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建立双人源化TK-NOG小鼠模型用于研究HIV相关性肝病发病机制

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DOI：

10.3791/58645

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2019年9月11日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Pharmacology and Experimental Neuroscience, University of Nebraska Medical Center, 2Department of Pathology and Microbiology, University of Nebraska Medical Center

本文内容

摘要

本方案提供了一种可靠的方法，用于建立同时具有人类免疫系统和肝细胞的人源化小鼠模型。双重建免疫缺陷小鼠实现 通过 人肝细胞和CD34的脾内注射+ 造血干细胞易受人类免疫缺陷病毒-1感染，并可重现HIV感染者患者中观察到的肝脏损伤。

摘要

尽管感染人类免疫缺陷病毒-1（HIV-1）患者的预期寿命有所延长，但肝病已成为其发病的主要原因之一。HIV-1引起的肝脏免疫病理机制仍不明确。通过移植人肝细胞和人免疫系统的小型异种移植动物模型，可重现该疾病发病过程中的人类生物学特征。本文描述了一种通过移植人肝细胞和CD34+造血干细胞/祖细胞（HSPCs）建立双重人源化小鼠模型的实验方案，用于研究HIV感染患者中观察到的肝脏免疫病理变化。为实现双重重建，雄性TK-NOG（NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Sug Tg(Alb-TK)7-2/ShiJic）小鼠经腹腔注射更昔洛韦（GCV）以清除小鼠转基因肝细胞，并使用白消安进行非清髓性预处理，这两种处理均有助于人肝细胞（HEP）的植入和人免疫系统（HIS）的发育。通过检测人白蛋白（ALB）水平评估肝脏细胞植入情况，通过流式细胞术检测外周血中人免疫细胞的存在以确认人免疫系统的建立。本方案所建立的模型再现了HIV-1感染所致肝损伤的多个特征。该模型的建立对于研究肝炎病毒共感染以及抗病毒和抗逆转录病毒药物的评价具有重要意义。

引言

自从抗逆转录病毒治疗问世以来，与单纯HIV-1感染相关的死亡率已显著下降。然而，肝病已成为HIV感染者中常见的发病原因1,2。HIV-1感染合并肝炎病毒感染的情况更为普遍，在美国，约有10%至30%的HIV感染者存在此类合并感染3,4,5。

HIV-1 和肝炎病毒的宿主特异性限制了小型动物模型在研究人类特异性传染病或多方面探究 HIV-1 相关性肝病发病机制中的应用价值。允许移植人类细胞和/或组织的免疫缺陷小鼠（称为人源化小鼠模型）是适用于临床前研究的动物模型。6,7,8自21世纪初人源化小鼠问世以来，已有多个针对胆汁淤积性人类肝毒性、人类特异性病原体（包括HIV-1及HIV相关性神经认知障碍、EB病毒、肝炎）及其他传染性疾病的临床前研究在这些小鼠模型中开展6,9,10,11多种用于CD34的鼠类模型+ HSPCs 和/或人肝细胞移植已长期发展并不断改进，用于研究乙型肝炎病毒（HBV）相关肝病的疾病发病机制12,13,14. 多种用于造血干细胞祖细胞（HSPC）和人肝细胞（HEP）移植的模型基于NOG（NOD.Cg-）品系Prkdcscid Il2rgtm1Sug/JicTac)8,13，NSG（NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ)15，Balb/C-Rag2-/- γc-/- (Rag2tm1.1Flv Il2rgtm1.1Flv/J)12和 fah-/- NOD rag1-/-il2rγnull 小鼠16然而，每种模型都有其自身的优势和局限性；例如，AFC8双人源化小鼠在Balb/C-Rag2背景下用于肝内皮细胞（HEPs）和人类造血干细胞（HSCs）研究-/- γc-/- 背景能够实现免疫细胞和造血干细胞的成功植入，但该模型中缺乏抗原特异性的T细胞和B细胞反应12重建双人源化小鼠的主要问题包括移植效果不理想、缺乏支持不同组织的合适模型、条件不匹配、免疫排斥或移植物-与移植物抗宿主病（GVHD），以及技术上的困难，例如对新生儿进行有风险的操作，以及因代谢异常导致的高死亡率13.

尽管人源化小鼠已用于HIV研究多年17,18,19，但将其用于研究HIV-1所致肝损伤的报道仍较为有限20。我们此前报道了双人源化TK-NOG小鼠模型的建立及其在HIV相关肝病研究中的应用8。该模型可实现肝细胞与免疫细胞的高效植入，并重现HIV感染的致病过程。本文详细阐述了该模型的实验方案，包括人肝细胞移植过程中最关键的步骤。同时描述了成功植入肝细胞（HEPs）并重建TK-NOG小鼠功能性免疫系统所需的人造血干细胞和祖细胞（HSPCs）的特性。此外，还详细说明了利用该模型研究HIV相关肝脏免疫病理机制的方法。实验采用携带肝特异性单纯疱疹病毒1型胸苷激酶（HSV-TK）转基因的雄性TK-NOG小鼠。表达该转基因的小鼠肝细胞在短暂暴露于无毒剂量的更昔洛韦（GCV）后可被有效清除。移植的人肝细胞可在小鼠肝脏中稳定存留，无需使用外源性药物维持21。同时，小鼠还需预先接受非清髓剂量的曲奥舒凡处理，以在小鼠骨髓中为人类细胞腾出生态位8。将免疫缺陷型TK-NOG小鼠经脾内注射人肝细胞（HEPs）和多能造血干细胞和祖细胞（HSPCs）。随后定期通过血液免疫表型分析和血清中人白蛋白水平检测，分别监测血液和肝脏的重建情况。当小鼠体内人免疫细胞和肝细胞重建水平均成功达到15%以上时，经腹腔注射HIV-1病毒。感染后4至5周即可评估HIV对肝脏的影响。需要特别注意的是，由于使用了HIV-1病毒，在操作病毒及对小鼠进行注射时必须采取所有必要的安全防护措施。

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方案

本方案已获得内布拉斯加医学中心大学机构动物护理和使用委员会（IACUC） 的批准。

注意：在对动物进行实验之前，须获得当地动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。

1. 脐带血的处理及人HSPCs的分离

  1. 在超净工作台内，所有步骤均需在无菌条件下进行。
  2. 取肝素抗凝管采集的脐带血，加入磷酸盐缓冲液（PBS）将体积补至35 mL。按图示方法将样品叠加于淋巴细胞分离液（LSM）上层 图1 并以400 × g离心LSM与分层CB的混合物 x g 4 °C 下离心 35 分钟，不使用刹车。
    注意：应小心轻柔地稀释血液，以避免在界面处发生混合。 
  3. 小心移除上层LSM和血浆层，用移液管将白色的血沉棕黄层界面转移至新管中。
  4. 将白膜层重悬于30–40 mL预冷缓冲液（PBS + 0.5% 牛血清白蛋白[BSA] + 2 mM 乙二胺四乙酸[EDTA]）中。用移液器将20 µL细胞悬液与20 µL 0.4%台盼蓝混合，再吸取10 µL混合液加入细胞计数板两个计数室中任意一个的外侧加样口，随后将计数板插入自动细胞计数仪进行细胞计数。
    注意： 所有步骤均使用冰冻缓冲液，因其有助于保持细胞活性。
  5. 以 300 x g 4 °C下离心10分钟，小心吸除上清液。随后加入300 µL预冷缓冲液。
  6. 加入100 µL人Fc受体封闭试剂和100 µL与单克隆小鼠抗人CD34抗体偶联的微珠，适用于最多1 x 10⁸个细胞8 细胞（参见 材料表）。在 4 °C 下孵育 30 分钟，加入 10 mL 预冷缓冲液洗涤细胞，然后在 300 x g 4 °C 下离心 10 分钟。
    注意： 根据细胞数量按比例放大，若细胞数量超过 1 x 108 细胞存在。
  7. 小心吸除上清液，将沉淀重悬于500 µL缓冲液中，随后进行磁分离步骤以富集HSPCs。
  8. 放置一个阳性选择LS柱（参见 材料表) 在磁性激活细胞分选磁场中用 3 mL 缓冲液冲洗并使其流过。
  9. 将样本加载至LS柱中，该柱可捕获样本中与人CD34+结合的微珠，让样本在重力作用下流入收集管。
  10. 用缓冲液洗涤柱子3次，并将洗脱液收集到CD34的同一收集管中- 细胞比例
  11. 用5 mL缓冲液冲洗柱子以洗脱CD34+ 细胞转移至新的收集管中。重复该步骤以获得所需的纯度 >90%.
  12. 计数洗脱的 CD34+ 使用台盼蓝染色法在血细胞计数板中对细胞进行计数。计数后，离心 CD34+ 300 × 下的细胞 g 5 分钟后弃去上清液。
  13. 重悬 CD34+ 25 µL PBS 中的细胞，用于立即进行移植注射 或以1-2×10⁶个/mL的浓度将细胞悬浮于冻存液（RPMI 1640培养基 + 50%胎牛血清（FBS）+ 10%二甲基亚砜 [DMSO]）中，进行冻存，以备后续移植使用。
    注意： 移植前务必重新计数活细胞。
  14. 检测CD34的纯度+ 洗脱后，取50 µL悬浮液，加入10 µL PE标记的抗人CD34抗体，于4 °C孵育30分钟。抗体孵育结束后，用PBS洗涤染色细胞，重悬于100 µL PBS中，随后进行流式细胞术分析。另设一管不加抗体的细胞，用于在流式细胞仪中设定门控。
  15. 采集后，通过在前向散射（FSC）与侧向散射（SSC）图上选择感兴趣区域，随后在FSC-面积与FSC-高度图上对单细胞进行设门，以分析数据。在单细胞群体中，基于PE通道与SSC-面积图对CD34阳性细胞进行设门。

2. 人肝细胞移植前的制备

  1. 从液氮中取出冷冻保存的肝细胞，迅速将冻存管浸入水浴中，解冻约 90 - 120 秒。
  2. 打开冻存管盖，将解冻后的肝细胞倒入盛有预温解冻培养基的 50 mL 锥形管中。
  3. 用手轻轻晃动 50 mL 管数秒，使细胞重悬。
    注意：切勿使用涡旋振荡器。
  4. 在室温下以 100 × g 离心 8 分钟，使细胞沉淀。用含 0.1% BSA 的 PBS 洗涤细胞沉淀，并将细胞与新鲜或解冻的 HSPCs（比例为 10:1）在 PBS 中混合，终体积为每只小鼠 80 µL。

3. 人HSPC和肝细胞移植的动物操作、筛选、基因分型及处理

  1. 动物操作
    1. 由于严重的免疫缺陷，需在无菌条件下饲养和操作TK-NOG小鼠。
    2. 始终穿戴实验服、手套、鞋套和口罩，以防止感染可能存在的致病微生物。
    3. 手术过程中使用无菌手套和器械，并全程以无菌操作方式处理动物。
  2. 选择用于实验的TK-NOG小鼠
    1. 通过将雌性TK-NOG小鼠与雄性非TK-NOG同窝小鼠交配繁殖来维持TK-NOG品系群体，并通过基因分型筛选转基因子代。
      注意： 进行基因分型（见步骤3.3），以确定断奶时新生雄性和雌性小鼠中转基因的存在与否。
    2. 选择6至8周龄的雄性小鼠进行移植，因其对GCV介导的表达HSV-TK转基因肝细胞的清除具有高度敏感性21.
    3. 在断奶或手术时对小鼠进行耳标标记以便识别。记录动物的体重和健康状况。
  3. 使用定量实时聚合酶链式反应对HSV-TK转基因的存在进行基因分型
    1. 在断奶时（通常为3至4周龄）进行基因分型。基因分型时，在超净台中剪取小鼠耳组织以保持无菌，随后使用基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA。
    2. 扩增从耳组织提取的基因组DNA 在20 µL反应体系中，加入1 µL上游引物5'-CCATGCACGTCTTTATCCTGG-3'、1 µL下游引物5'-TAAGTTGCAGCAGGGCGTC-3'、0.5 µL FAM探针5′-FAM-AATCGCCCGCCGGCTGC-MGB-3'以及10 µL预混液，于实时荧光定量聚合酶链式反应（PCR）仪中进行扩增，以检测人白蛋白启动子调控的HSV-TK转基因22.
    3. 设定实时 PCR 程序如下：60 °C 预读阶段 30 s，95 °C 保持阶段 10 min，40 个循环（95 °C 变性 15 s，60 °C 退火延伸 1 min），60 °C 后读阶段 30 s。
      注意： Ct值低于22被认定为HSV-TK转基因阳性。
  4. 使用更昔洛韦和曲奥舒凡的治疗
    1. 使用27 G针头，在手术前第7天和第5天，每天两次向TK-NOG小鼠腹腔注射更昔洛韦（GCV）（6 mg/kg），每次注射体积为100 µL生理盐水，以清除小鼠体内的转基因实质细胞（如实验策略图所示） 图2)23.
    2. 手术前第3、2、1天，使用27 G针头，以生理盐水配制非清髓性剂量的曲奥舒凡（treosulfan，1.5 g/kg/天），每只小鼠腹腔注射100 µL进行预处理。
    3. 手术前一天，使用5 mm采血针穿刺下颌静脉，采集2至3滴（约100 µL）血液，通过离心（1,500 x g 4 °C 下离心 10 分钟，用于丙氨酸氨基转移酶（ALT）检测，以评估肝损伤程度。
  5. 手术准备
    1. 手术前，使用剪毛器剃除小鼠切口部位（腹壁左侧）周围的毛发。
    2. 使用小鼠麻醉机，在诱导室中将氧气流速调节至1 L/min，异氟烷流速调节至3%–5%。每次将一只小鼠放入诱导室中进行麻醉。
    3. 将无菌延长管的一端（悬液容纳量为 550 µL；参见 材料表 将一端（按规格）连接至30 G针头，另一端连接至1 mL注射器。
    4. 用移液器吸取混合的HEPs和HSPCs悬液（每只小鼠80 µL，见第2节），将注射器安装至重复移液器的卡槽中，并调节分液器使每次按压释放10 µL。
    5. 小鼠麻醉后（通常在3 - 4分钟后），将异氟烷气流切换至鼻罩，并将异氟烷流速调至2% - 3%。
  6. 小鼠脾内移植人HSPCs与肝细胞
    1. 所有手术步骤均应在层流柜中无菌条件下进行。
    2. 在工作台面上铺上干净的无菌巾，用10%聚维酮碘对每只小鼠身体左侧进行擦拭，随后使用70%异丙醇消毒，然后进行切口操作。
    3. 在腹壁左侧，使用Vanna型剪刀在皮肤、肌肉和腹膜上做一个小切口（长约1～1.5 cm，深约5 mm），切口位置位于肋缘下缘下方约5 mm处，以进入腹腔。
    4. 找到脾脏，用镊子将其轻轻拉至操作区域以便于接触，然后将30 G针头插入脾脏下极。
    5. 松开移液器的推杆，每次分配10 µL，每只脾脏的总量限制在60–80 µL。缓慢撤出针头，使用结扎器以结扎夹夹闭脾脏。
    6. 用无菌 PBS 润湿的棉签将脾脏推回体腔内。 
    7. 使用可吸收缝线缝合腹壁的肌层 间断缝合模式（非连续缝合）。使用不可吸收缝线以间断缝合模式完成皮肤闭合。
    8. 使用温水循环垫以防止小鼠术后体温过低。
    9. 术后10-14天拆除不可吸收缝线。
  7. 术后护理
    1. 当移植动物苏醒后，以0.1 mg/kg剂量经腹腔注射布托啡诺镇痛剂，连续3天，每天2次。
    2. 每天至少观察动物一次，直至其恢复至正常的生理状态。
      注意： 检查每只动物的体重，因为部分小鼠术后可能会出现体重下降。小鼠通常在术后1至2周内恢复至原始体重。

4. 通过ELISA法验证人肝脏的移植效果及通过流式细胞术验证人免疫系统

注意：移植后1个月起，每月分别通过酶联免疫吸附试验（ELISA）和流式细胞术评估人肝组织和免疫系统的重建情况。

  1. 使用采血针从颌下静脉采集血液样本至含EDTA的采血管中，于4 °C条件下以1,500 × g离心10分钟。分离血清，使用人白蛋白ELISA定量试剂盒（见材料表）按照制造商说明书检测人白蛋白水平，以评估移植人肝细胞后小鼠肝脏的植入效率。
    注意：请勿丢弃沉淀物，将沉淀细胞用于流式细胞术分析，以评估人免疫系统的重建情况。
  2. 将无血清的细胞沉淀重悬于35 µL FACS缓冲液（PBS + 2% FBS）中，并加入5 µL小鼠特异性CD45抗体（浓度0.5 mg/mL）、各5 µL人特异性抗体CD45（0.1 mg/mL）、CD3（0.2 mg/mL）、CD8（0.1 mg/mL）和CD19（0.5 mg/mL），以及各20 µL CD4（0.25 mg/mL）和CD14（0.25 mg/mL），在4 °C避光孵育30分钟，以检测CD34+ HSPCs来源的功能性免疫系统的发育情况。
    注意：建议额外设置一管未染色细胞作为对照，用于确定染色细胞的设门范围。
  3. 孵育结束后，将染色后的细胞悬液（约100 µL）转移至聚苯乙烯圆底流式管中，加入2 mL 1×裂解缓冲液（见材料表，用蒸馏水将10×裂解缓冲液按1:9稀释），室温孵育10–15分钟以裂解红细胞。
    注意：通过观察溶液浊度判断红细胞裂解程度。当样品变得透明时，表明裂解已完成。
  4. 裂解完成后，在管中加入3 mL FACS缓冲液，于4 °C以300 × g离心5分钟，收集细胞沉淀。再次加入3 mL FACS缓冲液重悬沉淀，并于4 °C以300 × g离心5分钟，重复洗涤一次。
  5. 用新鲜配制的1%多聚甲醛（PFA）固定细胞，随后在流式细胞仪上获取数据，并使用流式分析软件进行分析。
  6. 分析时，首先在FSC/SSC图上圈选淋巴细胞群体，然后在FSC-area/FSC-height图上进行单细胞设门。
  7. 进一步在单细胞群体中圈选人特异性CD45（hCD45）阳性细胞，并同时包含小鼠特异性CD45（mCD45）设门，以排除来源于小鼠的细胞。根据未染色对照管的设门策略，合理设定染色样本的设门区域。
  8. 圈选hCD45+细胞，以确定CD3+ T细胞和CD19+ B细胞的频率；在T细胞群体中进一步分析CD4和CD8亚群。为评估单核细胞，可在hCD45设门基础上确定CD14+单核细胞的比例。

5. TK-NOG 小鼠的 HIV 感染及其对人源肝脏和免疫系统的影响

  1. 在指定的生物安全二级实验室中操作HIV-1病毒及所有感染小鼠 设施
    警告： 高压灭菌所有感染HIV的废弃物，并置于双层生物危害袋中丢弃。出于安全考虑，处理感染HIV的小鼠时应佩戴防割手套。
  2. 始终穿戴个人防护装备（PPE），包括一次性防护服、鞋套、口罩和双层手套，操作病毒时不得脱卸。
  3. 选择人源CD45重建水平超过15%的小鼠+ 细胞（在步骤4.7中检测）以及血清中存在人血清白蛋白用于HIV-1感染（在步骤4.1中检测）。
  4. 向小鼠注射 1 x 103 至 1 × 104 组织培养感染剂量50（TCID₅₀）50HIV-1ADA 以每只小鼠100–200 µL的体积进行腹腔注射。
  5. 5 周后使用异氟烷（异氟烷蒸气浓度 的 >5%).
  6. 安乐死后，通过心脏穿刺采集小鼠血液至EDTA抗凝管中，用于分离血清，通过ELISA检测人特异性白蛋白水平以评估HIV-1对肝脏的影响（见步骤4.1），并获取血细胞，通过流式细胞术分析人免疫细胞的变化情况（见步骤4.2–4.8）。
    注意： 感染后5周，使用生物分析仪评估小鼠外周病毒载量，以确认其是否感染。
  7. 采血后，取出安乐死小鼠的肝脏。
  8. 进行肝脏切除时，从剑突处开始，在皮肤、肌肉和腹膜上做一条长1.5–2 cm、深0.5 cm的切口，以暴露腹腔。在肝脏与膈肌之间做一垂直于脊柱的切口。提起肝脏，切断其与胃和肠相连的任何膜状组织。
  9. 收集肝脏组织，用4%多聚甲醛固定过夜，随后按照标准免疫组织化学实验方案评估HIV对CK18的影响+ 使用人特异性CK18抗体标记肝细胞8.

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结果

通过简单的 ELISA 和流式细胞术，可分别对具有人源肝脏和免疫细胞的双人源化小鼠模型的每一步建立过程进行便捷监测。流式细胞术通常用于评估功能性免疫系统的发育情况，并观察 HIV 感染对免疫细胞的影响。在双人源化小鼠中，功能性免疫细胞的发育比例可在淋巴细胞门区的 15% 至 90% 范围内。免疫细胞的代表性亚群在点图中展示（图 3）。为评估人源肝细胞的移植情况，每月对小鼠血清进行针对人特异性白蛋白水平的 ELISA 检测。同时移植了 HSPCs 和 HEPs 的小鼠，在移植后一个月时人特异性白蛋白水平范围为约 7 µg/mL 至 377 µg/mL，并在观察期（6 个月）内持续升高（图 4）。通过流式细胞术监测 HIV 感染对双人源化小鼠血液中人源免疫细胞的影响，通过人特异性白蛋白 ELISA 监测对肝脏中 HEPs 的影响。感染 5 周后，ELISA 检测显示 HIV-1 导致血清中人源白蛋白水平下降，免疫组织化学分析显示双人源化小鼠肝组织切片中人源 ...

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讨论

在 HIV 感染患者中，肝脏会受到损害和损伤24。尽管已有少数共移植 CD34+ HSPC 和肝细胞的动物模型，但在 HIV-1 存在的情况下用于研究人类肝脏疾病的实验性小型动物模型仍然极为有限7,12,25。在体外实验中，肝细胞被证实可发生低水平的 HIV-1 感染26。同时携带两类人类细胞的人源化小鼠是一种理想的模型。已有研究表明，在仅重建人类免疫系统的小鼠中，当实验性清除人类调节性 T 细胞时，其肝脏会受到 HIV 感染的影响20,27。然而，小鼠与人类肝细胞在免疫和功能特性上的差异，可能是两者对 HIV-1 及免疫细胞反应不同的根本原因。本综述描述了一种同时重建人类免疫系统和肝脏的实验方案，旨在研究在 HIV-1...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作由美国国立卫生研究院资助项目R24OD018546（资助对象：L.Y.P. 和 S.G.）支持。作者感谢Weizhe Li博士在手术操作方面的帮助，感谢Amanda Branch Woods理学学士、Yan Cheng在免疫组织化学方面的协助，感谢内布拉斯加大学医学中心（UNMC）流式细胞术研究设施的负责人Phillip Hexley博士、Victoria B. Smith理学学士和Samantha Wall理学学士，以及UNMC高级显微镜核心设施的Janice A. Taylor理学学士和James R. Talaska理学学士提供的技术支持。作者感谢CIEA的Mamoru Ito博士和Hiroshi Suemizu博士提供TK-NOG小鼠，感谢Joachim Baumgart博士提供白消安。作者感谢UNMC的Adrian Koesters博士在稿件编辑方面所做的贡献。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
27 G1/2" 针头BD 生命科学305109
30 G1/2" 针头BD 生物科学305106
5 mL 聚苯乙烯  圆底试管 12 mm x 75 mm 型康宁352054
BD 1 mL 无针结核菌素注射器BD 生物科学309659
BD FACS array 生物分析仪 BD 生物科学用于检测洗脱CD34的纯度+ 细胞 
BD FACS array 软件BD 生物科学用于分析获取的 CD34 的软件+ FACS 阵列上的细胞
BD FACS 溶血液BD 生物科学349202裂解红细胞
BD LSR IIBD Biosciences流式细胞术样本采集仪器
BD Vacutainer 塑料采血管BD 生物科学BD 367874采集脐带血
牛血清白蛋白 Sigma-aldrichA9576
布托啡诺管制药物与止痛药
CD14-PEBD Biosciences555398特异性针对人类
CD19-BV605BD 生物科学562653特异性针对人类
CD34 微珠试剂盒，人Miltenyi Biotec130-046-702用于分离   CD34+ HSPC
CD34-PE，人源Miltenyi Biotec130-081-002用于检测洗脱后CD34纯度的抗体+ 细胞 
CD3-AF700BD Biosciences557943特异性针对人类
CD45-PerCPCy5.5BD 生物科学564105特异性针对人类
CD4-APCBD Biosciences555349特异性针对人类
CD8-BV421BD 生物科学562428特异性针对人类
细胞计数板伯乐（Bio-rad）1450015
ChargeSwitch gDNA Mini Tissue 试剂盒赛默飞世尔科技CS11204用于从耳组织提取基因组DNA
Cobas Amplicor 系统 v1.5 罗氏分子诊断使用生物分析仪测量病毒载量
棉签  McKesson24-106-2S
细胞角蛋白-18（CK18）DAKOM7010特异于人类
DMSO（二甲基亚砜）Sigma-AldrichD2650-5X5ML
微孔滑动夹延长管组，固定式公鲁尔锁接头。长度：60 英寸（152 厘米），流体通路容积：0.55 mL，无菌BD 生命科学30914连接至移液器，并加载HSPC和HEP悬液
FACS Diva 版本 6BD Biosciences流式细胞仪软件所需  样本采集
胎牛血清（FBS）Gibco10438026
FLOWJO 分析软件
v10.2		FLOWJO, LLC流式细胞术分析软件
更昔洛韦APP Pharmaceuticals, Inc.315110处方药
Greiner MiniCollect EDTA 管Greiner bio-one450475
肝细胞解冻培养基 Triangle Research Labs MCHT50
Horizon 开放式结扎夹施夹器Teleflex537061用于固定结扎夹
Hospira 注射用无菌水ACE外科用品公司股份有限公司001-1187用于稀释布托啡诺（镇痛剂）
人白蛋白ELISA定量试剂盒贝赛特实验室E80-129用于检测小鼠血清中人白蛋白水平
人肝细胞Triangle Research Labs HUCP1 冷冻保存的人类肝细胞，经诱导验证合格 
直型虹膜剪Ted Pella, Inc.13295
柳叶刀MEDIpoint金rod 5 mm
LS柱 Miltenyi Biotec130-042-401用于捕获 CD34+ 微珠（阳性筛选）
淋巴细胞分离液（LSM）MP Biomedicals50494用于分离   外周血淋巴细胞
MACS 多功能支架美天旎生物技术130-042-303持有 Quadro MACS 分离器和 LS 柱
麦克弗森-范纳斯微型解剖弹簧剪Roboz外科器械公司RS-5605用于在皮肤上做切口以暴露脾脏
显微解剖镊Roboz外科器械公司RS-5157 将脾脏从腹腔中拉出
小鼠 CD45-FITCBD Biosciences553080小鼠特异性的
PBS（磷酸盐缓冲液）HycloneSH30256.02
Qudro MACS 分离器 Miltenyi Biotec130-090-976包含四列 LS 柱
RPMI 1640 培养基Gibco11875093
StepOne Plus 实时荧光定量 PCR 应用生物系统公司使用的仪器  以  基因型
Stepper系列重复分配移液器 1mlDYMAX 公司T15469用于  分配  以受控方式移植 HSPC 和 HEP 悬液
Suturevet PGA 合成可吸收缝合线Henry Schein 动物健康41178皮肤和腹膜缝合
TaqMan 基因表达预混液赛默飞世尔科技4369016
TC20自动化细胞计数仪伯乐（Bio-rad）1450102
TK-NOG小鼠 由日本实验动物中央研究所（CIEA，日本；Mamoru Ito 博士和 Hiroshi Suemizu 博士）提供
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参考文献

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