出现早期后肢瘫痪（HLP）或病理性肿瘤负荷等表现，应在小鼠产生痛苦前实施安乐死。
注意： A20淋巴瘤可能引发毒性反应，包括肿瘤侵犯脑膜导致的后肢瘫痪。需定期检查步态异常等早期症状。同样，可能形成较大的腹腔内肿瘤，引起动物行为改变等不适表现。 - 监测小鼠存活情况，持续60至100天（图5d实验结束后，采用第一类安乐死方法实施安乐死。
- 对6至8周龄BALB/c小鼠进行100 mg/kg剂量的环磷酰胺静脉注射。该处理可在不引起显著淋巴细胞耗竭的情况下促进肿瘤移植存活。17 (图4).
- 方案2
- 通过尾静脉注射，以每只小鼠100 μL PBS溶液给予6至8周龄BALB/c小鼠200 mg/kg环磷酰胺。
- 第二天，注射 5 x 105 表达荧光素酶和GFP的同系A20 B细胞淋巴瘤细胞，溶于100 μL PBS中 通过 尾静脉注射
- 让小鼠发展为全身性淋巴瘤，约需 7–14 天
- 通过腹腔注射 100 μL 浓度为 30 mg/mL 的荧光素，随后进行成像以确认全身性淋巴瘤 体内 生物发光成像系统
- 以 0.02 Gy/min 的剂量率进行 5 Gy 全身照射（TBI）以实现淋巴清除。
注意： 接受CAR T细胞治疗的患者在输注CAR T细胞前需接受多种方案以实现淋巴细胞清除，这可显著提高过继转移的CAR T细胞的植入率。在小鼠中可通过全身照射（TBI）来模拟这一过程。图6). - 第二天，注射 1 x 106 PBS 中的 CAR T 细胞（100 μL） 通过 对已形成肿瘤的小鼠进行尾静脉注射。
- 采集血液样本 通过 7天后尾静脉采血。
- 向每份血液样本中加入红细胞裂解缓冲液，然后按照第3节所述方法进行流式细胞术前处理。通过流式细胞术分析循环中CAR T细胞的存续情况图2).
注意： 在进行流式细胞术之前立即加入计数微球，可确定每毫升血液中CAR T细胞的数量。 - 按照步骤 5.1.5 - 5.1.8 所述监测疾病进展图7).
结果
为高效转导T细胞，必须获取新鲜的逆转录病毒颗粒。将pCL-Eco包装质粒和pMP71逆转录病毒质粒共转染Plat-E细胞系，可使细胞上清液中分泌出逆转录病毒颗粒。当逆转录病毒中编码荧光标记基因（如mCherry）时，可通过荧光显微镜观察以确认转染是否成功图1）。转染的 Plat-E 细胞产生的含病毒上清液用于转导 T 细胞 通过 在纤维连接蛋白片段包被的培养板上进行两轮离心感染。转导效率可在转导后第4天测定 通过 流式细胞术。成功转导的细胞会表达逆转录病毒中编码的标记基因（图2). 第一代受体的转导效率约为 50 - 90%，而接近逆转录病毒包装能力上限的 CAR 结构转导效率约为 10 - 40%。尽管标记基因的表达表明逆转录病毒转导成功，但至关重要的是需验证 CAR T 细胞在识别表面表达靶抗原的细胞后是否具备功能活性。可通过基因工程改造表达荧光素酶的靶细胞系，利用荧光素酶检测法直接评估 CAR T 细胞的杀伤效果图3A). 通过ELISA检测CAR T细胞与靶细胞共培养后效应细胞因子的释放，也可作为CAR T细胞毒性的间接评估指标。图 3B 和 3C).
本方案制备的CAR T细胞可在淋巴细胞充足的荷瘤小鼠模型中进行评估：于静脉注射5 × 10⁶个A20淋巴瘤细胞前1天，给予100 mg/kg环磷酰胺（静脉注射）以建立系统性A20淋巴瘤模型5 A20 细胞（图4）。通过IP注射荧光素并利用 体内 生物发光成像仪可用于通过在整个实验过程中保持恒定的感兴趣区域（ROI）和曝光时间来监测肿瘤负荷图 5A-C）。经改造可表达IL-12的CAR T细胞能够在接受淋巴细胞清除性预处理后根除系统性淋巴瘤，使约25%的小鼠获得无病生存（图 5D）。通过在静脉输注CAR T细胞前1天实施5 Gy全身照射（TBI）进行淋巴清除性预处理，可显著提高植入率（图6在此模型中，第一代CAR T细胞能够根除系统性A20淋巴瘤，通常可使100%的小鼠达到无病生存状态（图7).
图1. Plat E细胞转染成功的验证。 使用逆转录病毒CAR构建体及pMP71和pcl-Eco包装载体质粒DNA转染Plat-E细胞。转染成功通过mCherry荧光标记基因的表达来确认。A) 明场显微镜图像，B) 荧光显微镜图像，以及C) 合并图像。放大倍数 = 50X。请点击此处查看此图的高清版本。
图2. 通过流式细胞术测定转导效率。 使用流式细胞术在转导后第4天测定小鼠T细胞的转导效率，分别使用Zombie UV活/死染料、mCherry、BV711和BV785检测活细胞、CAR结构、CD4和CD8细胞。图中展示了A) 未转导组、B) mCherry.αmCD19.mCD3z组和C) mCherry.αmCD19.mCD3z.mIL12组的代表性结果，门控顺序为：1) 单细胞；2) 活细胞；3) CD4和CD8细胞；4) 和5) 对表达CAR的mCherry阳性细胞进行分析。请点击此处查看该图的放大版本。
图 3. CAR T 细胞活性的验证。 将表达 αmCD19 的 CAR T 细胞与经改造表达荧光素酶的 A20 淋巴瘤细胞在 U 型底 96 孔板中以 1 × 104:1 × 104 的比例共培养 16 小时。共培养后，离心收集细胞沉淀，并获取上清液。A) 将细胞重悬于 PBS 中，采用发光检测法评估靶细胞的存活率。共培养上清液用于检测 IFNγ（B）和 IL-12（C）的含量。CAR T 细胞与靶细胞的比例以及共培养时间需根据每种 CAR 构建体和靶细胞系进行优化。可使用 PMA 与离子霉素处理作为阳性对照，以确认 T 细胞的质量及其响应能力。误差线表示标准差（SD）。统计分析采用单因素方差分析（one-way ANOVA）。*** p < 0.001。该图改编自文献17。请点击此处查看该图的放大版本。
图4. 在无需淋巴清除的情况下建立A20淋巴瘤模型。 环磷酰胺可提高淋巴瘤诱导效率，同时不引起淋巴细胞耗竭。 A) 6-8周龄BALB/c小鼠经静脉注射100 mg/kg环磷酰胺后的血常规计数。误差线表示标准差 B) 6-8周龄BALB/c小鼠在第-1天静脉注射100 mg/kg环磷酰胺或生理盐水后的淋巴瘤负荷，以及静脉注射5 x 105 第0天使用光度计测量A20细胞。 C) 小鼠存活率 B)误差线表示标准差（SD）。采用双因素方差分析（2-way ANOVA）进行统计学分析。** p < 0.01, *** p < 0.001）。该图已根据 Kueberuwa 修改 等17. 请点击此处以查看此图的放大版本。
图5. 监测淋巴瘤负荷与生存情况。 表达荧光素酶的A20淋巴瘤小鼠接受 100 µL 腹腔内（IP）注射 30 mg/mL 荧光素，并使用成像系统进行成像 体内 生物发光成像系统 A) 小鼠腹侧暴露1分钟，随后立即翻转以成像背侧，从而获取身体两侧的肿瘤组织 （B）. C) 接受不同剂量αmCD19 CAR T细胞但未进行淋巴细胞清除的BALB/c小鼠中淋巴瘤负荷的代表性结果。误差线表示标准误。 D) 相同小鼠的存活率。该图已根据 Kueberuwa 修改 等17. 请点击此处以查看该图的放大版本。
图6. 淋巴清除的作用。A) 接受5 Gy全身照射（TBI）的6-8周龄BALB/c小鼠的血细胞计数，照射剂量率为0.02 Gy/min；误差线表示标准差（SD）。采用双向ANOVA进行统计分析。* p < 0.05，** p < 0.01，*** p < 0.001。B) 给药后第7天，通过流式细胞术检测小鼠外周血中携带mCherry标记基因的CD4+和CD8+ CAR T细胞。误差线表示标准差（SD）。本图经Kueberuwa et al.17修改。 请点击此处查看此图的放大版本。
图7. 淋巴清除预处理条件下的CAR T细胞活性 显示在CAR T细胞给药前一天接受5 Gy全身照射（TBI）的典型结果。 A) 成像与 (B) 小鼠成像后的图形显示 100 µL 腹腔（IP）注射 30 mg/mL 荧光素酶底物，使用一种 体内 生物发光成像系统。误差线表示标准误。 C) 相同小鼠的生存情况。该图已根据 Kueberuwa 修改。 等17. 请点击此处以查看此图的放大版本。
讨论
同源小鼠模型可在保持免疫系统完整的同时，用于研究疾病进展和治疗方法。这对于与免疫系统相互作用的疗法，尤其是免疫治疗药物而言至关重要。
本文所述方案包含两个关键的工作流程，第一个是通过基因改造小鼠T细胞使其表达嵌合抗原受体（CAR）。从启动到验证转导效果，该过程需要7天。与此同时，需在小鼠体内建立系统性淋巴瘤模型。如果CAR T细胞的制备失败或质量不达标，通常没有足够时间在小鼠因淋巴瘤死亡前重新制备替代细胞。因此，研究人员在使用这些模型时，必须准确进行肿瘤接种剂量和疾病进展的研究，以确保CAR T细胞的制备能够与治疗给药的时间成功匹配。
导致T细胞转导效率低下的常见原因包括生产细胞的转染效率不佳，通常由质粒纯度不足或转染培养基pH值测定不准确所致。建议在进行完整实验方案前先检测生产细胞的转染效率，因为转染效率低下将限制T细胞的转导效率。重组人纤维连接蛋白片段可收集并保存于-20 °C以供重复使用，但多次冻融会导致转导效率下降。小鼠脾脏在取材后也需迅速处理，这对于获得高产量的活T细胞至关重要。
需要注意的是，本实验方案中使用的为表达荧光素酶的A20细胞。这种选择具有优势，因为它能够通过生物发光成像来量化全身肿瘤负荷。然而，在具有正常免疫系统的情况下，机体对荧光素酶的免疫反应可能影响实验结果。我们此前已对存活小鼠针对标记性转基因的免疫反应进行了检测17。关键在于，应使用不含转基因的A20细胞重复关键实验，以验证这些转基因在免疫细胞介导的肿瘤清除过程中未发挥显著作用。
尽管临床制剂只能在免疫缺陷小鼠体内用于in vivo实验，但使用小鼠来源的CAR T细胞攻击小鼠癌细胞，可使我们评估免疫系统在治疗效果或疾病进展中的作用。本方案可用于靶向B细胞淋巴瘤的CAR的临床前评估，或经额外修饰（例如如本文所述可分泌IL-12）的其他CAR的评估。需要注意的是，虽然同源小鼠模型可用于评估免疫细胞间的相互作用，但其可能无法准确模拟人类体内in vivo的相互作用。尤其值得注意的是，人源与小鼠CAR在结构上存在差异，可能带来下游效应；T细胞最佳活化与培养条件在两者间有所不同20，靶抗原在组织中的表达分布可能在人与小鼠之间存在差异，且所经历的毒性反应可能截然不同。因此，必须结合ex vivo和异种移植模型来验证实验结果。
总之，同基因型淋巴耗竭的 淋巴瘤的淋巴细胞充足模型重现 有无接受过化疗/放疗的患者。这提供了一个可模拟临床环境的模型系统，用于测试多种治疗策略，以应对即将涌现的新一代免疫治疗药物。
通过使用预处理，可以观察到所有小鼠通常都能清除淋巴瘤。这与人类中高达90%的完全缓解率相符，具有代表性。然而，CD19 CAR T细胞治疗面临的挑战将集中在预防临床上常见的高频率复发，这些复发通常为CD19阴性。在此模型中，通常在100天甚至更长时间内均未观察到复发。对模型进行改造以模拟临床中观察到的复发情况，将有助于应对未来CD19 CAR T细胞治疗所面临的挑战。
披露
David Gilham 就职于 Celyad，该公司参与 CAR T 细胞的生产。其余作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们感谢Bloodwise对本研究的资助（资助编号13031），以及英国癌症研究基金会曼彻斯特生物资源中心、成像与流式细胞术和分子生物学核心设施对本工作的支持。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.2 µm 注射器滤器 | 阿普尔顿伍兹 | FC121 | |
| 0.45 µm 注射器滤器 | 阿普尔顿树林 | FC122 | |
| 1.5 ml 研钵和微量离心管 | VWR | 431-0098 | |
| 100倍青霉素-链霉素-谷氨酰胺（PSG） | Gibco | 10378016 | |
| 2-巯基乙醇（50 mM） | Gibco | 31350-010 | |
| 盐酸杀稻瘟菌素S | Sigma- Aldrich | 15205 | |
| 瓶顶滤器（0.2 µm) | 科学实验室用品 | FIL8192 | |
| Brilliant Violet 711 抗小鼠 CD8a 抗体 | BioLegend | 100759 | 1:100 染色稀释比例。克隆号 53-6.7 |
| Brilliant Violet 785 抗小鼠 CD4 抗体 | BioLegend | 100552 | 1:100 染色稀释比例。克隆株 RM4-5 |
| 二水合氯化钙 | Sigma- Aldrich | C7902 | |
| 细胞计数微球 – CountBright 绝对计数微球 | 分子探针 | C36950 | |
| 细胞滤网 100μm | VWR | 734-0004 | |
| 环磷酰胺一水合物 | 默克 | 239785-1GM | |
| 杜尔贝科’高糖改良伊格尔培养基（DMEM） | Sigma Aldrich | D6546 | |
| Dynabeads | Gibco | 11131D | |
| Ficoll Paque Plus | GE Healthcare | GE17-1440-03 | 由Sigma-Aldrich销售 |
| 流式细胞仪 - LSR Fortessa x20 | BD 生物科学 | 658222R1 | |
| 胎牛血清 | Gibco | 10270 | |
| 血细胞计数板 | 阿普尔顿伍兹 | HC001 | |
| HEPES 溶液 | Sigma- Aldrich | H0887 | |
| 小鼠IL-12 p70未包被ELISA试剂盒 | Invitrogen | 88-7121-76 | |
| IL2，Proleukin | 诺华 | PL 00101/0936 | |
| 体内 生物发光成像系统 – 活体成像系统Xtreme II | 布鲁克 | T149094 | |
| 离子霉素钙盐 | Sigma- Aldrich | I0634 | |
| 活/死染色 - Zombie Violet 可固定活力检测试剂盒 | BioLegend | 423114 | 1:100 染色稀释度 |
| 光度计 - Lumistart Omega | BMG Labtech | 415-301 | |
| 小鼠 IFN-γ ELISA试剂盒 | Diaclone | 861.050.010 | |
| 多聚甲醛 | Sigma- Aldrich | 16005 | |
| pCL-Eco | Novus Biologicals | NBP229540 | |
| 佛波醇-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯（PMA） | Sigma- Aldrich | <强>P8139 | |
| Platinum E 细胞系 | Cell Biolabs | RV-101 | (RRID:CVCL_B488) |
| 纯化的NA/LE仓鼠抗小鼠CD28 | BD 生物科学 | 553294 | 克隆 37.51 |
| 纯化的NA/LE仓鼠抗小鼠CD3ε | BD 生物科学 | 553057 | 克隆 145-2C11 |
| 纯化大鼠抗小鼠 CD16/CD32（小鼠 BD Fc 封闭抗体） | BD 生物科学 | 553142 | 1:100 染色稀释比例。克隆 2.4G2 |
| 嘌呤霉素二盐酸盐 | Sigma- Aldrich | P8833 | |
| 重组人纤连蛋白片段 - RetroNectin 试剂 | TaKaRa | T100B | |
| 重组小鼠 IL-7（无载体） | BioLegend | 577806 | |
| 红细胞裂解缓冲液 | eBioscience | 004-4333-57 | |
| RPMI 1640培养基 | Lonza | BE12-167F | |
| 胰蛋白酶-EDTA 溶液 | Sigma- Aldrich | T3924 | |
| XenoLight D-荧光素 | Perkin Elmer | 122799 |
参考文献
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