Method Article

字符串装配 grna 克隆 (stacr) 的可自定义协议

DOI:

10.3791/58556

⸱

December 26th, 2018

 ,  ,  ,  ,  , 
1MCN Junior Research Group, Munich Center for Neurosciences, Ludwig Maximilian Universitat, BioMedical Center, 2Institute of Stem Cell Research, Helmholtz Zentrum, German Research Center for Environmental Health, 3Institute of Developmental Genetics, Helmholtz Zentrum, German Research Center for Environmental Health, 4Physiological Genomics, Ludwig Maximilian Universitat, BioMedical Center

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

在这里, 我们提出了字符串组装 grna 克隆 (stagar), 一种方法, 可以很容易地将 grna 载体的 crispr/cas9 方法。st简便, star 使 grna 多路复用变得简单、高效且可定制。

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

细菌 crispr/cas9 系统大大增加了生命科学家的方法选择。由于其利用, 基因和基因组工程开始适用于大量的系统。此外, 许多转录和表观基因组工程方法现在一般是第一次可行。crispr 具有广泛适用性的一个原因在于它的双边性质。小的 grna 决定了复合物的基因组靶点、蛋白质 cas9 的变种以及局部分子的后果。然而, 许多 crispr 方法依赖于同时将多个 grna 传递到单个细胞中。在这里, 我们提出了一个可自定义的协议字符串组装 grna 克隆 (stasar), 这种方法允许在一个克隆步骤中简单、快速和高效地生成多路复用 grna 表达载体。stegr 具有成本效益, 因为 (在本协议中) 单个靶向序列是通过短悬垂引物引入的, 而 grna 表达盒的长 dna 模板可以重复使用多次。此外, st款允许单步合并大量的 grna, 以及不同 grna 变异、载体和启动子的组合。

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

字符串组合 grna 克隆 (stasar) 是一种方法, 能够在一个克隆步骤中有效地在一夜生成包含多个 grna 表达盒的表达载体。stasar 协议不依赖于专业知识或材料, 并提供多种定制选项。

细菌 crispr 蛋白 cas9 具有独特的能力。它能够找到并选择性地结合那些 dna 序列编码在自然发生的 crrna 或工程 grna1。它作为分子工具的利用使大量的方法成为不可能的、不可行的或仅限于某些细胞模型, 直到最近。其中包括靶向基因突变2、基因组工程3、表观基因组编辑4、5、6、转录激活和基因沉默7, 8.据我们所知, crispr 是普遍可部署的, 因为它的应用报告存在于广泛的目标地点、细胞类型和物种中。然而, crispr 的许多应用直接或间接地取决于多个 grna 的交付, 包括一系列基因组操作 (转移 9,10, 中11和大规模基因组改变12,13), 基因组工程 (使用 cas9 镍 14,生成条件等位基因 11,15或序列突变 16)和跟踪策略17。此外, 对于其他方法 (转录工程18, 表观基因组工程 19,20), 多个靶向点并不是严格意义上的强制性, 但它们往往只有在这一情况下才能达到最大效果条件。

一些有用的方法已经被描述产生 grna 载体包含一个以上的 grna 表达盒21,22,23, 24,25,26, 27岁在这里, 我们提出了一个协议 stasar, 字符串组装 grna 克隆, 这是突出的组合简单和速度 (只需要一个隔夜克隆步骤), 低成本 (因为 dna 模板可以重复使用多次), 可定制性 (不同的 grna 系统和启动子) 和有效性 (它允许产生含有大量 grna 盒的载体)28。

stagr 原则上可以用来生成表达向量, 其中包括少量 (1-2 grna)、几个 (3-5 grna) 和一些迄今报告的最多的表达式盒式磁带 (6-8 grna)28。同样, star 适用于任何 grna 序列、主干或启动子。然而, 由于 stogr 主要基于聚合酶链反应 (pcr) 和 gibson 组装, 因此应使用另一种方法生成序列相似度较高的 grna。

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. stegr 克隆策略的设计

  1. 决定一个表达载体中将包含多少 grna 盒, 以及在哪个表达载体中包含。确定每个 grna 应使用哪些启动子和 grna 支架。使用任何在线工具 (例如, www.benchling.com) 设计 grna。

2. 具有悬垂的 star 克隆引物的设计

注: 用于扩增病媒主干的 pcr 引物中分别添加了最后一个 grna 的检测原点序列和第一个 grna 的反义序列 (图 1)。剩余的序列从字符串中被放大, 从而按所需的顺序附加意义和反义 grna。第一个串块被放大与一个前引物包含第一个 grna n20 序列作为一个悬垂和反向引物与第二个 grna n20 序列 (反向补体) 作为悬垂。以下所有部分都相应地生成。

  1. 将 n20 grna 序列添加到 stangr dna 串的正向扩增引物中作为悬垂 (表 1)。将感觉 grna 序列 5 ' 添加到正向引物 "sf-fp" (对于传统的脚手架) 或 "sam-fp" (对于包含脚手架的 ms2)。fp 引物退火到各自 stagr 字符串的脚手架/ms2 部分 (图 1)。
  2. 将反向补体 n20 grna 序列添加到反向引物序列中。根据所使用的特定启动子和字符串 (hu6-rp、mu6-rp、7sk-rp、hU6) 选择 rp 引物。

3. Fragments 克隆片段的产生

  1. 要为 gibson 组装生成单个克隆片段, 请通过设置10μl 的高保真 (hf) 缓冲液、10mm dntp 的1μl、0.25μl 的过挂引物 (100μm)、dna 模板 (字符串或载体) 的10nng、0.5μl hf 聚合酶来执行 pcr, 1.5 微米的二甲基亚硫酸盐 (dmso), 并添加h2o,使最终体积为50μl。
    注: 使用质粒 "stagr _ neo" 作为主干 pcr 的模板, 将 grna 支架合并到最后的 grna, 如果选择 sam 支架, 请使用 "stagr _ sam"。例如, 对于具有 6个 grna 盒的 st点r 质粒, 需要 6个 pcr, 5个以 dna 字符串为模板, 1个以矢量主干为模板。
  2. 使用以下条件在热环器上培养反应: 1 循环 98°c, 1分30秒;38个98°c 周期为 10秒, 59°c (适用于 grna 支架)/68°c (适用于 sam 环路) 为 10秒, 72°c 循环为 30秒 (对于插入)/1分钟 30 s (向量);1循环 72°c, 10分钟。
  3. 从 pcr 反应中取出 5.5μl, 添加加载染料, 并在1% 琼脂糖凝胶上分析扩增片段。加载适当的 dna 阶梯进行施胶 (100 bp dna ladder kb dna 阶梯), 并在 120 v 的情况下在适当的凝胶运行缓冲液 (例如, tle 缓冲液) 中运行凝胶30分钟。
  4. 在凝胶运行时, 在剩余的 44μl pcr 反应中加入5μl 的缓冲液和 0.5μl dpni (10个单位), 并在37°c 下孵育30分钟至1小时。
  5. 使用磁珠进行 dna 纯化。
    1. 每 1μl pcr 产品加入1.8 μl 磁珠, 通过上下移液混合。在室温下 (rt) 下孵化2分钟。
    2. 用磁铁将珠子和 dna 片段与残留液体分开。用70% 乙醇清洗两次珠子, 方法是在不完全重新悬浮的情况下冲洗颗粒。
    3. 用移液器取出所有乙醇, 使颗粒空气干燥。
    4. 通过上下移液, 将颗粒溶解在 15-20μlh2o中, 并使用磁铁将珠子与液体分离。将清除的上清液转移到新的管中。
      注: 或者, 可以使用基于列的反应清理包。
  6. 使用分光光度计确定 dna 浓度, 如其他地方所述 29。

4. 吉布森组装反应与细菌转化

注: 以下步骤改编自 gibson等人.30岁.

  1. 准备自制的吉布森反应组合或使用商业吉布森克隆套件。
    1. 将 1 m tris (三甲基) 氨基甲烷)-hcl 在 ph 值 7.5, 300μl 1 m mgcl 时, 60μl 100 mm dgtp (脱氧鸟苷三磷酸酯), 60μl 100 mL dGTP (脱氧腺苷三磷酸), 60μl 100 mttp (脱氧肽三磷酸), 60μl 100 mm dctp (三磷酸二氧胞苷), 300μl 1 m dtt (二硫醇), 1.5 g pg-8000 (聚乙二醇), 300μl 100 mm nad (烟豆酰胺腺嘌呤二核苷酸), 并加入h2o, 以获得 6 ml 的5等温反应缓冲液。
      注: 倾斜缓冲液可在-20°c 下存储至少12个月。
    2. 对于 gibson 组件主混合, 将320μl 的5x 等温反应缓冲液与697μl 的 h2o 结合起来, 并加入3μl 的 10μμl t5 外切酶、20μl 的 2uμl dna 聚合酶和160μl 的 40μμl-l 40 ue-l taq dna 连接酶.
      注: 此混合物可在-20°c 下进行, 并在-20°c 下储存至少12个月。
  2. 使用7.5 微米的装配主混料, 插入和矢量为2.5μl。对于 2x star 反应, 使用摩尔载体插入的 dna 比例为 1:1, 但总共不超过 0.2 pmol。对于超过 2个 grna 表达盒, 使用矢量插入比例为 1:3, 但不超过 dna 总含量 0.5 pmol。
    注: 所有放大的 grna 表达盒应在等量中使用。包括一个质粒控制与相同数量的矢量, 但没有插入控制未消化的模板矢量 (和/或自结扎)。
  3. 在50°c 下将样品培养45至 60分钟, 将样品存放在冰上或-20°c, 以便随后进行转化。
    注: 协议可以在此处暂停。
  4. 直接将一半的混合物转化为化学上有能力的细菌。
    1. 在冰上解冻具有化学能力的 top10大肠杆菌。
    2. 将5μl 的吉布森混合物添加到50μl 的合格细菌中。轻轻混合, 通过闪烁的管的底部。在冰上孵化30分钟。
    3. 将管道放置在42°c 的水浴或热块中 45秒, 从而进行热冲击。
    4. 把管子放回冰上。在细菌中加入 250μl soc 培养基, 让细菌在37°c 时在晃动的孵化器中恢复30-45分钟。
  5. 回收后, 将转化后的细菌放入含有氨匹西林 (100μg/ml) 的1.5% 溶酶汤 (lb) 琼脂板上, 并在37°c 下孵育过夜。

5. 细菌性群体 pcr 选择 stacr 克隆

  1. 为每个结构准备至少两套 200μl pcr 反应管 (3 至 24), 标记相同。
  2. 用含有100μg/ml 氨匹西林的 100μl lb 介质填充一组。
  3. 使用无菌移液器尖端划掉一个细菌菌落的生物材料, 并将其传播到空的 100μl pcr 反应管的底部。立即将尖端转移到含有 lb 介质的第二个相应的反应管上。
  4. 轻轻旋转尖端, 以确保部分细菌转移到 lb 介质, 并在37°c 孵育, 供以后使用。
  5. 建立 pcr 主混合物 (每个反应 10μl)。
    1. 对于10种反应, 将 10μl taq 缓冲液、2μl 10 mm dntp、0.5μl 底漆 (100μm)、0.5μl taq 聚合酶组合在一起, 并将 h2o 添加到100μl 的体积中.
    2. 使用以下引物: StAgR_seq_fwd2: actggatcggtacg, stagr _ seq _ rev:tatggttggccttg。
  6. 在没有 lb 介质的标记 pcr 反应管中加入10μl 的 pcr 主混合物。
  7. 使用以下条件在热环器上进行反应: 1 循环 94°c 5分钟, 38个94°c 周期 30秒, 55°c 30秒, 72°c 2分钟;1循环 72°c, 10分钟。
    注: 伸长时间 (72°c 步) 应增加 grna 表达盒的数量。使用表2计算刀片的理论尺寸, 并在72°c 时使用每 1 kb 1分钟。
  8. 加入加载染料, 并在1% 琼脂糖凝胶上分析扩增片段。加载适当的 dna 阶梯进行施胶 (1kb dna 梯子), 并在 120 v 处运行适当的凝胶运行缓冲液 (例如tle 缓冲区) 30分钟。
  9. 利用表2的帮助, 通过将使用过的启动子、grna 支架和 n20 序列的各个大小相加, 计算放大器的理论尺寸。根据菌落 pcr 的结果, 根据正确的带大小和细菌克隆是否有可能存在正确的载体来识别细菌克隆。
  10. 接种2.5 毫升隔夜 lb 培养 (含100μgml 氨匹西林) 与相应的100μl 培养, 更早建立。在37°c 下孵化12小时。
  11. 使用商业质粒迷你试剂盒和制造商的说明提取质粒 dna 31。
  12. 使用以下引物对质粒进行排序: StAgR_seq_fwd1 (gagtggggggggggggtacg)、StAgR_seq_fwd2 (actggatcggtacer) 和 stagr _ seq _ rev (ttaggtgtggccttg)。

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

遵循现有协议, 使得定制多路复用 grna 载体的生成成为可能 (图 1)。图 2显示了使用六个不同 grna 盒式磁带的 st点r 方法的代表性结果。图 2a显示了用于获取 stasr 部件的 pcr 的典型结果 (协议 3.1-3.3)。六个振幅 (bb, s1-s5) 表示线性 dna 片段, 其中包含各个 grna n20 序列的末端。质粒主干 (bb) 现在使用 gRNA1 和 gRNA1 的目标序列进行扩展, 因此对 gibson 组装的另外两个 pcr (s1 和 s5) 具有所需的重叠 (图 2a,表 3)。纯化后, 可实现至少1μg 的载体和插入物 dna 收率。

吉布森组装后, 细菌转化应该会产生100到700个细菌菌落。图 2b显示了通过菌落 pcr 对10个细菌菌落进行代表性分析, 遵循 STAgR 协议, 其中包含 6个 grna 盒。凝胶电泳表明, 三个克隆显示了完整组装的预期放大器大小 (表 2)。其他克隆可能接受 STAgR 载体, 其中包含1至 5个 grna 盒, 而一个克隆 (图 2b, 第18号) 为空。

figure-results-1
图 1: ststarr 底漆设计概述.首先选择 grna 数和支架, 然后选择 grna 的顺序和启动子, 最后选择哪种类型的载体。对于每个 grna, 设计了一个特定的正向引物, 其中包含意义上的 grna 靶向序列, 以及 "scf-fp" 或 "sam-fp" 的公共部分。同样, 为了生成单独的反向底漆, 相应的启动子序列 (rp) 与下一个 grna 的 n20 序列的反向补体融合在一起。请点击这里查看此图的较大版本.

figure-results-2
图 2: 使用6种不同的 grna 盒式磁带的 st点r 方法的代表性结果.(a) 五个插入物和矢量 styr _ tomato 的 pcr 的代表性示例。(b) 利用 hu6 和 mu6 启动子和规范 grna 以及 sam 支架对 6x star 反应进行群体 pcr 处理。对22个细菌菌落进行了分析, 其中7个菌落显示了预期的带, 表明了完整的组装。梯子: 1 kb +, 基本对中的数字 (bp)。请点击这里查看此图的较大版本.

字符串和向量的正向引物
脚手架 _ fwdgttagagagacagaagcaagtt
sam _ fwdgttagagaggcacacagagg
字符串和向量的反向入门
hU6_revcggtttcgtccttt
mU6_revcaacagcttcccaagg
hH1_revctgggagagtgcctcatacaga
h7SK_revccaggtaccagcgg

表 1: grna 支架和启动子的引物序列。

启动子和脚手架的尺寸。
hu6265 bp
hh1225桶
mu6316 bp
h7sk245 bp
grna 脚手架83 bp
samo-gna 脚手架143 bp

表 2: 计算菌落 pcr 结果的每个表达式盒的理论大小。

hu6hh1mu6h7skSTAgR _ neoSTAgR _ tdTomato
grna scf400 bp360 bp451 bp380 bp3722 bp4487 bp
山 姆460 bp420 bp511 bp440 bp--

表 3: 启动子和脚手架的尺寸。

hu6hh1mu6h7skSTAgR _ neoSTAgR _ tdTomato
grna scf368 bp328 bp419 bp348 bp+ 74 bp+ 67 bp
山 姆428 bp388 bp479 bp408 bp

表 4: pcr 后 star 件的计算尺寸。

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

在这里, 我们提出了一个详细的协议 stasar 允许快速和简单地生成不同大小的 grna 表达质粒。该协议可用于一步生成 grna 质粒与 2-8 grna 表达盒 (有或不与两个 7sK rna 适配体) 到 grna 表达载体 stgr _ neo, 并使用人 u6, 小鼠 u6, 人7sk 和人 h1启动子28,32,33。如果需要四个以上的盒式磁带, 建议至少使用两种不同的启动器类型, 以提高效率。其他载体、启动子和启动子组合以及8个以上的 grna 盒也可能是可行的;然而, 这还没有经过测试。尽管根据我们的经验, 该方法工作可靠且可重复, 但如果预期结果不会立即发生, 我们已经确定了关键步骤和故障排除策略。在我们的经验中, 一些步骤对于该方法的成功至关重要: 首先, 在 gibson 装配步骤 (3:1) 上, 使用正确的刀片与矢量主干的摩尔比是非常重要的。然而, 我们注意到, 对于一些 grna 设置一个1:1 的比例插入到矢量是有益的, 即使 grna 盒数确实超过2。其次, 吉布森组装反应的周期应该足够长 (建议至少 45分钟)。

st款可以通过大量的修改来使用。目标序列、grna 编号和支架、启动子和载体主干可以定制和自由组合。但是, 每个组合可能有稍有不同的要求。根据我们的经验, 如果需要中等或较高数量的 grna 盒式磁带 (和 gt;4), 但没有立即获得, 通常克服这一问题的最快方法是改变单个 grna 盒式磁带在载体中的顺序。同样, 当克隆许多 grna 盒时, 结合不同的 grna 启动子和支架可以提高效率 (从而降低必须打分的菌落 pcr 的数量)。我们发现, 不正确的克隆通常是由吉布森组装过程中重复序列的自发结合产生的。虽然这可以降低该方法的效率, 但这也导致同时生成具有功能 grna 子集的向量 28。

据报道, 生成含有多个 grna 表达盒的多路复用 grna 载体有许多不同的方法21,22,23,24,25, 26,27。虽然有些人采用同时或连续克隆 grna对 22,34, 其他依赖于金门组装和几个顺序克隆步骤25,35。谢等人采用了一种特殊的方法, 利用内源性细胞 trna 处理系统从单个祖先成绩单36中切割出几个 grna。该方法的优点是只需要一个启动子;缺点是每个 grna 组合都需要新合成的 dna 片段。每种 grna 复用方法都有优点和缺点;stadr 结合了简单和高效, 大量可能的 grna 盒式磁带, 成本较低。

stegar (和其他多路复用系统) 很可能有助于在体内有效 (同时) 破坏多个基因,就像斑马鱼大脑28中首创的那样。grna 多路复用载体的另一个未来应用是承诺操纵完整的转录程序, 而不是单个基因的诱导或抑制。很有可能, 这些方法将使细胞和器官随意转化的程度远远高于今天。

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者没有什么可透露的。

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者要感谢 stephan beck 教授和 jovica ninkovic 教授在开发 stasar 方法方面的投入、帮助和支持。tobias klötzer、anna Klötzer 和 valentin baumann 提供有用的评论。这项工作得到了 dfg (str 1385/1) 的支持。

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Phusion 高保真 DNA 聚合酶NEBM0530L聚合酶，用于 Gibson 预混液以及所有 PCR
dNTPLife TechnologyR0191dNTP，用于所有 PCR
dATPLife TechnologyR0141dNTP，用于 Gibson 预混液
dCTPLife TechnologyR0151dNTP，用于 Gibson 预混液
dGTPLife TechnologyGibson 预混液R0161
dNTP 用于 dTTPLife Technology的 R0171用于 Gibson 预混
液琼脂糖的VWR443666A
DpnINEBR0176S
AMPure XP 珠子Beckman CoulterA63881用于 DNA 纯化
Tris HCLRoth9090.2用于 Gibson 预混液
DTTLife TechnologyR0861用于 Gibson 预混液
PEG 8000VWRRC- 077用于 Gibson 预混液
NAD开曼化学公司16077用于 Gibson 预混液
T5 核酸外切酶NEBM0363S用于 Gibson 预混液
Taq DNA 连接酶NEBM0208S用于 Gibson 预混
氨蚜素SigmaAldrichPHR1393-1G
DNA 分子量标准，1 kb PlusThermo ScientificSM0311
质粒小量套装Thermo ScientificK0503
质粒和引物序列所有序列均可在 Figshare （https://goo.gl/UGdc3Q） 获得。
EDTAPanReacAppliChem6381-92-6用于 TLE 缓冲液
MgCl2SigmaAldrichM8266用于 Gibson 预混液
前 10 名化学感受态细菌Thermo ScientificC404003
S.O.C. 培养基Thermo Scientific15544034
酵母 - 提取物SigmaAldrichY1625溶原肉汤 （LB 培养基）
NaClSigmaAldrichS7653溶原肉汤 （LB 培养基）
蛋白胨SigmaAldrich91249溶原肉汤 （LB Media）
琼脂-琼脂SigmaAldrich5040溶原肉汤 （LB Media）
Taq DNA 聚合酶Quiagen201203
的 的 用于 的 dNTP 液

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