建立双人源化TK-NOG小鼠模型用于研究HIV相关性肝病发病机制

摘要

本方案提供了一种可靠的方法，用于建立同时具有人类免疫系统和肝细胞的人源化小鼠模型。双重建免疫缺陷小鼠实现 通过 人肝细胞和CD34的脾内注射⁺ 造血干细胞易受人类免疫缺陷病毒-1感染，并可重现HIV感染者患者中观察到的肝脏损伤。

摘要

尽管感染人类免疫缺陷病毒-1（HIV-1）患者的预期寿命有所延长，但肝病已成为其发病的主要原因之一。HIV-1引起的肝脏免疫病理机制仍不明确。通过移植人肝细胞和人免疫系统的小型异种移植动物模型，可重现该疾病发病过程中的人类生物学特征。本文描述了一种通过移植人肝细胞和CD34⁺造血干细胞/祖细胞（HSPCs）建立双重人源化小鼠模型的实验方案，用于研究HIV感染患者中观察到的肝脏免疫病理变化。为实现双重重建，雄性TK-NOG（NOD.Cg-Prkdc^scid Il2rg^tm1Sug Tg(Alb-TK)7-2/ShiJic）小鼠经腹腔注射更昔洛韦（GCV）以清除小鼠转基因肝细胞，并使用白消安进行非清髓性预处理，这两种处理均有助于人肝细胞（HEP）的植入和人免疫系统（HIS）的发育。通过检测人白蛋白（ALB）水平评估肝脏细胞植入情况，通过流式细胞术检测外周血中人免疫细胞的存在以确认人免疫系统的建立。本方案所建立的模型再现了HIV-1感染所致肝损伤的多个特征。该模型的建立对于研究肝炎病毒共感染以及抗病毒和抗逆转录病毒药物的评价具有重要意义。

引言

自从抗逆转录病毒治疗问世以来，与单纯HIV-1感染相关的死亡率已显著下降。然而，肝病已成为HIV感染者中常见的发病原因^1,2。HIV-1感染合并肝炎病毒感染的情况更为普遍，在美国，约有10%至30%的HIV感染者存在此类合并感染^3,4,5。

HIV-1 和肝炎病毒的宿主特异性限制了小型动物模型在研究人类特异性传染病或多方面探究 HIV-1 相关性肝病发病机制中的应用价值。允许移植人类细胞和/或组织的免疫缺陷小鼠（称为人源化小鼠模型）是适用于临床前研究的动物模型。^6,7,8自21世纪初人源化小鼠问世以来，已有多个针对胆汁淤积性人类肝毒性、人类特异性病原体（包括HIV-1及HIV相关性神经认知障碍、EB病毒、肝炎）及其他传染性疾病的临床前研究在这些小鼠模型中开展^6,9,....

方案

本方案已获得内布拉斯加医学中心大学机构动物护理和使用委员会（IACUC） 的批准。

注意：在对动物进行实验之前，须获得当地动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。

1. 脐带血的处理及人HSPCs的分离

1. 在超净工作台内，所有步骤均需在无菌条件下进行。
2. 取肝素抗凝管采集的脐带血，加入磷酸盐缓冲液（PBS）将体积补至35 mL。按图示方法将样品叠加于淋巴细胞分离液（LSM）上层 图1 并以400 × g离心LSM与分层CB的混合物 x g 4 °C 下离心 35 分钟，不使用刹车。
   注意：应小心轻柔地稀释血液，以避免在界面处发生混合。 
3. 小心移除上层LSM和血浆层，用移液管将白色的血沉棕黄层界面转移至新管中。
4. 将白膜层重悬于30–40 mL预冷缓冲液（PBS + 0.5% 牛血清白蛋白[BSA] + 2 mM 乙二胺四乙酸[EDTA]）中。用移液器将20 µL细胞悬液与20 µL 0.4%台盼蓝混合，再吸取10 µL混合液加入细胞计数板两个计数室中任意一个的外侧加样口，随后将计数板插入自动细胞计数仪进行细胞计数。
   注意： 所有步骤均使用冰冻缓冲液，因....

结果

通过简单的ELISA和流式细胞术，可分别在每一步轻松监测具有人源肝脏和免疫细胞的双人源化小鼠模型的建立情况。定期进行流式细胞术以评估功能性免疫系统的发育情况，并观察HIV感染对免疫细胞的影响。在双人源化小鼠中，功能性免疫细胞在淋巴细胞门控中的比例可介于15%至90%之间。免疫细胞的代表性亚群以点图形式展示（图3）。为评估人源肝细胞的移植情况，每月对小鼠血清进行针对人特异性白蛋白水平的ELISA检测。同时移植了HSPCs和HEPs的小鼠，在移植后一个月时人特异性白蛋白水平范围约为~7 µg/mL至377 µg/mL，并在观察期间（6个月）持续升高（图4）。通过流式细胞术监测HIV感染对双人源化小鼠血液中人源免疫细胞的影响，同时通过人特异性白蛋白ELISA检测肝脏中HEPs的变化。感染5周后，ELISA检测显示HIV-1导致小鼠血清中人源白蛋白水平下降；免疫组织化学分析显示，双人源化小鼠肝组织切片中人源CK18⁺肝细胞减少（

讨论

在 HIV 感染患者中，肝脏会受到损害和损伤²⁴。尽管已有少数共移植 CD34⁺ HSPC 和肝细胞的动物模型，但在 HIV-1 存在的情况下用于研究人类肝脏疾病的实验性小型动物模型仍然极为有限^7,12,25。在体外实验中，肝细胞被证实可发生低水平的 HIV-1 感染²⁶。同时携带两类人类细胞的人源化小鼠是一种理想的模型。已有研究表明，在仅重建人类免疫系统的小鼠中，当实验性清除人类调节性 T 细胞时，其肝脏会受到 HIV 感染的影响^20,27。然而，小鼠与人类肝细胞在免疫和功能特性上的差异，可能是两者对 HIV-1 及免疫细胞反应不同的根本原因。本综述描述了一种同时重建人类免疫系统和肝脏的实验方案，旨在研究在 HIV-1.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
27 G1/2" 针头	BD 生命科学	305109
30 G1/2" 针头	BD 生物科学	305106
5 mL 聚苯乙烯  圆底试管 12 mm x 75 mm 型	康宁	352054
BD 1 mL 无针结核菌素注射器	BD 生物科学	309659
BD FACS array 生物分析仪	BD 生物科学		用于检测洗脱CD34的纯度+ 细胞
BD FACS array 软件	BD 生物科学		用于分析获取的 CD34 的软件+ FACS 阵列上的细胞
BD FACS 溶血液	BD 生物科学	349202	裂解红细胞
BD LSR II	BD Biosciences		流式细胞术样本采集仪器
BD Vacutainer 塑料采血管	BD 生物科学	BD 367874	采集脐带血
牛血清白蛋白	Sigma-aldrich	A9576
布托啡诺			管制药物与止痛药
CD14-PE	BD Biosciences	555398	特异性针对人类
CD19-BV605	BD 生物科学	562653	特异性针对人类
CD34 微珠试剂盒，人	Miltenyi Biotec	130-046-702	用于分离   CD34+ HSPC
CD34-PE，人源	Miltenyi Biotec	130-081-002	用于检测洗脱后CD34纯度的抗体+ 细胞
CD3-AF700	BD Biosciences	557943	特异性针对人类
CD45-PerCPCy5.5	BD 生物科学	564105	特异性针对人类
CD4-APC	BD Biosciences	555349	特异性针对人类
CD8-BV421	BD 生物科学	562428	特异性针对人类
细胞计数板	伯乐（Bio-rad）	1450015
ChargeSwitch gDNA Mini Tissue 试剂盒	赛默飞世尔科技	CS11204	用于从耳组织提取基因组DNA
Cobas Amplicor 系统 v1.5	罗氏分子诊断		使用生物分析仪测量病毒载量
棉签	McKesson	24-106-2S
细胞角蛋白-18（CK18）	DAKO	M7010	特异于人类
DMSO（二甲基亚砜）	Sigma-Aldrich	D2650-5X5ML
微孔滑动夹延长管组，固定式公鲁尔锁接头。长度：60 英寸（152 厘米），流体通路容积：0.55 mL，无菌	BD 生命科学	30914	连接至移液器，并加载HSPC和HEP悬液
FACS Diva 版本 6	BD Biosciences		流式细胞仪软件所需  样本采集
胎牛血清（FBS）	Gibco	10438026
FLOWJO 分析软件 v10.2	FLOWJO, LLC		流式细胞术分析软件
更昔洛韦	APP Pharmaceuticals, Inc.	315110	处方药
Greiner MiniCollect EDTA 管	Greiner bio-one	450475
肝细胞解冻培养基	Triangle Research Labs	MCHT50
Horizon 开放式结扎夹施夹器	Teleflex	537061	用于固定结扎夹
Hospira 注射用无菌水	ACE外科用品公司股份有限公司	001-1187	用于稀释布托啡诺（镇痛剂）
人白蛋白ELISA定量试剂盒	贝赛特实验室	E80-129	用于检测小鼠血清中人白蛋白水平
人肝细胞	Triangle Research Labs	HUCP1	冷冻保存的人类肝细胞，经诱导验证合格
直型虹膜剪	Ted Pella, Inc.	13295
柳叶刀	MEDIpoint	金rod 5 mm
LS柱	Miltenyi Biotec	130-042-401	用于捕获 CD34+ 微珠（阳性筛选）
淋巴细胞分离液（LSM）	MP Biomedicals	50494	用于分离   外周血淋巴细胞
MACS 多功能支架	美天旎生物技术	130-042-303	持有 Quadro MACS 分离器和 LS 柱
麦克弗森-范纳斯微型解剖弹簧剪	Roboz外科器械公司	RS-5605	用于在皮肤上做切口以暴露脾脏
显微解剖镊	Roboz外科器械公司	RS-5157	将脾脏从腹腔中拉出
小鼠 CD45-FITC	BD Biosciences	553080	小鼠特异性的
PBS（磷酸盐缓冲液）	Hyclone	SH30256.02
Qudro MACS 分离器	Miltenyi Biotec	130-090-976	包含四列 LS 柱
RPMI 1640 培养基	Gibco	11875093
StepOne Plus 实时荧光定量 PCR	应用生物系统公司		使用的仪器  以  基因型
Stepper系列重复分配移液器 1ml	DYMAX 公司	T15469	用于  分配  以受控方式移植 HSPC 和 HEP 悬液
Suturevet PGA 合成可吸收缝合线	Henry Schein 动物健康	41178	皮肤和腹膜缝合
TaqMan 基因表达预混液	赛默飞世尔科技	4369016
TC20自动化细胞计数仪	伯乐（Bio-rad）	1450102
TK-NOG小鼠			由日本实验动物中央研究所（CIEA，日本；Mamoru Ito 博士和 Hiroshi Suemizu 博士）提供
曲奥舒凡	Medac GmbH		由以下提供  Dr. Joachim Baumgart（medac GmbH）
台盼蓝	伯乐（Bio-rad）	1450022
Vannas型显微剪刀，直型，80毫米长	Ted Pella, Inc.	1346	用于切开皮肤以暴露脾脏
Weck止血夹 传统钛合金结扎夹	Esutures	523700	注射后结扎脾脏