本方案描述了利用多色4D（延时3D）共聚焦显微镜对出芽酵母中荧光标记的细胞内区室进行分析的方法。成像参数的选择旨在获取足够信号的同时尽量减少光损伤。通过定制的ImageJ插件，可对标记结构进行追踪和定量分析。
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本文内容
摘要
摘要
本实验方案的目的是表征出芽酵母活细胞中膜区室的形成与转化过程。酵母细胞内的许多区室具有动态特性，要全面理解其性质，需要进行时间序列成像。多色4D共聚焦荧光显微镜是一种强大的方法，可用于在5–15分钟的时间尺度上追踪细胞内区室的行为和组成。对区室动态进行严谨分析需要采集数千张光学切片。为实现这一目标，需在极低激光功率下快速扫描，以最大限度减少光漂白和光毒性，同时将像素尺寸和Z轴步进间隔设置为与全分辨率采样兼容的最大值。由此获得的4D数据集虽然存在噪声，但可通过去卷积进行平滑处理。即使数据质量较高，分析阶段仍具挑战性，因为细胞内结构通常数量众多、形态异质且具有移动性。为满足这一需求，已开发了定制的ImageJ插件，用于在计算机屏幕上排列4D数据、识别感兴趣结构、编辑数据以分离单个结构、量化荧光时间变化，并生成Z栈投影的动态影像。4D影像特别有助于区分稳定的区室与通过成熟过程短暂存在的区室。此类影像还可用于表征区室融合等事件，并检验特定突变或其他干扰因素的影响。
引言
内膜系统的各个区室始终处于动态变化之中，对其进行全面表征需要进行活细胞成像。本文所述的方案采用4D（延时3D）共聚焦显微镜技术，用于观察出芽酵母中荧光标记的区室。该方法最初开发用于追踪Pichia pastoris和Saccharomyces cerevisiae1,2,3中的分泌区室动态。本方案聚焦于S. cerevisiae，其高尔基体不形成堆叠结构，各个单个囊泡在光学上可分辨4。S. cerevisiae独特的高尔基体结构使得通过4D显微镜观察成为可能：一个高尔基体囊泡最初被定位于顺式高尔基体的标志蛋白标记，随后失去这些蛋白，同时获得位于反式高尔基体的标志蛋白3,5。这种转变可通过构建一种酵母菌株来实现可视化，其中早期高尔基体蛋白Vrg4标记GFP，晚期高尔基体蛋白Sec7标记单体红色荧光蛋白。在追踪单个囊泡时，成熟过程表现为由绿色向红色的转变3。此类分析可提供有关蛋白质定位和区室身份的重要信息。例如，在静态图像中，两个到达和离开时间略有差异的蛋白质可能看似定....
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方案
1. 准备
- 制备非荧光性最低限度NSD培养基2。不含核黄素可降低细胞内背景绿色荧光及其相关的光毒性。
- 将酵母菌株在50 mL带挡板的锥形瓶中，于约23 °C条件下，在5 mL NSD培养基中过夜培养至对数生长期，保持良好通气。在分析前约3–4小时，用新鲜NSD 稀释酵母培养物，使成像时终末OD600为0.5–0.8。
- 配制2 mg/mL的刀豆球蛋白A（ConA）溶液。如需要，可用液氮将该溶液分装后冻存于-80 °C。
- 将ConA溶液在微量离心机中以最大转速离心5分钟，以去除可能干扰成像的颗粒物质。然后取250 µL上清液加入洁净的35 mm玻璃底共聚焦培养皿中。15分钟后，用2 mL去离子水（dH2O）洗涤2–3次，并使其自然干燥。
- 向ConA包被的培养皿中加入250 µL酵母培养物，静置10分钟使细胞贴附，随后用2 mL NSD轻柔洗涤2–3次，并加入2 mL新鲜NSD覆盖细胞。
2. 成像
- 使用63倍或100倍油镜。数值孔径（NA）为1.40已足够，但也可使用更高NA的物镜。
- 将帧尺寸设置为256 × 128（宽 × 高）。如果需要更大的帧尺寸，只要共聚焦显微镜配备谐振扫描器，增加宽度不会降低扫描速度。
- 调整缩放倍数，....
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结果
此处给出的示例通过双色4D共聚焦显微镜3记录并量化了两种酵母高尔基体囊腔的成熟过程。一个酵母细胞含有约10–15个高尔基体囊腔，每个囊腔的成熟过程持续大约2–4分钟。可通过将早期高尔基体标志物Vrg4与GFP标记，以及将晚期高尔基体标志物Sec7与mCherry或mScarlet等红色荧光蛋白标记，来可视化该成熟过程。单个囊腔最初被Vrg4标志物标记，随后经历一个短暂的过渡阶段，在此期间标志物发生交换，最终被Sec7标志物标记。
由于细胞内含有多个高度动态的高尔基体囊腔，因此在整个标记期间追踪单个囊腔具有挑战性。鉴于图像数据在时间和空间分辨率上的限制，囊腔之间的距离通常过于接近，难以被明确区分。此外，高尔基体囊腔偶尔会发生融合14，而晚期高尔基体囊腔倾向于在极性生长位点处聚集15。因此，一段4D影像通常只能提供.......
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讨论
对酵母细胞器进行4D共聚焦成像需要仔细优化多个参数。主要关注的问题是光漂白和光毒性。典型的4D视频需要采集数千个光学切片，因此必须尽可能降低激光照射强度。可使用串联荧光蛋白标签来增强信号，而无需提高被标记蛋白的表达水平16,17。提高扫描速度有助于减少光损伤，同时也能以足够短的时间间隔采集Z轴堆栈图像。在XY和Z方向上均达到奈奎斯特采样极限的体素尺寸，可在理论上最大限度地还原光学系统所能提供的信息，同时最小化光照暴露18。最终，在光学切片中信号区域的每个体素通常仅接收到1–3个光子。这一信息量远低于单次Z轴堆栈成像或去卷积处理通常推荐的最佳成像条件。但去卷积仍可通过平滑噪声信号提供帮助，此类数据集仍可进行分析与定量。
即使拥有高质量的4D数据集，对标记细胞器的追踪仍是一项复杂的任务。通过此处提供的ImageJ插件，研究人员可以在计算机屏幕上排列每个Z-stack，并能够方便地在不同时间点以及原始数据与编辑后的数据之间来.......
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披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
本工作由美国国立卫生研究院（NIH）资助项目R01 GM104010支持。感谢Vytas Bindokas和Christine Labno在整合显微成像核心设施（Integrated Microscopy Core Facility）对荧光显微镜实验提供的协助，该设施由NIH资助的癌症中心支持项目P30 CA014599支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 35 mm 玻璃底培养皿，1.5 号 | MatTek | P35G-0.170-14-C | 成像用培养皿 |
| 刀豆蛋白 A 粉末 | Sigma-Aldrich | C2010 | |
| Trolox | Vector Laboratories | CB-1000 | |
| Leica SP8 共聚焦显微镜 | Leica Microsystems | ||
| Leica Application Suite X | Leica Microsystems | 显微镜软件 | |
| Huygens Essential 软件，版本 17.04 | Scientific Volume Imaging | 去卷积软件 | |
| ImageJ | NIH | 图像处理与分析软件 |
参考文献
- Bevis, B. J., Hammond, A. T., Reinke, C. A., Glick, B. S. De novo formation of transitional ER sites and Golgi structures in Pichia pastoris. Nature Cell Biology. 4 (10), 750-756 (2002).
- Day, K. J., Papanikou, E., Glick, B. S. 4D confocal imaging of yeast organelles. <....
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重印与许可
