基于血小板中VASP磷酸化检测血液中一氧化氮的方法

摘要

本文介绍了一种利用血小板作为血液中高灵敏度一氧化氮传感器的潜在用途的实验方案。该方案描述了血小板的初始制备过程，以及使用亚硝酸盐和脱氧红细胞作为一氧化氮生成源的方法。

摘要

血小板是负责正常血液凝固的血液成分，其功能受到多种通路的严格调控。一氧化氮（NO）是一种强效的血管活性物质，也可作为血小板聚集的强效抑制剂。由于NO与无细胞血红蛋白具有高度反应性，使其半衰期仅在毫秒级，因此直接检测血液中的一氧化氮极具挑战性。目前，干预后NO水平的变化仅能通过测定亚硝酸盐和硝酸盐（属于硝酸盐-亚硝酸盐-NO代谢通路的成员）的变化来间接估算。尽管这些测量方法具有一定精确性，但其结果却较难解释。 相对于 实际一氧化氮（NO）浓度无变化，这是由于亚硝酸盐和硝酸盐的本底水平天然较高，其浓度比NO本身的预期变化高出数个数量级。因此，开发能够直接、简便检测NO的方法已迫在眉睫。本实验方案探讨了血小板作为血液中高灵敏度NO传感器的潜在应用。方案中描述了富含血小板血浆（PRP）的初步制备、洗涤血小板的制备，以及使用亚硝酸盐和去氧红细胞作为NO生成源的方法。VASP蛋白在丝氨酸239位点的磷酸化（P-VASP）^Ser239) 用于检测一氧化氮（NO）的存在。由于VASP蛋白在血小板中高表达，且在NO存在时可迅速发生磷酸化，这为利用该通路直接检测血液中NO提供了独特的机会。

引言

血小板是由巨核细胞产生的微小盘状细胞碎片，在血液凝固过程中起关键作用。当血管壁受损后，会释放多种生物活性分子（如胶原或ADP），从而启动凝血级联反应。在众多效应分子中，一氧化氮（NO）可调节血液凝固过程。NO由哺乳动物细胞自然产生，是最具多样性的生理信号分子之一，具有强效血管舒张剂、神经递质和免疫调节剂等多种功能。在血液中，NO还能通过抑制血小板聚集来调节凝血程度。血液中NO最可能的来源之一是亚硝酸盐（nitrite），这是一种无机离子，已被证实可作为NO的前体。亚硝酸盐与红细胞（RBCs）反应后被还原为NO，同时脱氧血红蛋白被氧化为高铁血红蛋白（metHb）¹。红细胞释放的NO具有血管活性，可引起血管舒张²。这种亚硝酸盐还原途径是一种替代性的NO生成途径，在缺氧条件下与经典的内皮型一氧化氮合酶（eNOS）介导的NO生成途径协同作用，互为补充。

血小板本身不能将亚硝酸盐还原为一氧化氮（NO），但对NO的存在极为敏感。在完整血小板中，纳摩尔浓度范围内的NO可升高环磷酸鸟苷（cGMP）水平（EC₅₀ = 10 nM）并促进VASP蛋白的磷酸化（EC₅₀ = 0.5 nM）³。因此，血小板可作为红细胞（RBCs）还原亚硝酸盐及向血液中释放NO的优良传感器。目前已有多种方法可直接测量血小板活化程度，例如聚集测定法和血栓弹力图法（TEG）^4,5。然而，这些方法需要昂贵的专用仪器，并消耗较大量的样本。也可通过监测NO从红细胞释放后的下游事件来间接检测，例如检测血小板表面蛋白表达的变化——如P-选择素（P-selectin）⁶。已知NO还可增加血小板内cGMP的含量⁷。此前，我们曾利用cGMP来监测去氧红细胞还原亚硝酸盐后向血液中释放NO的情况⁸。该方法灵敏度高，但cGMP为短寿命分子，其检测过程劳动密集。另一种在本方案中描述的方法，则利用血管扩张剂刺激的磷酸蛋白（VASP）的磷酸化来检测血液中NO的存在。VASP是蛋白激酶G的底物，当NO通过sGC/cGMP通路激活该激酶时，VASP即被磷酸化⁹。在极低浓度的NO条件下即可检测到VASP的磷酸化，这使得血小板成为检测血液中NO存在的高度敏感工具。VASP在血小板中高表达，而在其他血细胞中几乎不表达，因此可选择性地追踪与血小板相关的过程¹⁰。

本方案的主要目标是详细描述利用一氧化氮（NO）与血小板相互作用并通过监测VASP磷酸化来检测全血中NO释放的方法^11,12。所述方法可实现对低浓度NO的早期检测——理论上可达纳摩尔（nM）范围，由于采用了大多数实验室均可实现的标准Western印迹技术，因此本方案比cGMP测定法更为灵敏。

方案

注意： 血液样本来自美国国立卫生研究院血库（经伦理审查批准的方案：99-CC-0168）。

1. 血液样本制备

注意：为避免血小板激活，应缓慢采血，并通过轻轻倒置采血管数次，使血液与枸橼酸盐轻柔混匀。

1. 富血小板血浆（PRP）制备
   1. 使用20 G或更大直径的针头抽取30–50 mL血液，按1:9比例加入含3.8%枸橼酸钠的试管中，或按1:6比例加入含酸性枸橼酸葡萄糖（ACD）（85 mM 枸橼酸三钠，66.6 mM 枸橼酸，111 mM 葡萄糖，pH 4.5）的试管中。
   2. 将5 mL新鲜采集的全血分装至空的15 mL锥形管中。以120 × g离心全血 g 室温下孵育10分钟。
   3. 用塑料移液管小心吸取上层含有血小板的上清液（富血小板血浆，PRP）。
      注意： 步骤 1.1.3 获得的 PRP 可直接用于实验，或进一步处理以制备洗涤血小板。离心后（步骤 1.1.2）得到的松软沉淀物含有红细胞和白细胞，可进一步纯化以获得洗涤红细胞（RBC）——参见步骤 1.3. 实验需在采血后2 h内完成。收集PRP（上清液）时，应避免采集含有在PRP与红细胞界面处聚集的白细胞的血沉棕黄层。
2. 洗涤血小板制备（可选）
   1. 以 400 x g 离心收集的 PRP g 室温下离心10分钟。弃去上清液，保留血小板沉淀。
   2. 轻轻加入5 mL CGS缓冲液（120 mM NaCl、12.9 mM 枸橼酸三钠和30 mM 葡萄糖，pH 6.5）重悬沉淀，然后在400 x g条件下离心 g 室温下孵育10分钟。
   3. 用 3 mL 修饰的 Tyrode 缓冲液（134 mM NaCl，0.34 mM NaH₂PO₄，2.9 mM KCl，12 mM NaHCO₃₃，20 mM HEPES，1 mM MgCl₂，2 mM CaCl₂，10 mM 葡萄糖，pH 7.4。
   4. 用Rees-Ecker溶液将血小板稀释（1:100，例如10 µL血小板加入990 µL Rees-Ecker溶液），用血细胞计数板进行计数。
   5. 将血小板密度调整至 3 x 10⁸ 通过添加Tyrode缓冲液调节至cells/mL。
   6. 将血小板悬液在37 °C孵育1小时，然后开始实验。
      注意： 洗涤后的血小板在37 °C下可稳定保存5–8 h。
3. 洗涤红细胞（RBC）的制备
   1. 收集后，将步骤 1.1.3 中获得的软沉淀在 2,500 x g 室温下孵育10分钟。
   2. 弃去上清液，加入 5 mL PBS 重悬红细胞沉淀，于 2,500 x g 离心洗涤 g 室温下孵育10分钟。重复此步骤3次。
   3. 弃去 PBS，使用洗涤后的红细胞进行后续实验。

2. 脱氧

1. 将1 mL富含血小板血浆（PRP，按步骤1.1.4或1.2.4制备）与红细胞（RBCs，按步骤1.3制备）的混合物，按所需 hematocrit 加入带橡胶塞封闭的聚丙烯瓶中。例如，在20% hematocrit 条件下，将200 µL RBCs加入800 µL PRP中。
   注意：建议 hematocrit 范围为0%至40%。请勿使用玻璃瓶或烧瓶，因为血小板会黏附于玻璃表面。
2. 将连接氦气罐的针头插入密闭瓶中，并插入一支26 G针头作为出气口（图1）。
3. 在室温下缓慢旋转瓶体。
   注意：切勿让氦气在血液样品中形成气泡。本操作推荐使用缓慢的气体流速，过快的氦气流速会导致溶血增加。最有效的气体流速需通过实验确定，因其高度依赖于实验装置的几何结构。
4. 定期使用CO-血氧分析仪检测氧分压（pO₂），以监测去氧过程。
   注意：据我们实验经验，10分钟的去氧处理可使pO₂降至25 mmHg，此水平足以支持红细胞对亚硝酸盐的还原反应。继续去氧可进一步将pO₂降至10 mmHg，但会导致溶血加剧及游离血红蛋白升高（图2）。

3. 红细胞中亚硝酸盐的还原

1. 向 0.0345 g 亚硝酸钠（NaNO₂）中加入 1 mL 磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4），配制成 500 mM 的亚硝酸盐储备液。用磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4）将 500 mM NaNO₂ 进行系列稀释，得到 250 µM NaNO₂（稀释 25 倍）。
2. 使用微量注射器，通过隔垫向去氧处理的 PRP 和红细胞（RBCs）样品中注入 40 µL 亚硝酸盐溶液，使样品总体积为 1 mL 时终浓度为 10 µM。
   注意：本实验中所使用的亚硝酸盐终浓度为 10 µM。
3. 将样品在 37 °C 下孵育 10 分钟或更长时间。
   注意：根据实验类型的不同，调整红细胞与亚硝酸盐孵育的精确时间，以达到最大亚硝酸盐还原效果。
4. 移除密封塞，用移液器将 1 mL 样品转移至微量离心管中。
5. 在室温下以 200 × g 离心 3 分钟。
6. 从上清液上层吸取 300 µL 血小板悬液，按 1:9 的比例与 ACD 溶液（pH 6.5）混合。弃去红细胞沉淀。
7. 将血小板悬液在室温下以 500 × g 离心 4 分钟。
8. 向血小板沉淀中加入 80 µL 冰冷裂解缓冲液（含 150 mM NaCl、50 mM Tris、0.5% NP-40，pH 7.4），并加入蛋白酶抑制剂混合物 III（1:500）。

4. VASP 的蛋白质印迹分析

1. 将每个样品中的 15 µg 蛋白质分别上样至两块独立的 10% SDS-PAGE 凝胶中。
   注意：含有 β-巯基乙醇的强洗脱缓冲液无法从膜上完全去除 P-VASP^Ser239 和 VASP 抗体；因此，P-VASP^Ser239 和 VASP 应分别进行电泳。
2. 以 120 V 电压运行凝胶 1.30 小时，随后将蛋白转移至硝酸纤维素膜。
3. 使用 5% 脱脂奶粉封闭非特异性结合位点。
4. 将膜在 4 °C 条件下与 P-VASP^Ser239（1:500）、VASP（1:1,000）和 GAPDH（1:1,000）抗体共同孵育过夜。
5. 室温下用辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗孵育膜 45 分钟。
6. 使用成像仪对膜进行曝光，并利用 ImageJ 软件定量分析条带密度。

结果

静脉血样本的氧分压（pO₂）值介于 50–80 mmHg 之间。使用氦气去氧可在 10 分钟内迅速将 pO₂ 降至 25 mmHg。延长去氧时间可进一步轻微降低 pO₂。然而，延长去氧时间也会导致游离血红蛋白水平显著升高（通过一氧化碳血氧计测定，在 图 2 中可见血浆颜色逐渐变红）（图 2A–B）。溶血增加与搅拌无关，因为未进行去氧处理的搅拌不会引起溶血（图 2C）。

我们发现，裂解样本中红细胞的存在会降低通过Western印迹检测到的VASP^Ser239磷酸化水平及VASP总量（图3）。因此，在...

讨论

由于血小板易于被激活，因此处理含血小板的样本时需轻柔操作。应避免快速移液和剧烈震荡。可使用前列腺环素（PGI₂）等血小板抑制剂以防止血小板活化；然而，这可能会影响血小板内的某些信号通路。在制备血小板沉淀时，我们在血小板悬液中加入ACD，并采用低速离心。

新鲜制备的富血小板血浆（PRP）中的血小板寿命有限，最多为2小时。为确保高重复性，所有实验均应仅使用新鲜血小板，并在采血后2小时内完成。本文所示数据均来自PRP中的血小板，相较于洗涤血小板，其更具有生理相关性。尽管洗涤血小板的寿命和纯度更高，但在制备过程中反复离心可能导致血小板自发激活，从而造成血小板制备质量不一致。相较于洗涤血小板，PRP更受青睐，因其制备过程更快，且后续操作可能激活血小板。然而，在特定情况下，若血浆凝血因子可能干扰实验体系，则洗涤血小板可作为避免此类问题的解决方案。

在去氧样品中防止氧气污染是本实验最关键的步骤。红细胞（RBCs）可在加入富血小板血浆（PRP）前进行混合和去氧处理。然而，转移已去氧的红细胞会增加氧气污染的风险。此外，浓缩...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
柠檬酸三钠	由 NIH 血库
柠檬酸	由 NIH 血库
葡萄糖	Sigma	G7528-250G
NaCl;氯化钠	Sigma	S-7653 1kg
NaH2PO4; 磷酸钠 一元，一水合	Mallinckrodt Chemical	7892-04
氯化钾	Mallinckrodt 化学	6858
NaHCO3; 碳酸氢钠	Mallinckrodt 化学	7412-12
HEPES;N-[2-羟乙基]哌嗪-N'-[-乙磺酸]	Sigma	H3375-500g
MgCl2 （1 M）;氯化镁	质量生物学	351-033-721
CaCl2; 氯化钙	Sigma	C5080-500G
Nalgene 窄口 HDPE 经济瓶	Nalgene	2089-0001
红色隔膜塞子 NO.29	Fisherbrand	FB57877
NaNO2-; 亚硝酸钠	Sigma	S2252-500G
TRIZMA Base;三[羟甲基]氨基甲烷	Sigma	T8524-250G
NP-40;4-壬基苯基-聚乙二醇	Sigma	74385-1L
蛋白酶抑制剂混合物套装 III	Calbiochem	539134
磷酸化 VASP （Ser239） 抗体	细胞信号技术	3114
VASP 抗体	细胞信号技术	3112
GAPDH （14C10） 兔单克隆抗体	细胞信号技术	2118
2-巯基乙醇	Sigma	M-6250-10ml
过氧化物酶 AffiniPure 山羊抗兔 IgG （H+L）	Jackson Immuno Research Laboratories	111-035-003
Clarity Western ECL 底物	BIO-RAD	1705060-200ml
碳氧血氧仪 （ABL 90 flex）	辐射计