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qKAT：杀伤细胞免疫球蛋白样受体基因的定量半自动分型

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DOI：

10.3791/58646

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2019年3月6日

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1Department of Pathology, University of Cambridge, 2Department of Physiology, Development and Neuroscience, University of Cambridge, 3Department of Obstetrics and Gynaecology, University of Cambridge School of Medicine, NIHR Cambridge Biomedical Research Centre, 4Centre for Trophoblast Research, University of Cambridge, 5Department of Genetics & Evolution, University of Geneva, 6Royal Papworth Hospital, 7Department of Plant Sciences, University of Cambridge

本文内容

摘要

定量杀伤细胞免疫球蛋白样受体（KIR）半自动分型（qKAT）是一种简单、高通量且经济高效的方法，可用于对KIR基因进行拷贝数分型，从而应用于群体和疾病关联研究。

摘要

杀伤细胞免疫球蛋白样受体（KIRs）是一类表达于自然杀伤（NK）细胞和T细胞表面的抑制性和激活性免疫受体，由19号染色体上的一个多态性基因簇编码。其特征最明确的配体是人类白细胞抗原（HLA）分子，后者由6号染色体上的主要组织相容性复合体（MHC）基因座编码。已有大量证据表明，KIRs在免疫、生殖和移植过程中发挥重要作用，因此建立能够准确进行基因分型的技术至关重要。然而，由于KIR基因之间存在高度的序列同源性，以及等位基因多样性和拷贝数变异，设计出能够准确且高效地对所有KIR基因进行基因分型的方法具有较大挑战。传统方法通常在数据分辨率、通量、成本效益以及实验建立和运行所需时间方面存在局限。本文介绍一种称为定量KIR半自动分型（qKAT）的方法，这是一种高通量多重实时聚合酶链式反应技术，可测定KIR基因座中所有基因的拷贝数。qKAT是一种操作简便的高通量方法，能够提供高分辨率的KIR拷贝数数据，进而可用于推断包含这些基因的结构多态性单倍型的变异情况。这些拷贝数和单倍型数据对于大规模疾病关联研究、群体遗传学研究，以及KIR与HLA之间表达和功能相互作用的探索均具有重要价值。

引言

在人类中，杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)基因座位于19号染色体长臂上的白细胞受体复合体（LRC）内。该基因座长度约为150 kb，包含15个头尾相连排列的KIR基因。目前已知的KIR基因座包括KIR2DL1、KIR2DL2/KIR2DL3、KIR2DL4、KIR2DL5A、KIR2DL5B、KIR2DS1-5、KIR3DL1/KIR3DS1、KIR3DL2-3，以及两个假基因KIR2DP1和KIR3DP1。KIR基因编码具有短（S；激活性）或长（L；抑制性）胞质尾区的二维（2D）和三维（3D）免疫球蛋白样结构域受体，这些受体由自然杀伤（NK）细胞和T细胞亚群表达。KIR基因座内存在的拷贝数变异 形成了基因组成各异的多种单倍型1。非等位基因同源重组（NAHR）被认为是导致单倍型多样性的机制，这种重组由基因紧密的头尾排列方式和高度的序列同源性所促进。全球人群中已报道有超过100种不同的单倍型1,2,3,4。所有这些单倍型可分为两大类：A类和B类单倍型。A类单倍型包含7个KIR基因：KIR3DL3、KIR2DL1、KIR2DL3、KIR2DL4、KIR3DL1和KIR3DL2，这些均为抑制性KIR基因，以及一个激活性KIR基因KIR2DS4。然而，高达70%的欧洲血统个体若为KIR A单倍型纯合子，则仅携带一种无功能的"缺失"形式的KIR2DS45,6。所有其他KIR基因组合构成B类单倍型，其中包括至少一个特定的KIR基因，如KIR2DS1、KIR2DS2、KIR2DS3、KIR2DS5、KIR3DS1、KIR2DL2或KIR2DL5，并且通常包含两个或更多个激活性KIR基因。

HLA I类分子已被确认为某些抑制性受体（KIR2DL1、KIR2DL2、KIR2DL3和KIR3DL1）、激活性受体（KIR2DS1、KIR2DS2、KIR2DS4、KIR2DS5和KIR3DS1）的配体，以及KIR2DL4的配体。其中KIR2DL4是一种独特的KIR，其胞质尾区较长，类似于其他抑制性KIR受体，但在胞外区附近含有一个带正电荷的残基，这是其他激活性KIR受体的共同特征。KIR基因与HLA基因的变异组合影响受体与配体的相互作用，从而在个体水平上塑造自然杀伤（NK）细胞的潜在应答能力7,8。遗传关联研究的证据表明，KIR在抗病毒免疫（例如，人类免疫缺陷病毒[HIV]9和丙型肝炎病毒[HCV]10）、移植成功率11、妊娠障碍风险与生殖成功率12,13、异基因造血干细胞移植（HSCT）后复发的保护作用14,15,16以及癌症风险17中均发挥重要作用。

高度的序列同源性以及等位基因和单倍型的多样性，为准确分型KIR基因带来了挑战。传统的KIR基因分型方法包括序列特异性引物（SSP）聚合酶链式反应（PCR）18,19,20、序列特异性寡核苷酸探针（SSOP）PCR21以及基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）22。这些技术的局限性在于，它们仅能提供个体基因型的部分信息，且操作繁琐耗时。近年来，新一代测序（NGS）技术已被专门应用于KIR基因座的分型。尽管该方法功能强大，但运行成本较高，且进行深入分析和数据核查的过程较为耗时。

qKAT 是一种高通量定量 PCR 方法。与传统方法相比，该方法耗时长且操作繁琐，而 qKAT 可在五天内完成近 1,000 个基因组 DNA（gDNA）样本的检测，同时获得 KIR 基因型及基因拷贝数。qKAT 包含十个多重反应，每个反应靶向两个 KIR 位点以及一个基因组中固定拷贝数的参考基因（STAT6），用于 KIR 基因拷贝数的相对定量23。该检测方法已成功应用于涉及大规模人群队列和疾病群体的研究，包括丙型肝炎病毒（HCV）等传染病、1 型糖尿病等自身免疫性疾病以及子痫前期等妊娠相关疾病，同时也为探索自然杀伤细胞（NK 细胞）功能的研究提供了遗传学基础1,4,24,25,26。

方案

1. DNA 的制备与涂布

  1. 使用分光光度法或荧光法仪器准确测定基因组DNA（gDNA）浓度。
  2. 将DNA稀释至96孔深孔板中，浓度为4 ng/µL。至少包含一个已知拷贝数的gDNA对照样本和一个无模板对照样本。
  3. 将96孔板在450 × g 条件下离心2分钟。
  4. 使用液体处理仪器，将每个样本以四复孔形式分装至384孔qPCR板中，使每孔含有10 ng DNA（2.5 µL/孔）。至少准备十块384孔板，每块用于一个qKAT反应。
  5. 若gDNA来自多个96孔板，每次更换96孔板时，需使用2%次氯酸钠溶液和超纯水对液体处理系统的针头进行全体积清洗。
  6. 将384孔板置于洁净环境中室温孵育至少24小时，使DNA自然风干。

2. 引物和探针的制备

注意：qKAT 包含十个多重反应。每个反应包括三对引物和三个荧光标记的探针，可特异性扩增两个 KIR 基因和一个参考基因。Jiang 等人27发表的探针已进行修改，现使用 ATTO 染料标记寡核苷酸，因其具有更高的光稳定性和更长的信号寿命。预分装的引物组合可从商业途径获得（见材料表）。

  1. 根据表1中给出的稀释比例，为每个反应配制引物组合。
  2. 根据表1配制每个反应的探针组合。在混合探针前，需先对每种探针单独进行测试。

3. 预混液的制备

注意 以下提及的体积适用于在一组10个384孔板上进行一次qKAT反应。

  1. 确保 384 孔板上的基因组 DNA 样品已完全干燥。所有操作均需在冰上进行，并尽可能避免试剂暴露于光照，因为荧光标记的探针对光和热敏感。
  2. 在 4 °C 条件下解冻 qPCR 缓冲液、引物和探针分装样品。
  3. 在冰上配制可满足 10 块 384 孔板使用的预混液，加入 18.86 mL 超纯水、20 mL qPCR 缓冲液、1,000 µL 预先配制的引物混合液以及 180 µL 预先配制的探针混合液（表 2）。
  4. 使用多通道移液器将预混液均匀分配至 96 孔深孔板中，每孔加入 415 µL。将该板置于避光的冰盒中保存。
  5. 使用液体处理仪器，向含有干燥基因组 DNA 的 384 孔板的每个孔中加入 9.5 µL 预混液。用铝箔密封板后立即置于 4 °C 保存。对剩余的板重复此操作，并确保液体处理系统的针头在处理每块板之间用水清洗。
  6. 将 384 孔板在 450 × g 离心 3 分钟，随后在 4 °C 下孵育过夜或 6–12 小时，以充分重悬 DNA 并消除任何气泡。

4. qPCR 检测

  1. 过夜孵育后，在 450 × g 条件下离心 3 分钟，以消除任何残留的气泡。
  2. 为实现自动化，将 qPCR 仪（例如 LightCycler 480）连接至微孔板处理器（参见材料表）。编程微孔板处理器，使其从避光的低温储存位中取出微孔板并放入 qPCR 仪中。
    注意 理论上，该检测可在其他具有兼容光学设置的 qPCR 仪上运行。
  3. 使用以下扩增程序：95 °C 预变性 5 分钟，随后进行 40 个循环，每个循环为 95 °C 变性 15 秒，66 °C 退火延伸 50 秒，并在 66 °C 时收集荧光数据。
  4. 运行结束后，让机器人从 qPCR 仪中取出微孔板，并将其放置到废弃位。

5. 运行后分析

  1. 扩增后，使用qPCR仪器的软件（参见材料表）中的二阶导数最大值法或拟合点法（Fit Points method），按照以下步骤计算定量循环（Cq）值。
  2. 打开qPCR软件，在导航器选项卡中，打开一个反应板的已保存实验文件。
  3. 若使用二阶导数最大值法进行分析，请选择“分析”选项卡，并使用“绝对定量/二阶导数最大值法”创建新分析。
    1. 在创建新分析窗口中，选择分析类型：绝对定量/二阶导数最大值法，子集：所有样本，程序：扩增，名称：Rx-DFO（其中x为反应编号）。
    2. 选择滤光片组合，并选择VIC/HEX/Yellow555 (533-580)，以确保选中STAT6的检测数据。
    3. 对VIC/HEX/Yellow555(533-580)选择颜色补偿，点击计算。对Fam (465-510) 和 Cy5/Cy5.5(618-660) 重复此操作。点击保存文件。
  4. 若使用拟合点法进行分析，请在“分析”选项卡中选择“绝对定量/拟合点法”。
    1. 在创建新分析窗口中，选择分析类型：绝对定量/拟合点法，子集：所有样本，程序：扩增，名称：RxF-DFO（其中x为反应编号）。
    2. 为STAT6及各个KIR基因（Fam/Cy5）选择正确的滤光片和颜色补偿。在噪声带选项卡中，设置噪声带以排除背景噪声。
    3. 在分析选项卡中，将拟合点数设为3，并选择显示拟合点。点击计算，然后点击保存文件。

6. 结果导出

  1. 在qPCR软件中，打开Navigator选项卡，选择Results Batch Export。
  2. 打开保存实验文件的文件夹，将文件移至窗口右侧区域，点击Next，选择导出文件的名称和保存位置。
  3. 选择分析类型为Abs Quant/Second Derivative Max method或Abs Quant/Fit Points，点击Next。确认文件名、导出文件夹和分析类型无误后，点击Next以开始导出过程。
  4. 等待直至Export Status显示为Ok，屏幕将自动跳转至下一步。检查所有选定文件均已成功导出，确保失败文件数 = 0，然后点击Done。
  5. 使用脚本split_file.pl和roche2sds.pl将导出的板文件拆分为每块板的单个反应。
    注意 脚本可通过申请/GitHub获取。

7. 拷贝数计算

  1. 打开拷贝数分析软件（例如 CopyCaller）。选择导入实时 PCR 结果文件，并加载由roche2sds.pl生成的文本文件。
  2. 选择分析，然后通过选择具有已知拷贝数的校准样本或选择最常见拷贝数来进行分析。有关欧洲血统 人群中通常观察到的KIR基因的最常见拷贝数，请参见表5。

8. 数据质量检查

  1. 使用 R 脚本 KIR_CNVdata_analysis_for_Excel_ver020215.R 将所有板的拷贝数数据合并到一个电子表格中。
    注意 脚本可通过申请/GitHub 获取。
  2. 对于不符合已知 KIR 基因连锁不平衡（LD）模式的样本（表 6），需在拷贝数分析软件中重新核查原始数据。

结果

可以通过将文件导出至拷贝数分析软件来进行拷贝数分析，该软件基于ΔΔCq法提供预测和估计的拷贝数。

拷贝数可根据平板上已知拷贝数的对照DNA样本进行预测，或通过输入最常见的基因拷贝数（表5）来确定。图1展示了针对KIR2DL4和KIR3DS1以及参考基因STAT6的反应在一个平板上的结果。KIR2DL4是KIR基因座中的一个框架基因，其最常见的拷贝数为2；而KIR3DS1是一个活化基因，其最常见的拷贝数为1。图中结果显示了在qPCR软件中观察到的PCR扩增曲线以及由qPCR数据生成的拷贝数结果。如图所示，该检测能够区分0、1、2、3和4个KIR基因拷贝数。拷贝数分析软件还支持以饼图或柱状图形式查看整个平板上拷贝数的分布情况。对于拷贝数较高的样本，拷贝数预测的准确性较低。

反应中所用各种材料（包括基因组DNA、缓冲液、引物和探针）的质量均可能影响实验结果的准确性。然而，结果不一致最可能的原因是同一块反应板上不同孔之间DNA浓度的差异。提取的基因组DNA纯度（可通过260/280和260/230比值进行评估）也会影响实验质量。理想的260/280比值应为1.8–2.0，260/230比值应为2.0–2.2。若反应板上DNA浓度分布不均，将导致各样本间的循环阈值（Ct）变异增大，并引起拷贝数估计范围的不一致。图2展示了同一反应板上Ct值差异对拷贝数预测准确性的影响。红线表示样本拷贝数的估计范围，理想情况下应尽可能接近整数值。

拷贝数数据经分析后，可导出为96孔板格式的电子表格文件。我们使用一个R语言脚本（可应要求提供）将作为一组运行的全部10块板的拷贝数数据合并到一个电子表格中。来自主要欧洲血统人群的已发表的KIRs数据可用于预测KIR基因复合体中各基因之间存在的连锁不平衡（LD）规律1。这些预测结果用于对获得的拷贝数结果进行后续验证检查（表6）。不符合基因间预测LD模式的样本可能含有异常的多态性或单倍型结构变异。描述本实验方案的流程图见图3。

开发了一种名为 KIR 单倍型鉴定工具（http://www.bioinformatics.cimr.cam.ac.uk/haplotypes/）的工具，用于从数据集中推断单倍型。该推断基于在欧洲血统人群中观察到的一组参考单倍型列表1。然而，该工具也允许使用自定义的参考单倍型集合。该工具生成三个独立的文件：第一个文件列出样本的所有单倍型组合，第二个文件提供具有最高联合频率的单倍型组合的精简列表，第三个文件列出无法分配单倍型的样本。无法分配单倍型可能提示存在新的单倍型。

qPCR扩增曲线和数据分析；柱状图和饼图显示KIR2DL4、KIR3DS1基因拷贝数。
图1：反应编号5的96孔板代表性结果。（A）本图显示扩增曲线图。（B）本图显示拷贝数分析图。（C）本图显示拷贝数分布情况。请点击此处查看此图的放大版本。

KIR2DL4、Stat6、KIR3DS1 的定量 PCR 扩增曲线；扩增分析图。
图 2：反应编号 5 使用不同 DNA 浓度的实验板代表性结果。 （A）本图显示扩增曲线图。 （B）本图显示拷贝数分析图。 请点击此处查看该图的放大版本。

显示DNA点样、反应体系设置、数据导出和分析的qPCR工作流程图。
图3：qKAT实验方案的流程图。 请点击此处查看该图的放大版本。

检测基因正向引物浓度 (nM)反向引物浓度 (nM)探针浓度 (nM)
编号 13DP1A4F250A5R250P4a150
2DL22DL2F4400C3R2600P5b150
STAT6STAT6F200STAT6R200PSTAT6150
编号 22DS2A4F400A6R400P4a200
2DL3D1F400D1R400P9150
STAT6STAT6F200STAT6R200PSTAT6150
编号 33DL3A8F500A8R500P4a150
2DS4Del2DS4Del2502DS4R2250P5b150
STAT6STAT6F200STAT6R200PSTAT6150
编号 43DL1e4B1F250B1R125P4b150
3DL1e9D4F250D4R2500P9150
STAT6STAT6F200STAT6R200PSTAT6150
编号 53DS1B2F250B1R250P4b150
2DL4C1F200C1R200P5b-2DL4150
STAT6STAT6F200STAT6R200PSTAT6150
编号 62DL1B3F500B3R125P4b150
2DP1D3F250D3R500P9150
STAT6STAT6F200STAT6R200PSTAT6150
编号 72DS1B4F500B4R250P4b150
2DL5D2F500D2R500P9150
STAT6STAT6F200STAT6R200PSTAT6150
编号 82DS3B5F250B5R250P4b150
3DL2e9D4F250D5R125P9150
STAT6STAT6F200STAT6R200PSTAT6150
编号 93DL2e4A1F200A1R200P4a150
2DS4FL2DS4FL2502DS4R2500P5b150
STAT6STAT6F200STAT6R200PSTAT6150
编号 102DS5B6F2200B6R3200P4b150
2DS4C5F250C5R250P5b150
STAT6STAT6F200STAT6R200PSTAT6150

表1：每个qKAT反应中使用的引物和探针的组合与浓度27。

反应 引物分装量 (µL)探针分装量 (µL)
R13DP1A4FA5R2DL2F4C3R2WATERSTAT6FSTAT6RP4AP5BPSTAT6
2DL21001001602402008080606060
R22DS2A2FA6RD1FD1RWATERSTAT6FSTAT6RP4AP9PSTAT6
2DL31601601601601608080806060
注：主混合液中需减少 20 µL 水
R33DL3A8F  A8FBA8R2DS4DELF2DS4R2WATERSTAT6FSTAT6RP4AP5BPSTAT6
2DS4DEL100  1002001001002008080606060
R43DL1E4B1FB1RD4FD4R2WATERSTAT6FSTAT6RP4BP9PSTAT6
3DL1E9100501002003508080606060
R53DS1B2FB1RC1FC1RWATERSTAT6FSTAT6RP4BP5B-2L4PSTAT6
2DL410010080804408080606060
R62DL1B3FB3RD3FD3RWATERSTAT6FSTAT6RP4BP9PSTAT6
2DP1200501002002508080606060
R72DS1B4FB4RD2FD2RWATERSTAT6FSTAT6RP4BP9PSTAT6
2DL52001002002001008080606060
R82DS3B5FB5RD4FD5RWATERSTAT6FSTAT6RP4BP9PSTAT6
3DL2E9100100100504508080606060
R93DL2E4A1FA1R2DS4WTF2DS4R2WATERSTAT6FSTAT6RP4AP5BPSTAT6
2DS4WT80801002003408080606060
R102DS5B6F2B6R3C5FC5RWATERSTAT6FSTAT6RP4BP5BPSTAT6
2DS4TOTAL80801001004408080606060

表2：配制引物和探针组合分装液所需100 µM引物/探针储备溶液的体积（µL）。

名称方向5´ 修饰3´ 修饰序列 (5'→3')长度TmGC%外显子位置
P4a正向FAMBHQ-1TCATCCTGC
AATGTTGGT
CAGATGTCA		276044.44425-451
P4b反向FAMBHQ-1AACAGAACC
GTAGCATCT
GTAGGTCCC
T		2862504576-603
P5b正向ATTO647NBHQ-2AACATTCCA
GGCCGACT
TTCCTCTG		2560525828-852
P5b-2DL4正向ATTO647NBHQ-2AACATTCCA
GGCCGACT
TCCCTCTG		2561565828-852
P9正向ATTO647NBHQ-2CCCTTCTCA
GAGGCCCA
AGACACC		246062.591246-1269
PSTAT6 ATTO550BHQ-2CTGATTCCT
CCATGAGCA
TGCAGCTT		266250

表3：qKAT中所用探针列表1,27。寡核苷酸探针P5b、P5b-2DL4、P9和PSTAT6的5'端所用荧光染料已改为ATTO染料。

基因引物方向序列 (5´-3´)长度Tm GC%外显子位置 扩增子 (bp)可能遗漏的等位基因
3DL2e4A1F正向GCCCCTGCTGAA
ATCAGG		185261.14399-4161793DL2*008, *021, *027, *038.
A1R反向CTGCAAGGACAG
GCATCAA		195352.6559-5773DL2*048 
3DP1A4F正向GTCCCCTGGTGA
AATCAGA		194952.64398-416112无
A5R反向GTGAGGCGCAAA
GTGTCA		185255.6492-509无
2DS2A2F正向GTCGCCTGGTGA
AATCAGA		194952.64398-416111无
A6R反向TGAGGTGCAAAG
TGTCCTTAT		215142.9488-508无
3DL3 A8Fa正向GTGAAATCGGGA
GAGACG		185055.64406-423139无
A8Fb正向GGTGAAATCAGG
AGAGACG		195052.6405-4233DL3*054, 3DL3*00905.
A8R反向AGTTGACCTGGG
AACCCG		185161.1526-543无
3DL1e4B1F正向CATCGGTCCCAT
GATGCT		185155.64549-566853DL1*00505, 3DL1*006, 3DL1*054, 3DL1*086, 3DL1*089
B1R反向GGGAGCTGACAA
CTGATAGG		205255614-6333DL1*00502
3DS1B2F正向CATCGGTTCCAT
GATGCG		185155.64549-566853DS1*047; 可能扩增出 3DL1*054。
B1R反向GGGAGCTGACAA
CTGATAGG		205255614-633无
2DL1B3F正向TTCTCCATCAGT
CGCATGAC		2052504544-563962DL1*020, 2DL1*028
B3R反向GTCACTGGGAGC
TGACAC		185061.1622-6392DL1*023, 2DL1*029, 2DL1*030
2DS1B4F正向TCTCCATCAGTC
GCATGAA		195147.44545-563962DS1*001
B4R反向GGTCACTGGGAG
CTGAC		174964.7624-640无
2DS3B5F正向CTCCATCGGTCG
CATGAG		185361.14546-56396无
B5R反向GGGTCACTGGGA
GCTGAA		185161.1624-641无
2DS5B6F2正向AGAGAGGGGACG
TTTAACC		195052.64475-493173无
B6R3反向TCCAGAGGGTCA
CTGGGC		185366.7630-6472DS5*003
2DL4C1F正向GCAGTGCCCAGC
ATCAAT		185255.65808-82583无
C1R反向CCGAAGCATCTG
TAGGTCT		195252.6872-8902DL4*018, 2DL4*019
2DL22DL2F4正向GAGGTGGAGGCC
CATGAAT		195257.95778-7961512DL2*009; 782G 突变为 A。
C3R2反向TCGAGTTTGACC
ACTCGTAT		205145909-928无
2DS4C5F正向TCCCTGCAGTGC
GCAGC		175770.65803-819120无
C5R反向TTGACCACTCGT
AGGGAGC		195257.9904-9222DS4*013
2DS4Del2DS4Del正向CCTTGTCCTGCA
GCTCCAT		195457.95750-768203无
2DS4R2反向TGACGGAAACAA
GCAGTGGA		205350933-952无
2DS4FL2DS4FL正向CCGGAGCTCCTA
TGACATG		195357.95744-762209无
2DS4R2反向TGACGGAAACAA
GCAGTGGA		205350933-952无
2DL3D1F正向AGACCCTCAGGA
GGTGA		174858.891180-1196156无
D1R反向CAGGAGACAACT
TTGGATCA		2050451316-13352DL3*010, 2DL3*017, 2DL3*01801 和 2DL3*01802
2DL5D2F正向CACTGCGTTTTC
ACACAGAC		20525091214-12331202DL5B*011 和 2DL5B*020
D2R反向GGCAGGAGACAA
TGATCTT		194947.41315-1333无
2DP1D3F正向CCTCAGGAGGTG
ACATACGT		20535591184-1203121无
D3R反向TTGGAAGTTCCG
TGTACACT		2050451285-1304无
3DL1e9D4F正向CACAGTTGGATC
ACTGCGT		195252.691203-1221933DL1*061, 3DL1*068
D4R2反向CCGTGTACAAGA
TGGTATCTGTA		235343.51273-12953DL1*05901, 3DL1*05902, 3DL1*060, 3DL1*061, 3DL1*064, 3DL1*065, 3DL1*094N, 3DL1*098
3DL2e9D4F正向CACAGTTGGATC
ACTGCGT		195252.691203-1221156无
D5R反向GACCTGACTGTG
GTGCTCG		195463.21340-1358无
STAT6STAT6F正向CCAGATGCCTAC
CATGGTGC		205460129
STAT6R反向CCATCTGCACAG
ACCACTCC		205460

表4：qKAT中所用引物的序列1,27。

KIR 基因3DL32DS22DL22DL32DP12DL13DP12DL43DL1
EX9		3DL1
EX9		3DS12DL52DS32DS52DS12DS4
总计		2DS4
全长		2DS4
缺失		3DL2
ex4		3DL2
EX9
最常见拷贝数21122222221111121122

表5：在欧洲来源样本中常见观察到的KIR基因最常见拷贝数。

基于欧洲人群的qKAT连锁不平衡规则拷贝数检测
1KIR3DL3、KIR3DP1、KIR2DL4 和 KIR3DL2 两个单倍型上均存在框架基因。KIR3DL3、KIR3DP1、KIR2DL4 和 KIR3DL2 = 2
2KIR2DS2 和 KIR2DL2 彼此处于连锁不平衡状态2DS2=2DL2
3KIR2DL2 和 KIR2DL3 是同一基因的等位基因2DL2+2DL3=2
4KIR2DP1 和 KIR2DL1 彼此处于连锁不平衡状态2DP1=2DL1
5外显子4 KIR3DL1 和 KIR3DL2 等于第9个外显子 KIR3DL1 和 KIR3DL2 分别。3DL1ex4=3DL1ex9 与 3DL2ex4=3DL2ex9
6KIR3DL1 和 KIR3DS1 是等位基因3DL1+3DS1=2
7KIR2DS3 和 KIR2DS5 与……处于连锁不平衡状态 KIR2DL52DS3+2DS5=2DL5
8KIR3DS1 和 KIR2DS1 处于连锁不平衡状态3DS1=2DS1
9存在  KIR2DS1 和 KIR2DS4T单倍型上的总和是互斥的2DS1+2DS4TOTAL=2
10KIR2DS4FL 和 KIR2DS4del 是……的变体 KIR2DS4TOTAL2DS4FL+2DS4DEL=2DS4TOTAL

表6：在欧洲血统人群中常见的KIR基因之间的连锁不平衡可用于验证拷贝数数据1,27。

讨论

我们描述了一种名为qKAT的新型半自动化高通量方法，该方法可实现拷贝数分型 KIR 基因. 该方法是对SSP-PCR等传统方法的改进，后者通量较低，仅能检测这些高度多态性基因的存在或缺失。

所获得拷贝数数据的准确性取决于多个因素，包括基因组DNA（gDNA）样本的质量和浓度均一性以及试剂的质量。整块板上gDNA样本的质量和准确性极为重要，因为板上各孔间浓度的差异可能导致拷贝数计算出现误差。由于这些检测方法是使用源自欧洲的样本集进行验证的，因此来自世界其他地区人群队列的数据需要进行更全面的核查，以确保等位基因扩增失败或引物/探针非特异性结合等情况不会被误判为拷贝数变异。

尽管这些检测方法的设计和优化旨在实现高通量运行，但也可进行调整以检测较少的样本。当分析的样本数量较少时，拷贝数分析软件中的置信度指标会受到影响，但如果在反应板中加入已知KIR基因拷贝数的对照基因组DNA样本，并增加样本的重复次数，则可改善这一情况。

对于没有液体/板处理机器人的实验室，可以使用多通道移液器分配预混液，并手动将板加载到qPCR仪器中。

开发qKAT的主要目的是创建一种简单、高通量、高分辨率且成本效益高的方法，用于进行疾病关联研究中的KIRs基因分型。这一目标已成功实现，因为qKAT已被应用于多项大规模疾病关联研究中，以探讨KIR在多种传染病、自身免疫性疾病以及妊娠相关疾病中的作用4,24,25,26。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

该项目获得了医学研究理事会（MRC）、欧洲研究理事会（ERC）在欧盟“地平线2020”研究与创新计划（资助协议编号：695551）以及美国国立卫生研究院（NIH）剑桥生物医学研究中心和NIH研究血液与移植研究单位（NIHR BTRU）在器官捐献与移植领域，由剑桥大学与英国国家医疗服务系统血液与移植中心（NHSBT）合作开展的支持。文中观点仅代表作者立场，并不代表英国国家医疗服务系统（NHS）、NIHR、卫生部或NHSBT的官方意见。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
试剂
寡核苷酸Sigma定制订购序列：见表4
ATTO染料标记的探针Sigma定制订购序列：见表3
SensiFAST Probe No-ROX试剂盒BiolineBIO-86020−
MilliQ水−−−
名称公司目录编号备注
设备
配备摆动转子的离心机Eppendorf（或同等产品）Eppendorf 5810R 或同等系统
NanoDropThermo ScientificND-2000
或
Qubit荧光仪Life TechnologiesQ33216
Matrix HydraThermo Scientific109611
LightCycler 480 II 384孔仪器Roche05015243001
Twister II 微孔板操作仪，配备 MéCour 热板堆叠器（MéCour）Caliper Life Sciences204135
涡旋混合器BiosanBS-010201-AAA
单通道移液器（体积范围：0.5–10 µL, 2–20 µL, 20–200 µL, 200–1,000 µL; 1–10 mL）Gilson（或同等产品）F144801, F123600, F123615, F123602, F161201
无RNase和DNase的带滤芯移液器吸头（10 µL, 20 µL, 200 µL, 1,000 µL, 10 mL）Starlab（或同等产品）S1111-3810, S1120-1810, S1120-8810, S1111-6810, I1054-0001
StarTub PS 55 mL 试剂储液槽STARLABE2310-1010
50 mL 离心管STARLABE1450-0200
96孔深孔板Fisher Scientific12194162
LC480 384孔多孔板Roche04729749001
LightCycler 480 密封箔Roche04729757001
名称公司目录编号备注
软件
Roche LightCycler 480 软件 v1.5
Applied Biosystems CopyCaller 软件 v2.1https://www.thermofisher.com/uk/en/home/technical-resources/software-downloads/copycaller-software.html
KIR 单倍型识别工具http://www.bioinformatics.cimr.cam.ac.uk/haplotypes/

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KIR qKAT PCR HLA NK

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