本方案描述了一种新的行为学测试——在猪的饲养栏内进行的人类接近测试，用于检测实验猪在遭受亚震荡性创伤性脑损伤后出现的功能缺陷。
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摘要
摘要
创伤性脑损伤（TBI）在平民和军事人群中发病率均有所上升，许多研究人员正在采用猪作为TBI的动物模型。与啮齿类动物的TBI模型不同，目前针对猪的行为学测试尚未建立标准化方法。大型动物在测试过程中需要更侵入性的操作，相比啮齿类动物更容易产生应激反应和行为变异。本文介绍了一种人类接近测试（HAT），该测试设计用于在实验猪的居住栏舍前方进行。该方法具有非侵入性，且具备足够的灵活性，可适应不同的饲养环境设置。
在人猪互动测试（HAT）中，研究人员制定了三种行为谱，并应用公式计算出接近指数（AI）。结果表明，HAT及其指数AI具有足够的敏感性，能够检测猪在经历轻度创伤性脑损伤（mTBI）后出现的轻微且短暂的行为变化。此外，尽管具体的行为结果可能受饲养环境影响，但使用AI可减少变异，实现实验室间的一致性测量。该测试具有良好的可靠性和有效性，HAT可广泛应用于多个实验室，适用于多种猪的损伤、疾病和应激模型。本测试采用优化的手动时间戳记录方法，确保观察者对每个样本的记录时间不超过9分钟。
引言
人类轻度创伤性脑损伤（mTBI）通常表现为功能缺损，而脑内并无明显的整体结构改变或显著水肿1,2,3。事实上，在部分轻度创伤性脑损伤患者中，该损伤的典型特征是在无任何神经解剖学改变的情况下出现心理状态的改变4,5。我们采用猪的轻度创伤性脑损伤模型6，因为猪脑在解剖和生理上比啮齿类动物更接近人类7，且相应的测量结果可提供与人类相关的一组共同数据元素。
近年来，猪模型因其在神经创伤和轻度创伤性脑损伤（mTBI）临床前研究中的潜力而受到科研人员和相关利益方的关注；然而，与TBI的啮齿类动物模型不同，目前仅有少数已发表的标准化行为学测试可用于评估实验猪的情感状态（即心理状态）7,8,9,10。我们实验室的长期目标是开发一系列互补的行为学工具集，使其足够灵敏，能够检测猪只在出现亚临床疾病状态或处于病理前应激相关状态时的行为变化。
重复进行的行为测试可用于测量实验猪情感状态的变化，可能是区分处于前病理状态动物与健康动物的有效方法。例如，圈舍内人-动物互动测试（HATs）已应用于商业养猪生产中，帮助养殖户挑选性情良好且健康的猪只，或调整导致猪只产生应激、损伤和疾病的饲养管理与圈养策略11,12。这些测试可用于量化单头猪或一群猪的动机水平和整体情感状态13。
本实验室及其他研究人员通过量化猪的三类行为来测量其动机：1）探索性状态，表现为非营养性口腔行为（NNOB），即猪使用口、鼻吻部或面部对基质进行嗅闻、舔舐、咀嚼和拱掘，或在无基质时出现空嚼动作14,15；2）猪与物体或生物之间的空间关系16；3）鼻尖朝向，用于替代目光接触，因为猪具有单眼17且近视的视觉，更依赖嗅觉而非视觉18。若健康猪将人类与奖励性刺激相关联，则会频繁表现出NNOB行为，将鼻尖朝向人类，并主动寻求与人类更近的接近距离11,16。然而，在患病、受伤或经历痛苦事件后，即使对愉悦刺激的动机也会降低，因此这些可测量的行为可能相应减少19。猪行为研究者指出，在猪的日常环境中，快感缺失（即缺乏体验愉悦刺激的动机）是可识别且可测量的20。因此，重复进行人接近测试（HAT）（治疗前后）可能作为一项敏感指标，用于区分接受亚震荡性轻度创伤性脑损伤（mTBI）处理的实验猪与假手术处理（仅麻醉）的对照个体。快感缺失是创伤性脑损伤（TBI）患者可能出现的一种情感状态21。本研究所采用的HAT有望促进从动物模型到临床研究的行为学发现的转化。HAT可在实验过程中每日实施，也有助于标准化实验猪的饲养管理，以优化动物福利和饲养实践22。
本文利用HAT检测小型猪在轻度创伤性脑损伤（mTBI）后出现的行为差异。通过采用HAT的非侵入性测量方法，并让猪在饲养栏中适应其生活环境、日常管理程序以及每日零食，可有效减少行为变异。传统上，行为测量通常使用测试场地（例如开放场测试）。然而，在空间有限的实验室中，栏内测试具有实用价值。将猪转移至测试场地进行操作可能引发应激反应（ distress 或 eustress），并可能增加测试反应的变异性。栏内测试避免了搬运和操作环节，因此很可能降低了由操作应激引起的变异17。基于上述原因，我们为该mTBI模型开发了一种每日在栏内进行的HAT测试方法。
建立能够准确定义动物情感状态的标准化和量化指标，是开发新的行为学测试的重要方面。此外，测试应在多个实验室之间具有可重复性。在本实验方案的开发过程中，HAT测试在三个实验室的不同饲养系统中进行了验证。通过样本视频建立了三个子行为谱，用于对特定行为进行时间标记。随后，创建了一个加权公式，以整合这三个行为谱，从而实现在多个实验室中使用HAT测试。尽管该测试是专门为接受亚震荡性轻度创伤性脑损伤（mTBI）处理的迷你猪而开发和使用的，但本文所建立的方法和实验方案也可用于区分亚临床损伤/患病或应激状态的猪与健康猪之间的差异。
行为结果可能受到单只饲养与群养、活动空间大小、地面类型、围栏类型、饲喂和饮水位置、排泄区域以及环境丰富化设施位置的影响。因此，本研究考察了三种饲养类型（图1）：A型饲养位于堪萨斯州立大学（曼哈顿，KS）；B型和C型饲养位于弗吉尼亚理工学院（阿灵顿，VA）。各实验地点的独立机构动物护理和使用委员会（IACUC）均批准了设施的使用及相关实验操作程序。
为建立饲养类型A的动物行为谱（图1A），将明尼苏达杂交系迷你猪（公猪 = 7头，母猪 = 1头；国家猪类研究资源中心，密苏里州哥伦比亚市；年龄 = 25.6 ± 3.66（均值 ± 标准差[SD]）周）饲养于室内单体栏舍中，地面为动物友好型材料（IACUC #3881）。用于本方案的猪只健康状况良好，未接受任何处理。为建立饲养类型B的方案，尤卡坦迷你猪（年龄 = 25.3 ± 2.80 周[均值 ± SD]）在弗吉尼亚理工大学设施中单只饲养（图1B；IACUC #15-060）。动物处理方法在其他文献中有详细描述29，包括使用冲击波超压诱导亚震荡性轻度创伤性脑损伤（mTBI），或仅接受麻醉的假手术对照组。为建立饲养类型C的方案，5只雌性哥廷根迷你猪（年龄 = 23.7 ± 1.18 周[均值 ± SD]）在弗吉尼亚理工大学的大栏中成对饲养（图1C；IACUC #15-060）。前两种饲养环境为典型的实验室饲养条件，均为单只饲养猪只。饲养类型C则为非典型饲养环境，可容纳两只或更多猪只，相较于标准实验室饲养条件，可被视为一种更丰富的环境。若遵循以下方法，本方案可适用于不同饲养类型。
方案
各所在地的独立动物照护与使用委员会（IACUC）（堪萨斯州立大学和弗吉尼亚理工学院）已批准设施的使用及实验操作流程。
1. 摄像头和笔的设置及常规流程的建立
- 在将动物放入围栏之前，将摄像头固定在每个围栏正上方90°角的位置（参见 材料表 （建议的摄像系统）。
- 以每秒30帧（fps）的速率对动物进行持续记录，记录时间可覆盖整个研究周期，或仅限于测试阶段。
- 使用螺栓和链条固定食盆、饮水器、垫子和玩具。
- 放置可持续播放白噪声或粉红噪声的声学设备（e例如，猪舍中的瀑布声。
注意： 外部突发噪音（例如门的开关声）可能在实验过程中引发惊吓反射23,24. - 按圈舍在整个设施内对处理进行随机化或分层。
- 建立一套规范的动物饲养管理流程。这有助于让猪只熟悉饲养人员清洁圈舍、喂食、接触以及进行实验操作的时间规律。
- 用熟悉的零食让猪将人类与奖励联系起来。
- 使用响片在奖励过程中让猪将咔哒声与奖励联系起来。不要使用发声或视觉信号来使猪熟悉奖励（参见 材料表).
- 在晨间进食前或为自由采食猪只提供新饲料前进行操作。
2. 猪的识别
- 即使动物为单笼饲养，也应在视频画面中使其可被识别。
- 确保观察人员在记录时间戳时对处理分组保持盲法且无偏倚，使用与处理分组无关的标记系统。使用医用级胶带（参见材料表），将其粘贴在具有特定颜色、圆形形状和图案的 duct 胶带上。
- 使用一个圆形标记贴于猪的顶部，两侧各贴一个（参见图1中的绿色和蓝色标记）。
- 在胶带的角落涂抹少量标签水泥（少于 0.35 g），以延长其粘附时间。
注意：标签水泥过多将不易快速干燥，可能导致胶带过早脱落。 - 在适应期期间调试并优化标记策略，以确保正式实验能够高效进行，并避免给猪带来额外应激。
- 使用数据记录表跟踪标记情况和个体识别信息（示例数据表见补充文件1）。
注意：去除胶带时，切勿生拉硬扯，以免拔出毛发引起疼痛。胶带可自然脱落，也可使用水性润滑剂帮助去除，或用剪毛器剃除。若胶带在非预期时间脱落，可在猪进食时重新粘贴备用标记胶带，避免对其进行束缚操作。
3. HAT 实验步骤
- 让受试人员佩戴相同的帽子、连体服、靴子，并保持相同的气味 等等。 每次进行实验时。
- 每天进行，治疗前至少3次，之后每日进行。
- 实验开始前，猪可以在其围栏内的任意位置。开始实验时，让测试人员将零食放入碗中或围栏前方，并按响点击器3次。
- 测试者需将双手置于猪的视线之外，并在测试期间保持静止不动。由另一名研究人员在数据表上标记测试开始时间并启动计时器。120秒后，该研究人员无声示意测试者移向下一位受试对象并重新开始测试。
4. 用于软件的 HAT 行为谱的建立
- 使用专业软件在一个项目下构建行为谱（见图 1、图 2和补充视频 1）。
注意：空间行为指动物相对于人的位置。在行为谱中，空间关系必须根据动物栏舍进行定制，并在每次使用新的栏舍设置时重新发布（图 1）。在此类别中，行为被视为互斥。空间被划分为四个区域，表示不同程度的接近（图 1）。这些区域在不同饲养类型中保持标准化。“最近”或“攀爬”（Cl）表示猪可能攀爬围栏以接触人，因此攀爬被视为表明猪最积极寻求人际接触的空间行为。“近”（Co）指距离人61 cm以内的区域。“中等”（M）指距离人61–122 cm的区域。“远”（F）指距离人123 cm及以上的区域。 - 结构行为关注整个身体或身体部分的朝向（图 2）。建立两个结构类别：1）猪鼻位置；2）猪的活动状态。使用图 2A来识别方向性（方向1表示猪将鼻部朝向人；方向2表示猪将鼻部背离人）。
- 将活动行为（图 2B）划分为三种互斥的接近状态：使用非营养性物体进行口鼻操作（NNOB）、站立或行走但无NNOB、静止但无NNOB（参见视频中行为谱的颜色编码）。
注意：NNOB用于描述猪使用口、吻突或面部舔舐、嗅闻、咀嚼、咬合、摩擦或拱掘非营养性物体，以探索熟悉感或新奇机会的行为。因此，当猪处于该活跃状态时，表明其对人感兴趣并处于接近状态。若使用90°角的 overhead 摄像头，猪的鼻部位置和头部运动是判断NNOB的指标。偶尔猪会做出咀嚼或模拟咀嚼动作，此时可见其鼻部，但头部上下移动。“站立或行走但无NNOB”用于描述猪处于直立姿势、头部静止、鼻部未接触基质也未咀嚼的状态，表明其接近意愿较低。“静止但无NNOB”用于描述猪以躺卧或坐姿休息的状态，这是该行为类别中最弱的接近状态。
5. 视频的时间戳标记以提高效率和可靠性
- 根据数据记录器记录的开始时间，将视频剪辑为精确的3分钟片段。每个片段的时间戳标注方法需耗时9分钟。
- 仅使用最多两名经过培训的观察者对视频进行时间戳标注。
注意：若使用两名观察者，应在两人对同一段样本视频完成时间戳标注后，量化、评估、调整并报告其观察者间变异，以皮尔逊相关系数表示（方法详见 Martin 和 Bateson25）。 - 将视频播放速度设置为1倍正常速度（即30帧/秒）。不得暂停、回放或逐帧标注时间戳。
- 对每类互斥行为分别进行时间戳标注。
- 标注空间行为的时间戳。重新开始播放视频。
- 标注结构行为的时间戳。重新开始播放视频。
- 标注结构/鼻部位置行为的时间戳。
- 使用每种行为结果的持续时间（参见补充视频2和3）来汇总数据。需将各行为类别的持续时间测量值转换为占总时间的百分比。
6. 方法索引
- 应用公式（图3），将每种结构和空间行为结合起来，以生成一个亲和指数（AI）（图3，图4）。该亲和指数可用于补充单独报告行为及类别的图形结果（图5）或以表格形式呈现。
注意： 软件详细信息请参见材料表。在每个类别中，首先将行为持续时间转换为百分比（行为持续时间除以测试会话的总时长）。然后根据接近程度对每种行为进行加权（图3）。回避行为（在远区停留的时间百分比、静止不动、鼻尖朝向远离人类方向）乘以0；中等接近行为（在中区停留的时间百分比、朝向人类、头部静止站立）乘以1；最高程度接近行为（在近区和最近区停留的时间百分比以及表现出鼻-鼻-嘴接触行为[NNOB]）乘以2。随后，空间、鼻部朝向和活动性三个类别分别进一步加权3、2和1。最后应用一个常数（0.10）以形成百分比量表。例如，若猪在整个测试过程中始终面向人类、位于近区或最近区并表现出NNOB，则其AI为100%（图3中的红色猪）。相反，若猪在整个测试期间始终停留在远区、未面向人类且保持静止状态，则其AI为0%（图3中的黑色猪）。位于近区但背向人类且头部静止站立的猪，其AI可能与在中区表现出NNOB的猪相同（图3中的橙色猪）。
结果
在三个不同的实验室中，使用了三种饲养类型（A、B 和 C；见图1）进行人道终点评估测试（HATs）。在所有实验室和实验中，HATs均采用了结构行为类别以及头部和身体朝向（如图2所示）。表1展示了从三种饲养类型中收集的数据，以及基于HAT期间预处理健康猪只所获得数据进行的描述性统计分析。随后，基于HAT期间获得的数据开发了一个公式，用于计算动物状态指数（AI）（见图3）。结果表明，使用AI可减少所收集数据的变异程度（表1）。这一发现具有重要意义，因为数据变异性降低后，检测较小差异时所需的实验动物数量将减少。
对于表1，采用PROC UNIVARIATE过程获取描述性统计量（具体软件信息见材料表）。为比较各实验室饲养类型对行为结果的影响，使用具有重复测量模型的MIXED过程进行分析，将猪作为随机变量。协方差结构选择一阶自回归类型。采用Tukey-Kramer调整法进行最小二乘均数的多重比较。显著性水平定义为P ≤ 0.05。
接下来，确定在每次HAT测试中是否应由同一人或不同的人类实验者进行操作。为了比较猪对陌生人的行为反应与对熟悉人的反应，采用具有重复测量模型的MIXED过程进行分析。将猪作为随机变量，协方差结构选择一阶自回归类型。使用Tukey-Kramer校正法对最小二乘均值进行多重比较。显著性水平定义为P ≤ 0.05。我们发现，在测试过程中使用熟悉的人类与使用陌生的人类相比，回避指数（AI）无显著差异（见表2中的数据）。如果猪从未与人类发生过负面互动，它们通常会泛化并将所有人类与食物积极地联系起来26。
HAT方案的适应期是根据来自A型饲养环境的猪只接近指数（336次测试会话）确定的。HAT在动物到达后的第8天开始，分别由熟悉人员（此前一周曾接触过猪只）和陌生人员（此前从未接触过猪只）各进行两次测试。为了确定时间对HAT结果的影响，采用具有重复测量模型的MIXED过程进行分析，将猪只作为随机变量，协方差结构选择一阶自回归类型。最小二乘均数通过Tukey-Kramer法进行多重比较校正。显著性水平定义为P ≤ 0.05。如上所述，数据分析未发现猪只对熟悉人员与陌生人员接触的反应存在显著差异（表2）。然而，适应期的确定依据是第9、11和13天的接近指数显著低于其他各天。基线期应至少包含适应完成后三次测量值，但我们建议使用六次会话的数据计算AI均值，并作为模型中的协变量。
为了确定HAT方法是否能够区分轻度创伤性脑损伤（mTBI）处理的猪与假手术处理的猪，采集了12头猪在处理前1天（-1）及处理后3天的HAT数据，处理方式为仅麻醉29 仅（假手术）或使用冲击波管进行麻醉和爆震波暴露29 达到峰值 psi 为 47.4 ± 13.6 SD，持续时间为 4.7 ± 0.9 ms SD（爆炸）。数据采用统计学软件中的混合模型程序进行受限似然 ANOVA 分析，以确定处理方式、时间及其交互作用之间的差异。报告的是模型中的最大 SEM， P < 0.05 被视为具有显著性。AI 涵盖所有行为（图3）。在治疗后的第1天和第2天，AI指标能够区分轻度创伤性脑损伤猪与假手术猪（P < 0.05; 图4）。行为可在其互斥的类别内进行分析和呈现（图5）。治疗后第1天和第2天，近距离空间行为指标可区分爆炸组猪与假手术组猪P < 0.05; 图 5A）。同样，鼻部朝向、静止时间以及NNOB测量值在治疗后第1天和第2天能够区分假手术猪与爆炸暴露猪。图 5B 和 5C).
图1：三种不同实验室饲养类型中行为的空间分类。 行为谱图以人类（脚印）为参照，并根据猪的体型与可用空间大小的关系进行设置。在此类行为中，最接近的程度是猪试图攀爬至最靠近人类的隔板上（Cl；最近或攀爬）。当猪的耳朵或身体更多部分进入相应空间区域时，经过培训的观察者会记录“近距离”（Co；距人类0–61 cm）、“中距离”（M；距人类61–122 cm）和“远距离”（F；距人类123 cm及以上）。每个实验室栏位均配备一个或两个饲喂碗，用于每日两次饲喂，另配有饮水器（W）和一个玩具。(A) 每头50 kg的公猪单独饲养于190 cm × 114 cm的栏位中，地面为格栅结构。(B) 每头50 kg的公猪饲养在带有后部排水口的格栅地面上，并铺设黑色垫子。(C) 约10 kg的公猪以每对共养于274 × 366 cm的栏位中，地面为混凝土结构，配有垫子、排水口，以及固定的饲喂碗和玩具。彩色条带（如绿色和蓝色）代表标记策略。示意图中的所有猪均以绿色或蓝色斑块标记，作为在视频中对猪只进行标记和识别的示例。 请点击此处查看此图的放大版本。
图 2：三个实验室和实验中采用的结构化行为分类。（A）在头部朝向类别中，猪的头部朝向或背向人类或移动物体。（B）在身体朝向类别中，猪的头部位置分为：低头，执行非营养性口腔行为（NNOB）；直立，站立或行走，但头部无运动或处于低位；静息状态，包括坐或躺卧。请点击此处查看此图的放大版本。
图3：接近指数公式与示意图。 接近指数的建立旨在将所有行为组合置于0至100的量表上，其中0表示猪处于最低接近状态（位于远端区域，鼻部背向，静卧且头部不动），100表示猪位于近端区域，鼻部朝向人类，并执行NNOB行为。使用一款软件程序（详见材料表中的说明）对行为进行测量，使其呈线性对应。每头猪的结构代表一个数据点，这些数据点在线性尺度上按类别对齐。在每个类别内，首先将行为持续时间转换为百分比（行为持续时间除以测试总时长）。然后根据接近程度对每种行为进行加权：回避行为（在远端区域停留时间百分比、静息状态、鼻部背向）乘以0；中等接近行为（在中间区域停留时间百分比、朝向人类、站立且头部静止）乘以1；最高程度的接近行为（在近端和最近端区域停留时间百分比、执行NNOB行为）乘以2。随后，空间位置、鼻部朝向和活动状态三个类别分别进一步加权3、2和1。应用一个常数（0.10）以将数据缩放至0到100的完整范围。采用类似热图的颜色方案来表示猪从最接近状态（黑色）到最不接近状态的差异。请点击此处查看该图的放大版本。
图4：经爆震波暴露处理的猪的接近指数。 该图显示了猪在处理前1天（-1）和处理后3天的接近指数，处理方式为仅使用麻醉（假手术组， n = 6）或在麻醉状态下暴露于峰值 psi 为 47.4 ± 13.6 SD、持续时间为 4.7 ± 0.9 ms SD 的冲击波。误差线表示标准误（SEM）。 P处理的P值 = 0.032，时间的P值 = 0.033，处理与时间交互作用的P值 = 0.012。数据采用统计软件中的混合模型程序进行限制性似然方差分析，以确定处理、时间及其交互作用之间的差异。报告的是模型中最大的标准误（SEM），且*P < 0.05 被认为具有显著性。 请点击此处以查看此图的放大版本。
图 5：行为展示的堆叠柱状图方法。 这些图显示了使用堆叠柱状图展示行为的方法，分别为 (A) 空间行为、(B) 鼻子朝向行为，以及 (C) 猪在处理前 1 天 (-1) 和处理后 3 天的行为活动情况。处理方式包括仅麻醉（假手术组，n = 6）或麻醉加爆震波暴露（峰值 psi 为 47.4 ± 13.6 SD，持续时间为 4.7 ± 0.9 ms SD）。本实验采用饲养类型 B。每个堆叠柱状图均可表示所有互斥的行为类别。(A) 空间行为的处理 × 时间 P 值分别为：远距离 = 0.060，中距离 = 0.110，*近距离 = 0.014，最近距离 = 0.557；(B) 鼻子朝向行为的处理 × 时间 P 值为 < 0.001*；(C) 活动行为的处理 × 时间 P 值为 > 0.10；处理主效应的 P 值分别为：静止 = *0.046，站立 = 0.584，以及 *无鼻部活动（NNOB）= 0.042。合并的标准误（SEM）分别为 (A) 7.5%，(B) 9.6%，和 (C) 9.7%。每种行为结果均通过统计学软件中的混合模型程序采用限制性最大似然法进行重复测量方差分析（具体软件见材料表），然后整合成图表。分析评估了处理因素、时间及其交互作用之间的差异。报告的是模型中的最大标准误，*P < 0.05 被认为具有统计学意义。请点击此处查看该图的放大版本。
| 不同饲养条件下的方差分析统计结果 | 所有健康猪数据的描述性统计 | 实验单位数量 | |||||||||||||||||||
| 饲养方式 | P- | 编号 | 百分位数，% | 检测相对于对照组的Δ%变化1 | |||||||||||||||||
| A | B | C | 扫描电子显微镜 | 数值 | 观察 | μ | SD | CV% | 扫描电子显微镜 | 分钟 | 25 | 50 | 75 | Max | 25 | 50 | 75 | 100 | 200 | ||
| 接近指数，% | 75.4 | 69.2 | 76.6 | 5.5 | 0.318 | 288 | 74 | 17 | 23 | 1 | 0 | 70 | 80 | 84 | 99 | 18 | 4 | 3 | 3 | 3 | |
| 笔位置持续时间，% | |||||||||||||||||||||
| 远 | 8.5a | 5.3a | 23.0b | 4.8 | 0.008 | 288 | 10 | 20 | 200.1 | 1.2 | 0 | 0 | 0 | 10 | 100 | -- | 336 | 149 | 84 | 21 | |
| 中期 | 18.9 | 46 | 13.75 | 16.2 | 0.066 | 288 | 23 | 29 | 125 | 1.7 | 0 | 2 | 10 | 32 | 100 | 526 | 131 | 58 | 33 | 8 | |
| 关闭 | 72.4a | 43.9b | 62.4a | 12.8 | 0.032 | 288 | 23 | 29 | 123.9 | 1.7 | 0 | 47 | 78 | 93 | 100 | 509 | 127 | 57 | 32 | 8 | |
| 最接近（攀爬） | 0 | 8.9 | 0 | 3.1 | 0.001 | 288 | 67 | 32 | 47.8 | 1.9 | 0 | 46 | 80 | 95 | 100 | 74 | 19 | 8 | 5 | 3 | |
| 关闭 + 最近 | 72.5 | 53 | 62.3 | 14.9 | 0.311 | 288 | 68 | 32 | 46.6 | 1.9 | 0 | 46 | 78 | 93 | 100 | 74 | 19 | 8 | 5 | 3 | |
| 活动持续时间，% | |||||||||||||||||||||
| 保持头部静止地躺下或坐下 | 5.6a | 0.0b | 17.0c | 1.8 | 0.001 | 288 | 1.3 | 5 | 393.7 | 0.3 | 0 | 1 | 3 | 7 | 59 | -- | -- | 579 | 326 | 82 | |
| 保持头部静止站立/行走 | 48.3a | 63.6a,b | 83.5b | 10 | 0.006 | 288 | 52 | 43 | 82.1 | 2.5 | 1 | 7 | 47 | 100 | 100 | 226 | 57 | 25 | 14 | 4 | |
| NNOB | 81.5 | 57.7 | 71.1 | 13.3 | 0.109 | 288 | 77 | 28 | 36.4 | 1.7 | 0 | 66 | 91 | 98 | 100 | 44 | 11 | 5 | 3 | 3 | |
| 头部方向、持续时间、% | |||||||||||||||||||||
| 离开 | 24.7a | 17.4a | 50.7b | 4.5 | 0.001 | 288 | 26 | 21 | 79.3 | 1.2 | 0 | 10 | 22 | 39 | 92 | 212 | 53 | 24 | 13 | 3 | |
| 趋向于 | 75.3 a | 82.6 a | 49.3 b | 4.5 | 0.001 | 288 | 74 | 21 | 27.8 | 1.2 | 8 | 62 | 79 | 90 | 100 | 26 | 6 | 3 | 3 | 3 | |
表1：为创建本数据集，对所有饲养类型的基线HAT测量值进行了检测。 行为学结果采用统计分析软件中的MIXED过程进行受限似然方差分析。这些分析确定了每种实验动物饲养类型在行为持续时间与接近指数上的差异。报告了模型中的最大标准误（SEM），且认为P < 0.05 具有统计学意义。此外，使用统计分析软件的UNIVARIATE过程进行描述性统计分析。随后将置信度（CV）%输入实验单位计算器27，并检验了两种处理间预期差异的条件。
| 处理 | P 值 | |||||
| 熟悉 | 不熟悉 | 标准误均值（SEM） | 处理效应（TRT） | 时间效应（Time） | 处理×时间交互效应（TRT*Time） | |
| 接近指数，% | 84.8 | 84.4 | 3.06 | 0.766 | 0.002 | 0.661 |
| 栏位停留时长，% | ||||||
| 远端 | 10.7 | 10.1 | 3.49 | 0.844 | 0.008 | 0.522 |
| 中段 | 18.7 | 17.6 | 3.38 | 0.717 | 0.014 | 0.918 |
| 近端 | 70.4 | 72.3 | 5.25 | 0.617 | <0.001 | 0.895 |
| 活动持续时间，% | ||||||
| 躺卧或静坐，无非营养性咀嚼行为（NNOB） | 5.8 | 5.8 | 0.8 | 0.995 | <0.001 | 0.901 |
| 站立或行走，无非营养性咀嚼行为（NNOB） | 5.5 | 5.5 | 1.4 | 0.995 | <0.001 | 0.524 |
| 非营养性咀嚼行为（NNOB） | 82.1 | 83.3 | 4.12 | 0.722 | 0.0029 | 0.617 |
| 头部朝向持续时间，% | ||||||
| 背向 | 23.9 | 23 | 2.81 | 0.725 | <0.001 | 0.329 |
| 朝向 | 76.1 | 77 | 2.8 | 0.725 | <0.001 | 0.329 |
表2：对来自A型饲养环境的七头猪进行了一项实验。 每天进行两次测试。每次测试使用一位熟悉的（女性）人员或七位不熟悉人员（三名男性和四名女性）之一进行人-动物互动测试（HATs）。每次均由同一位熟悉人员首先进行，随后使用七位不熟悉人员。采用方差分析（ANOVA）模型对处理因素（熟悉或不熟悉）、时间（天数）及其交互作用进行统计分析软件检验。
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讨论
轻度脑损伤不会导致当前先进影像技术可检测到的明显解剖和结构改变，因此这类损伤可能难以识别和治疗28。然而，轻度创伤性脑损伤（mTBI）患者尤其容易受到进一步损伤，从而对大脑造成严重损害，因此准确识别该人群至关重要。在mTBI小型猪模型中开发的行为学测试与人类mTBI患者具有高度相关性，因为猪的生理特征与人类相似，并表现出类似的情绪状态，例如快感缺失8,9,10,20。本文中，我们开发了一种非侵入性、在圈舍内即可进行的行为学测试（HAT），并证明该测试足够敏感，能够区分mTBI猪与假手术猪。此外，我们还针对HAT测试过程中观察到的、在不同饲养环境和猪种中普遍存在的行为，建立了一个加权指数（AI）。
修改与故障排除：
HAT 的方法学建立在动物行为学指南25以及多种通过试错策略优化实验可靠性、可重复性和有效性的基础之上6。可靠性评估有助于识别该测试的优势与局限性。可靠性是指测量结果可重复、一致且不受随机误差影响的程度28,29。我们此前已报道过 HAT 的观察者内和观察者间可靠性，结合新增的结构化行为谱，各项指标的可靠性同样较高（持续时间的 Pearson R2 > 0.90）6。频率和潜伏期的测量需要经过培训的观察者，而持续时间的测量对观察者的依赖性较低，因此在不同实验室之间更具可靠性30。
实验室内部的可靠性以及实验室之间的可重复性取决于所采用的方法。在本实验室中，视频系统持续记录，文件最初以5分钟为单位存储，部分HAT会话跨越两个文件。当使用数据表中的确切时间来剪辑和合并视频时，出错的情况更少。在制定行为谱之前，观察者被允许暂停、停止和回放视频片段，以对整个行为谱中的所有行为进行时间戳标注。这种方法不仅导致每个样本的时间戳标注耗时差异较大（从3分钟到20分钟不等），而且大多数行为的观察者间和观察者内可靠性也较差。因此，我们设定了固定的播放速度，并要求观察者逐类依次进行时间戳标注。这样，当某一类行为的可靠性较低时，观察者可在共同查阅定义和视频片段后，仅对该类别重新进行时间戳标注，而无需重新标注整个行为谱。采用固定的播放速度和分类标注方法，使得预测每个样本所需的时间戳标注时长更加一致。对于持续时间超过一个月的项目，定期复查已编码的视频并评估观察者内部的可靠性至关重要。
另一个影响可靠性和可重复性的因素是视频设置。最初使用手持摄像机和三脚架，并在不同栏位之间移动。采用这种方法时，需要在人猪接触测试（HAT）之前让猪适应三脚架和摄像机；否则，猪对三脚架及其移动的反应会超过对测试人员的反应。此外，非俯视角度的摄像限制了观察者在打时间戳时的视野，空间深度感知也增加了空间行为测量中观察者内部和观察者之间的变异。因此，我们改进了实验方案，采用固定摄像机。使用该方法时，每次测试前必须格外注意确保摄像机正确安装，且每头猪测试之间的准备时间也需更长。然而，我们发现连续俯拍视频系统必须至少在首次人猪接触测试前24小时的午夜开始初始录制。许多视频系统的时间戳显示并不精确，无法精确同步到每一帧；因此，我们不再依赖显示时间。从午夜开始录制可实现精确的帧捕捉和视频剪辑，时间戳显示功能则不再使用。
此外，在排查该试验问题时，猪只的适应过程以及建立规律性的操作流程非常重要。在对未充分适应环境的猪只进行录像观察时，发现其在HAT测试中出现踱步行为。这表明猪只可能处于焦躁状态31，而非探索状态32。延长适应期至三周或更长时间，可能减少实验中出现踱步行为的猪只数量。然而，如果踱步行为在整个采样期间持续存在，则可能需要对该行为谱进行调整，增加“行走”和“静止站立”等行为类别。
效度是指测量在多大程度上能够代表所提出问题的预期范围25。在首次开发人猪互动测试（HAT）时，我们仅使用了空间行为谱。空间行为谱中的行为定义能够准确且具体地描述猪与人类受试者之间的接近程度，并直接告知观察者猪与人类之间保持的距离。然而，当这些方法需要应用于新的实验室设置时，我们意识到空间行为谱具有实验室特异性。圈舍的尺寸以及其他物体的摆放位置会影响空间行为谱的结果；因此，如果圈舍设置此前未被报道过，则需要发表包含圈舍尺寸和具体细节的示意图。除了报告圈舍环境外，我们还在行为谱中增加了结构性行为。与空间行为不同，结构性行为更容易在不同实验室之间进行评估；这些行为具有效度，因为它们能够具体描述猪的活动状态水平。当猪处于休息状态时，其接近人类的动机可能较低，并且无法像站立的猪那样迅速改变姿势以接近人类。类似地，表现出非营养性物体探索行为（NNOB）的猪处于探索状态，而站立时头部静止的猪则更可能处于类紧张性状态。鼻部朝向有助于提高效度，因为猪主要通过鼻子、耳朵，然后是眼睛来获取有关人类的信息。
该技术的局限性：
该技术可能存在一个潜在问题，即猪对测试人员的反应存在个体差异。 此外，猪会注视测试人员的手部动作，这可能导致该人员无意中提供提示线索。因此，实验中通过以下两点来应对这些局限性：1）检验猪对熟悉人类与陌生人类的反应差异；2）标准化操作流程，即在投放颗粒饲料后，测试人员保持静止并将双手移出猪的视线范围。数据显示，在人接近测试（HAT）过程中，不同处理组之间以及处理与时间的交互效应均无显著差异（表2），表明HAT可由熟悉或陌生的人员实施。其他研究者指出，猪倾向于根据以往与人类的互动经历来泛化对人类的认知11,12,13；因此，猪此前与人类的接触经历应为积极正面的。 这一挑战亦可通过严谨的实验设计加以克服；对于每个区组，需为每种关注的处理方式配备足够数量的实验单元。
本研究中，尽管仅有两名经验丰富的观察员对所有三种饲养类型的视频进行了时间戳标注，但不同饲养类型在特定行为结果上仍存在差异（表1）。例如，B型饲养环境中的猪进入最近区域的频率高于A型和C型饲养环境中的猪。这可能是由于栏舍材料的差异所致：在B型饲养环境中，栏舍前部为带有水平横杆的链环门，使猪在进行人接近测试（HAT）时能够攀爬门栏；而A型和C型饲养环境则采用垂直栏杆，可供猪攀爬的水平表面较少。这种差异可通过在比较不同饲养类型时增加猪在近处和最近区域停留时间的分析来弥补（表1；P > 0.10）。然而，C型饲养环境中的猪在远处区域停留的时间显著长于A型和B型饲养环境中的猪（表1；P < 0.05），这可能是由于饮水器位于栏舍后部而非前部所致。这一局限性可通过实验室对饮水器、食槽和玩具的放置位置进行标准化，并确保这些物品固定不动、防止猪将其移动至其他区域来加以改进。
该检测方法对各类实验室均具有良好的可及性，但如前所述，人工标记的空间行为图谱及测量结果在不同实验室之间可能存在较大差异。尽管如此，躯体结构和头部结构行为图谱具有普遍适用性。对于具备经过验证的猪只自动化追踪系统的实验室而言，采用自动追踪方式获取空间行为图谱可能更具优势，因为移动距离和移动速率可作为人-猪互动测试（HAT）中行为测量的额外指标。通过调整人工智能（AI）算法，有望克服传统圈舍设置和传统技术手段（而非专用测试区域和自动追踪技术）所带来的局限性。AI算法为个体猪只如何利用圈舍空间以及对人类表现出兴趣的程度提供了标准化的测量方法和术语体系。该计算方法基于常见的行为测量指标，对亚震荡性轻度创伤性脑损伤（mTBI）的猪模型具有敏感性，也可能适用于其他亚临床损伤或疾病状态的检测。此外，AI算法能够减少实验过程中的随机变异，相较于依赖更多实验特异性测量指标的方法，更便于在不同实验和实验室之间进行比较。该公式的建立基于结构性行为，因为这些行为在不同处理条件下均为标准测量指标，而空间行为则依赖于圈舍设置、每圈猪只数量以及追踪系统。例如，我们观察到当两只健康猪只在同一圈舍中接受测试时，它们会表现出相似的空间行为，共同接近测试区域；但跟随在前的猪只可能将其鼻部更多地朝向同圈伙伴而非人类，表现出更多的非鼻接触行为（NNOB），因为领头的猪只起到了警戒作用。尽管如此，AI算法即使在成对行为中也有助于降低此类变异。
尽管回避指数（AI）是一套出色的工具，可用于在不同实验室之间标准化测试，但研究人员可能仍希望在特定实验室或实验中考察与测试相关的具体行为结果，尤其是在单次实验中具备足够的统计效能（即实验单位数量充足且进行了重复测试）时。因此，本文提供了表1，其中包含所有行为结果、方差、分布情况，以及针对每种特定行为计算出的所需动物数量的检验结果。例如，如果研究人员的圈舍环境允许猪在高架通道测试（HAT）中持续攀爬，并且已知处理因素会导致攀爬行为差异超过75%，则他们可根据实测的方差来合理确定动物使用数量。如果向行为谱中新增行为，科学家需要先明确这些行为是否代表趋近或回避反应，然后才能将其纳入指数计算。例如，若某实验中大多数动物沿圈舍墙壁来回踱步（即接触性趋壁行为，thigmotaxis）32，则该行为的持续时间可被归入身体结构相关的行为谱类别。该行为可在详细的堆叠柱状图（即图5）或表格中单独呈现，随后在进行指数计算前，可将其与静止站立行为合并统计。因此，回避指数（AI）能够反映在各实验室中普遍存在的行为，同时仍可单独呈现其他独特的行为表现。
与现有方法相比的意义：
现有的高架十字迷宫（HAT）方法是为商业农场的猪只福利评估而建立的。本文提出了一种适用于实验室猪只的实验方案，可帮助研究人员评估动物福利状况，并区分轻度创伤性脑损伤（mTBI）猪只与假手术处理的猪只。另一种传统的替代测试是旷场实验。该实验此前已被用于评估猪的情绪性和福利状况33。旷场实验最初是为检测啮齿类动物的情感状态而设计的，通过测量其对开阔空间和光照的天然厌恶行为来进行评估。相比之下，健康的猪可能将相同的刺激视为具有吸引力的10，而在经历疾病、损伤或应激处理后，它们更可能表现出恐惧反应。该测试需要更多的实验室空间，并要求猪只事先适应被人操作以及被放置于旷场实验区域的过程。如果实验室具备足够的空间，且已建立猪只操作的相关规程，则在进行一次旷场实验的基础上，辅以多次重复的HAT测试，可能有助于进一步区分处理组动物与假手术组动物。
实验方案中的关键步骤：
该方案的前三个步骤对于成功进行HAT测量最为关键。每头猪的测试时间仅需3分钟；然而，充分的准备工作有助于确保测试的可靠性。如上所述，摄像机的位置和录制设置对于保证画面清晰和可重复性至关重要。不恰当的摄像角度会限制观察者的视野，从而增加测量误差。另一个常被忽视的步骤是在围栏中固定测试物体。猪会移动未固定的物体，这可能影响其接近人类的动机。测试装置和管理系统非常重要，因为猪只有在适应了其环境后才能稳定地完成测试。那些未充分适应其居住栏舍或日常程序、或处于应激状态的猪，可能会在栏舍其他区域排便，而非在栏舍后部排便34。排便区域的位置可能影响其接近人类的动机。从摄像机视角来看，观察者应能识别出每头个体猪；然而，标记方案不应提供有关动物处理分组的信息，否则将导致观察者产生偏倚25。
识别猪只对于获取正确个体的行为数据至关重要，即使在单只饲养的情况下也是如此。猪只常因处理需要被转移，而标记可确保观察者在猪只被移出并放回栏舍后仍能确认其身份。猪只可能成对饲养（如C型饲养方式），因此识别个体变得尤为重要。家畜标记涂料和标记笔需每日涂抹，而本方案采用医用胶带配合少量耳标胶进行固定。胶带在毛发较长的猪只身上粘附效果最佳。毛发较短且皮肤干燥的猪只更容易脱落胶带。
未来应用：
总之，本文所述的非侵入性圈养猪只HAT检测方法具有足够灵敏度，可检测猪在轻度创伤性脑损伤（mTBI）后出现的轻微且随时间变化的行为改变。此外，我们开发了一种称为AI的加权指数，用于评估饲养在不同类型圈舍中的猪以及不同品种猪的行为变化。尽管HAT已被用于检测经历mTBI的猪的行为变化，但该行为学检测方法也可用于检测处于应激状态或前病理状态动物的可测量行为改变。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者感谢美国海军研究办公室（资助编号 #12166253）提供的经费支持。此外，作者诚挚感谢堪萨斯州立大学和弗吉尼亚理工大学的动物护理人员、兽医及学生在动物实验过程中给予的支持。作者还感谢 Nadège Krebs 提供的技术协助，以及学生 Shelby Stair、Sarah Greenway 和 Mikayla Goering 提供的技术协助和额外的动物护理工作。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 300万像素圆顶摄像机，配备2.8-12 mm镜头，设置在2.8-3.2 mm之间 | Points North Surveillance，缅因州奥本 | CDL7233S | 低矮栏舍需使用较小毫米值的镜头 |
| Manfrotto 244 摩擦臂套件 | B&H Photo | B&H # MA244; MFR # 244 | 用于将摄像机以90°角固定安装 |
| 视频录制系统 | Points North Surveillance，缅因州奥本 | NVR-RACK64 | NVR为定制型号 |
| 彩色图案胶带粘附于双面医用级胶带 | MBK Tape Solutions，加利福尼亚州查茨沃思 | 3M 1522H | 用于猪只的可持续标记 |
| 接近指数公式生成器 | Dinasym，堪萨斯州曼哈顿 | Approach Formula | 公司可根据实验室特定需求定制宏程序 |
| Geovision 软件 | Points North Surveillance，缅因州奥本 | Geovision | 用于将视频时间编辑为180秒片段的软件 |
| 训练用点击器 | Petco | Good2Go 犬类训练点击器 | |
| 奖励食物（饲料颗粒、无花果干、葡萄干、棉花糖） | 可变 | N/A | 由于先前暴露情况不同，成年猪在接触新食物时表现出明显的恐新性。 限饲猪可给予少量饲料颗粒作为奖励。 |
| 统计分析系统（SAS） | SAS Institute，北卡罗来纳州凯里 | SAS 9.0 | 本实验室用于分析混合模型和重复测量数据的首选软件 |
| Observer 11.5 软件 | Noldus Information Technology，弗吉尼亚州利斯堡 | Observer 11.5 | 用于手动为视频片段添加时间戳的软件 |
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