本文介绍了一种利用三维（3D）胸腺培养系统生成肿瘤抗原特异性诱导多能干细胞来源的胸腺移行细胞（iTE）的新方法。iTE 是一类与初始T细胞密切相关的同质性T细胞亚群，具有增殖能力、记忆形成能力以及肿瘤抑制功能。
方法文章
一种用于产生小鼠诱导性多能干细胞来源的肿瘤抗原特异性胸腺移行细胞的三维胸腺培养系统
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
预先重排的T细胞受体（TCRs）的遗传特性及其表观遗传学上的 rejuvenation（再生）使得诱导多能干细胞（iPSC）来源的T细胞成为过继性T细胞治疗（ACT）的一种极具前景的细胞来源。然而，传统的体外从iPSC再生T细胞的方法所产生的T细胞通常表现为类固有样或终末分化的表型，其表型和功能均与初始T细胞显著不同。近期，一种新型的三维（3D）胸腺培养系统被开发出来，可用于生成具有初始T细胞样功能表型的同质性CD8αβ+抗原特异性T细胞亚群，这些细胞具备体内增殖、记忆形成以及肿瘤抑制的能力。该方案避免了异常的发育命运，从而能够生成具有临床相关性的iPSC来源T细胞，被命名为iPSC来源的胸腺移行细胞（iTE），同时也为深入阐明T细胞在胸腺选择后成熟所必需的后续功能提供了有力的研究工具。
引言
过继性T细胞治疗（ACT）对某些晚期癌症患者可能是一种有效的治疗方法。然而，许多患者并未出现肿瘤消退，且输注的T细胞在回输后无法长期存续。这可能与输注T细胞的质量有关。一项ACT小鼠模型研究表明，与初始T细胞或低度分化的中央记忆T细胞相比，终末分化的效应T细胞由于在体内存续能力较差，其治疗效力较低1，这一发现也得到了临床数据的支持2,3。
为了提高现有过继性T细胞治疗（ACT）的疗效，研究人员已对T细胞来源的诱导性多能干细胞（T-iPSC）进行了广泛研究4,5。当T细胞被重编程为T-iPSC并再次分化为T细胞时，T细胞受体（TCR）基因的重排构型会被T-iPSC继承，并进一步传递给再分化产生的T细胞。因此，若由肿瘤抗原特异性T细胞制备T-iPSC，其无限体外扩增的能力可高效地产生携带新抗原特异性T细胞受体（TCR）的未成熟T细胞6,7。然而，将T-iPSC分化为成熟T细胞的具体方法仍有待阐明，该方法的建立将有助于生成具有较低分化状态和更强抗肿瘤活性的癌症抗原特异性T细胞。
利用过表达人源Notch配体DLL1的OP9小鼠基质细胞与诱导性多能干细胞（iPSC）共培养来诱导T细胞分化，是一种在体外生成T细胞的成熟方法6,7。在小鼠和人类中，该共培养系统能够持续地将iPSC分化为T细胞，重现从囊胚阶段直至未成熟T细胞谱系阶段的发育过程6,7。尽管生物技术已取得上述进展，但在CD4+CD8+双阳性（DP）阶段之后的生理性分化仍然难以实现。其中一个原因是，体内CD4+CD8-和CD4-CD8+单阳性（SP）T细胞的生成发生在胸腺中，胸腺是负责T细胞成熟和筛选的器官，确保T细胞具有识别外来抗原的能力，同时避免自身反应性8。这些筛选过程分别被称为阳性选择和阴性选择。然而，目前对胸腺内T细胞成熟所必需的大多数分子机制仍未能完全阐明，因此难以在体外重建这一过程。为了克服这一生理障碍，多个研究团队尝试通过抗CD3抗体或激动性肽段刺激T细胞受体（TCR）复合物。这些体外技术能够产生表达关键T细胞标志物（如CD3、CD8αβ、TCRαβ和CD62L）的细胞产物，并保留对肿瘤抗原的特异性。然而，通过这些胸腺外方法生成的T细胞属于高度异质性的细胞群体，其特征包括阳性选择不完全、具有类固有免疫特性、TCR非特异性杀伤能力、无法形成记忆细胞，以及在体内缺乏持久的抗肿瘤效应8,9,10,11。这些异常现象引发了人们对于将此类细胞用于治疗时可能引发多种副作用的担忧，包括淋巴瘤以及皮肤和骨骼异常12,13,14。
为了重现当前体外分化系统中缺失的生理信号，利用收获的胸腺对肿瘤抗原特异性T-iPSC进行分化。通过采用三维培养系统改进了经典的胎儿胸腺器官培养（FTOC）系统，该系统原本用于研究T细胞在胸腺内的发育过程，改进后成功产生了完成胸腺教育的T细胞。这些经过胸腺发育的T细胞被命名为诱导多能干细胞来源的胸腺移行细胞（iTE），表现出类似初始T细胞的特性15。在小鼠模型中，iTE展现出增殖能力、记忆形成能力，并对已建立的B16黑色素瘤肿瘤产生有效的抗肿瘤效应。本文详细描述了这一新型结合三维培养系统的FTOC方法的实验方案（图1）。
方案
所有动物实验均经国家癌症研究所（NCI）机构动物护理和使用委员会批准，并依照美国国立卫生研究院（NIH）指南进行。
1. 准备受精卵干细胞共培养用的OP9/DLL1细胞
- 在OP9培养基（α-最小必需培养基 [α-MEM] + 20% 未灭活的胎牛血清 [FBS] + 1× 青霉素-链霉素 + 抗坏血酸 [50 ng/mL] 和单硫甘油 [100 nM]）中，于37 °C培养OP9/DLL1细胞。当OP9/DLL1细胞融合度达到80–95%时，用1×无镁、无钙且不含酚红的磷酸盐缓冲液（以下简称PBS）洗涤一次。
- 加入4 mL 0.05% 胰蛋白酶，于37 °C孵育5分钟。然后加入4 mL OP9培养基，通过移液吹打使细胞层解离，形成单细胞悬液。
- 将细胞悬液经100 µm细胞筛过滤至50 mL锥形管中，在4 °C下以300 × g离心5分钟，吸除上清液，并用12 mL OP9培养基重悬细胞。
- 将2 mL OP9/DLL1细胞悬液接种至新的10 cm细胞培养培养皿中，再加入8 mL OP9培养基。每2–3天传代一次。
注意：FBS的质量和培养条件对于维持OP9/DLL1细胞的扩增能力同时不丧失其支持iPSC分化的能力至关重要。因此，建议预先评估FBS批次，并在细胞融合度达到80%时定期传代，以防止细胞分化和衰老。同时，应制备足量的OP9/DLL1细胞冻存储备，并每隔4–6周复苏一批新细胞。
2. 诱导多能干细胞体外分化为未成熟T细胞
- 第0天，在OP9/DLL1汇合的培养皿上开始iPSC共培养。
- 使用胰蛋白酶消化法（在37 °C下用0.05%胰蛋白酶处理5分钟）将iPSC消化为单细胞悬液，收集细胞，并在4 °C下以300 × g离心5分钟。
- 吸除上清液，将细胞重悬于10 mL OP9培养基中，浓度为每10 mL含1.0 × 105个iPSC。将1.0 × 105个iPSC接种至一个汇合的OP9/DLL1 10 cm培养皿中。
注意：OP9/DLL1 10 cm培养皿应在达到90–100%汇合度时用于iPSC分化。汇合度的差异可能影响iPSC分化的效率。
- 第3天，吸除旧培养基，更换为10 mL新鲜OP9培养基。
- 第6天，传代细胞。
- 用10 mL PBS洗涤每个10 cm汇合的OP9培养皿。每皿加入3 mL 0.05%胰蛋白酶，在室温（RT）下孵育3–5分钟。
- 加入4 mL OP9培养基，轻柔吹打收集细胞。通过100 µm细胞筛网过滤，然后在4 °C下以300 × g离心5分钟。弃去上清液。
- 将细胞重悬于10 mL分化培养基（含5 ng/mL小鼠Flt3配体[FLT3L]和5 ng/mL小鼠IL-7的OP9培养基）中，并将细胞悬液接种至新的汇合OP9/DLL1 10 cm培养皿中。
- 第9天，吸除旧培养基，更换为10 mL新鲜分化培养基。
- 第11天，当在iPSC集落中观察到心肌细胞时，通过吹打机械分离非贴壁细胞，并经100 µm细胞筛网过滤。在4 °C下以300 × g离心5分钟。
- 吸除上清液，将细胞重悬于24 mL分化培养基中。将iPSC接种至汇合的OP9/DLL1 6孔板中（每孔4 mL）。
- 第15天，收集所有非贴壁细胞，并通过40 µm细胞筛网过滤。
- 在4 °C下以300 × g离心5分钟。
- 每隔3–4天重复步骤2.5.1，继续传代非贴壁细胞。
3. 生成诱导性胸腺上皮细胞的三维胸腺器官培养
- 收获小鼠胎儿胸腺叶，并通过脱氧鸟苷（dGUO）处理去除内源性淋巴细胞，方法如前所述16。
- dGUO处理第7天，取四个新的10 cm培养皿，每个加入20 mL完全培养基（RPMI 1640培养基 + 10% FBS + 1× L-丙氨酰-L-谷氨酰胺 + 1×丙酮酸钠 + 1×含非必需氨基酸的最低必需培养基（MEM-NEAA）+ 1×青霉素-链霉素 + [1:1000] 2-巯基乙醇）。
- 将所有带有胸腺叶的硝酸纤维素膜转移至一个10 cm培养皿中。用镊子将各个胸腺叶从膜上分离，使其浸入培养基中。弃去硝酸纤维素膜。室温孵育1小时。
- 将胸腺叶转移至另一含完全培养基的新10 cm培养皿中，室温孵育1小时。重复此步骤2次。
- 用镊子固定胸腺叶（每次一个），另一只手在胸腺叶中心做一切口，深度为100–200 µm，长度约为叶直径的一半，以促进T细胞前体迁移进入胸腺叶内。
- 将胸腺叶转移至另一新10 cm培养皿中，该培养皿内含完全分化培养基（完全培养基 + 5 ng/mL小鼠IL-7 + 5 ng/mL小鼠FLT3L + 5 ng/mL SCF）。
- 可选：若使用具有上下层网格的3D培养板，需向两层网格中加入无菌PBS，以防止悬滴蒸发和干燥。
- 从步骤3.6中取出含一个dGUO处理胸腺叶的30 µL完全培养基，分别加入3D培养板的每个孔中。
- 收集OP9/DLL1共培养体系中非贴壁的T系细胞（iPSC来源的未成熟T细胞）（第16–21天）（步骤2.6.2），重悬于培养基中，浓度为每20 µL含2–5 × 103个T系细胞。
- 向3D培养板中每个胸腺叶加入20 µL T系细胞悬液。于37 °C、5% CO2条件下过夜孵育。
- 将P200移液器调至30 µL，反复吹打各孔液体数次后吸出培养基，以去除胸腺叶周围的全部细胞。弃去培养基，加入30 µL完全培养基。重复此操作5–7次，以彻底清除未迁移进入胸腺叶的额外未成熟T细胞。此后每日更换25–30 µL培养基。
- 自第4–5天起，通过光学显微镜观察确认iPSC来源的胸腺输出细胞（iTE）在胸腺叶周围形成晕环状结构。
- 每日通过移液方式收集iTE，注意避免破坏胸腺叶。每日更换培养基，并持续收集约12天。
- 收获的iTE可用于分子分析（图2、图3、图4和图5）或体内移植实验。
4. 抗原呈递细胞（APC）的制备
- 通过颈椎脱位处死一只 C57BL/6 小鼠，并按上述方法将其放置于实验吸水垫上。
- 取出脾脏并置于100 µm细胞筛网上，使用12 mL注射器活塞将脾脏压碎，制备单细胞悬液。
- 将细胞悬液经无菌40 µm细胞筛网过滤。在4 °C条件下，以300 × g离心5分钟，使细胞沉淀。
- 吸除上清液，将细胞沉淀重悬于2 mL氯化铵-氯化钾（ACK）裂解缓冲液中，以去除红细胞（RBC）。室温孵育5分钟。
- 加入10 mL PBS终止ACK裂解反应。在4 °C条件下，以300 × g离心5分钟，收集细胞沉淀。
- 吸除上清液，将细胞沉淀重悬于10 mL完全培养基中，并转移至一个10 cm无菌培养皿中。
- 使用辐照装置（γ射线）以3500 rad剂量辐照脾细胞，以抑制细胞增殖。
- 立即将辐照后的细胞放回37 °C培养箱中，过夜培养。
- 将辐照后的细胞用作抗原呈递细胞（APC），或使用细胞冻存液冷冻保存。
5. 用抗原刺激抗原呈递细胞
- 使用Neubauer血细胞计数板和台盼蓝染色计数活的经辐照的抗原呈递细胞（APC）。将APC与肽段（hgp100）或核蛋白在37 °C孵育30分钟。
- 用10 mL PBS洗涤APC两次，以去除多余的肽段。
- 计数iTE细胞，并以1:1的比例与APC混合于含100 IU IL-2和5 ng/mL IL-7的完全培养基中。将100 µL细胞混合液（总浓度：1 × 106 个细胞/mL）分装至超低吸附U型底96孔板的每个孔中，在37 °C培养48小时。
- 48小时后，使用多通道移液器将细胞转移至新培养板，此后每2–3天传代一次。
- 第3天，通过细胞内抗体染色分析细胞因子分泌谱，并通过流式细胞术进行检测（图3）。
- 加入0.67 µL/mL蛋白转运抑制剂（例如GolgiStop），在37 °C孵育6小时，以增强细胞内细胞因子的积累。用10 mL PBS洗涤。
- 将细胞重悬于3 mL冷（4 °C）PBS中，缓慢加入1 mL冷的4%多聚甲醛（PFA）溶液。
- 10分钟后，在4 °C下以300 × g离心5分钟，弃上清，用10 mL PBS洗涤。
- 将细胞重悬于1 mL PBS + 1% FBS + 0.1%非离子型表面活性剂中，置于4 °C孵育10–15分钟。
- 加入抗体，避光处理，置于4 °C孵育30分钟。
- 在4 °C下以300 × g离心5分钟，弃上清，用10 mL PBS洗涤。
- 在4 °C下以300 × g离心5分钟，将细胞重悬于1 mL PBS中。细胞即可用于流式细胞仪分析。
结果
共培养的胎鼠胸腺被切片以分析由iPSC衍生的T系细胞是否能够迁移至胸腺小叶中。未接种细胞的对照组小叶具有由星形胶质细胞样胸腺上皮网络构成的组织结构17，且缺乏内源性CD3+细胞。相比之下，接种了iPSC来源的未成熟T细胞的胸腺小叶中则重新定植了CD3+单个核细胞，表明iPSC来源的未成熟T细胞已迁移进入小叶（图2A）。
T细胞在迁移进入胸腺微环境并成熟后，作为iTE输出。为了检测其表型特征，对C57BL6胸腺细胞、Pmel iPSC来源的未成熟T细胞（胸腺外）以及从胸腺叶输出的细胞（iTE）进行了流式细胞术分析。在OP9/DLL1上培养的胸腺外T细胞表现为CD4+CD8+（DP）T细胞和CD8αSP T细胞，但不表达阳性选择标志物MHC-I；而iTE则明显表现出CD8αSP MHC-I+ T细胞表型，表明其在从胸腺叶输出前已成功通过阳性选择。iTE持续表达MHC-I和CD62L，这些标志物与高增殖能力、细胞因子产生、外周存活及淋巴组织归巢能力相关18,19,20。该表型与胸腺中最成熟的单阳性T细胞群体——M2 SP胸腺细胞一致20，提示iTE经历了正常的胸腺发育程序（图3）。为监测iTE生成效率，分离了从单个胸腺叶输出的细胞。在第7天，每个胸腺叶平均每天产生1 × 103个活的CD8SP CD45.1+ CD3+ iTE（图3B）。在三维胸腺共培养的第6天至第12天期间，iTE的产生速率保持相似。
通过分析抗原依赖性激活及细胞因子分泌情况，以观察经胸腺教育的iPSC来源的不成熟T细胞的功能特性。在无关肽段（核蛋白）存在的情况下，Pmel-iTE未释放显著水平的TNF-α、IL-2或IFN-γ。当使用Pmel T细胞的特异性肽段（hgp100）刺激时，Pmel-iTE大量释放TNF-α和IL-2，同时产生少量IFN-γ（图4），表明经胸腺教育的iTE能够识别其特异性肽段，并分泌效应细胞因子，其分泌谱与天然的近期胸腺移出细胞（RTE）相似。
为了检测在OP9/DLL1上分化、有或无胸腺教育的iPSC来源T系细胞之间的转录差异（即iTE） 与 胸腺外T细胞），对这两群细胞进行了RNA测序分析，并与通过OP9/DLL1系统分化的双阳性T系细胞（DP）以及原代初始CD8细胞的测序结果进行比较+ Pmel T细胞。分析了在T细胞个体发育、胸腺细胞活化及记忆形成中起关键作用的102个基因的表达15,20,21,22对这四个研究人群进行的主成分分析表明，胸腺外产生的DP和CD8SP T细胞聚集在一起，而iTE则更接近于初始T细胞（图5综上所述，这些数据表明，与通过胸腺外方法生成的T系细胞相比，iTE的表型更接近于初始T细胞。
图1： 利用OP9/DLL1细胞和三维胸腺培养系统将iPSC分化为诱导型胸腺上皮细胞（iTE）的示意图。 该方案包含三个独立的分化阶段；（左）在OP9/DLL1细胞上将iPSC分化为造血系细胞（第0至6天），（中）在含细胞因子的OP9/DLL1细胞上将造血系细胞进一步分化为未成熟T细胞（第6至16–21天），以及（右）利用三维胸腺培养系统将未成熟T细胞（第16–21天）分化为iTE。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2： 接种iPSC来源的未成熟T细胞的胸腺小叶免疫组织化学分析。 顶部：接种与未接种iPSC来源未成熟T细胞的胸腺小叶的H&E染色结果。从第二行至底部：对切片小叶进行DAPI（细胞核）、CD3（T细胞）染色及合并图像的共聚焦显微镜成像。比例尺 = 100 µm。 请点击此处查看该图的高清版本。
图3： iTE表现出胸腺后T细胞表型。（A）胸腺细胞、胸腺外T细胞（OP9/DLL1共培养系统）和Pmel-iTE的FACS分析。活细胞设门基于同源性CD45+。对CD8单阳性（SP）群体进一步分析CD62L和MHC-I的表达。（B）预接种7天后，每叶组织在过夜培养中产生的CD8SP CD45.1 iTE的平均数量。数据来自12次独立实验。请点击此处查看该图的放大版本。
图 4： iTE 通过抗原特异性刺激产生多种细胞因子。 对 iTE 细胞内细胞因子产生的流式细胞术（FACS）分析。iTE 与预先负载无关抗原（核蛋白）或同源抗原（hgp100）肽的抗原呈递细胞（APC）共培养三天。右上象限所示数值表示产生细胞因子的 iTE 所占百分比。请点击此处查看该图的放大版本。
图5：全转录组分析显示iTE基因表达向初始CD8+ T细胞程序转变。基于DP细胞、胸腺外CD8单阳性（SP）细胞、iTE细胞及初始T细胞的RNA-seq数据进行的主成分分析（PCA）。（使用公共数据库GSE105110对与胸腺分化相关的102个基因进行分析）15。请点击此处查看该图的放大版本。
讨论
利用T-iPSC再生肿瘤抗原特异性T细胞可能通过产生具有更强持久性的年轻细胞，克服当前过继性细胞治疗（ACT）中的诸多障碍。尽管已有数种采用OP9/DLL1共培养系统的方法被报道可用于生成CD8单阳性（SP）细胞6,7,10,13 表达CD8分子和肿瘤抗原特异性TCR的细胞，其全基因表达模式和功能分析表明，这些在胸腺外再生的CD8单阳性（SP）细胞与初始T细胞不同（图4）。在此，我们描述了一种三维胸腺培养系统，该系统可从鼠源T-iPSC高效且均一地生成诱导多能干细胞来源的胸腺移出细胞（iTE）。iTE在全基因表达模式以及功能特性（如记忆形成能力）方面均类似于初始T细胞， 体内 对已建立肿瘤的抗肿瘤效应15.
经典的FTOC系统是一种重现胸腺选择的方法 体外已用于研究胸腺细胞在胸腺内的发育过程23，且已有少数报告将FTOC用于生成RTE24然而，FTOC 系统存在若干局限性。为应对人工器官培养中氧气供应不足的问题，多个研究团队已采用基于半干膜的培养方法23或高氧浸没式培养系统25然而，目前尚无任何方法能够持续生成均一的胸腺后T细胞群体。为了克服经典FTOC系统的局限性，我们设计了一种三维胸腺培养系统，该系统在技术上较传统方法有所改进。15例如，利用我们的三维胸腺培养方法，可实现最大程度的氧气交换，并避免胸腺小叶表面受到机械应力，从而使胸腺小叶处于更接近生理状态的环境中。此外，长期培养允许成熟T细胞自然从胸腺小叶中迁移出去。最后，实时观察与显微操作技术使得培养基更换和持续收集新生T细胞（iTE）成为可能，同时无需对胸腺小叶进行物理干扰。因此，该三维胸腺培养方法不仅在技术上实现了显著改进，还为研究胸腺选择产生的初始T细胞提供了前所未有的途径。
成功利用该3D胸腺培养系统生成诱导性胸腺上皮细胞（iTE）有几个关键要点。胎牛血清（FBS）的质量和培养条件对于维持OP9/DLL1细胞的扩增同时不丧失其支持iPSC分化的能力至关重要。因此，我们建议预先评估FBS批次，并在细胞融合度达到80%时进行常规传代，以防止细胞分化与衰老。此外，必须获得融合状态的OP9/DLL1细胞培养层，以 体外 iPSC向未成熟T细胞的分化，因为融合度的差异可能影响其分化效率。最后，胸腺叶的胚胎年龄对于iTE的生成至关重要。我们建议使用E14.5至E15.5时期的胸腺叶。
与任何新方案一样，该方法存在局限性，并有待进一步改进。本研究所采用的培养技术可在两周时间内，每天从每个胸腺叶产生约1000个诱导性胸腺上皮细胞（iTE）。通过进一步优化，例如调整氧气浓度、培养基体积以及三维培养板的类型，可能实现更高的iTE产量。添加或去除细胞因子，以及改变细胞因子的浓度，也可能有助于提高iTE的产出效率。
鉴于本文介绍的三维胸腺培养系统能够在完全ex vivo的条件下生成胸腺迁出细胞，该技术可应用于多种免疫学及过继性细胞转移研究项目，包括但不限于T细胞分化、胸腺后T细胞成熟，以及从造血前体细胞或干细胞中生成抗原特异性T细胞。尽管该方法尚不能直接应用于人类样本，但iTE与三维胸腺培养系统在阐明阳性与阴性选择的分子机制方面具有巨大潜力，并可能推动建立一种能够生成具有临床意义的肿瘤抗原特异性类初始T细胞的培养体系，用于过继性细胞治疗（ACT）。
披露
作者 Raul Vizcardo、Nicholas D. Klemen 和 Nicholas P. Restifo 是一项于 2017 年 12 月 13 日提交的国际专利申请 PCT/US2017/65986 的发明人，该专利申请的名称为“胸腺迁出细胞的分离或纯化群体的制备方法及其在治疗中的应用”。
致谢
我们感谢 Hiroshi Kawamoto 和 Kyoko Masuda 慷慨提供 OP9/DLL1 细胞系。感谢 Alan B. Hoofring 和 Erina Z. He 在图形绘制方面的协助。本研究由美国国家癌症研究所（NCI）院内研究项目（ZIA BC010763）以及 NIH 国家癌症研究所细胞治疗中心的癌症登月计划提供资助。本工作还得到了米尔斯坦家族基金会的支持。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 化学品、多肽和重组蛋白 | |||
| 2-脱氧鸟苷 | Sigma-Aldrich | 312693-72-4 | |
| 2-巯基乙醇（1,000倍） | Thermo Fisher Scientific | 21985-023 | |
| ACK裂解缓冲液 | Gibco | A1049201 | |
| 抗坏血酸 | Sigma-Aldrich | A8960 | |
| 杀稻瘟菌素 | Thermo Fisher Scientific | R21001 | |
| FBS | Gemini | 100-500 | |
| Flt-3配体 | R&D Systems | 427-FL | |
| GlutaMAX（100倍） | Thermo Fisher Scientific | 35050-061 | |
| hgp100 | Genscript | 282077-1, KVPRNQDWL | |
| 白细胞介素-2 | R&D Systems | 402-ML | |
| 白细胞介素-7 | R&D Systems | 407-ML | |
| MEM非必需氨基酸溶液 | Gibco | 11140050 | |
| MEM粉末 | Gibco | 61100061 | |
| 单硫代甘油 | Sigma-Aldrich | M-6145 | |
| 核蛋白 | Global Peptides | ASNENMETM | |
| 青霉素/链霉素 | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| 磷酸盐缓冲液 pH 7.4（1倍） | Thermo Fisher Scientific | 10010-023 | |
| 嘌呤霉素 | Thermo Fisher Scientific | A1113803 | |
| RPMI 1640 | Gibco | 11875093 | |
| 丙酮酸钠 | Thermo Fisher Scientific | 11360-070 | |
| 干细胞因子（SCF） | R&D Systems | 455-MC | |
| Stemfactor LIF，小鼠重组 | STEMGENT | 03-0011-100 | |
| 胰蛋白酶-EDTA（0.05%），酚红 | Thermo Fisher Scientific | 25300-062 | |
| 细胞培养器皿及其他 | |||
| 10 cm培养皿 | Corning, Inc. | 353003 | |
| 12 mL注射器 | Covidien Monoject | 22-652-090 | |
| 6孔板 | Corning/Coster | 3516 | |
| 细胞筛（100 μm） | Fisher Scientific | 22-363-549 | |
| 细胞筛（40 μm） | Fisher Scientific | 22-363-547 | |
| 镊子 | DUMONT | 0108-5PO | |
| 实验台吸水垫 | Versi-Dry | 货号 EF2175CX 74018-00 | |
| 膜过滤器（0.8 μm，47 mm直径） | Whatman | WHA7408004 ALDRICH | |
| Perfecta3D悬滴培养板 | Sigma-Aldrich | HDP1096 | |
| U型底96孔板 | Corning/Coster | 3799 | |
| 实验用细胞系 | |||
| CD3-iPSC | Vizcardo 等，Cell Report 2018 | N/A | |
| MEF-iPSC | Vizcardo 等，Cell Report 2018 | N/A | |
| 小鼠胚胎成纤维细胞（MEF） | ATCC | SCRC-1040；RRID:MGI:5007926 | |
| OP9/N-DLL1 | Riken生物资源中心 | 货号 RCB2927；RRID:CVCL_B220 | |
| Pmel-iPSC | Vizcardo 等，Cell Report 2018 | N/A | |
| 实验用小鼠模型 | |||
| B6.SJL-PtprcaPepcb/BoyCrCrl | Charles River | 品系编号 564；RRID:IMSR_CRL:564 | |
| C57BL/6N | NCI/Charles River | N/A | |
| Pmel-1小鼠 | Overwijk 等 | J Exp Med 198(4):569-80 | |
| 抗体 | |||
| 抗-aTCR | Biolegend | 109202；RRID:AB_313425 | |
| 抗-CD3 | abcam | ab11089；RRID:AB_369097 | |
| 抗-CD4 | BD Biosciences | 553730；RRID:AB_395014 | |
| 抗-CD44 | BD Biosciences | 559250；RRID:AB_398661 | |
| 抗-CD45.1 | BD Biosciences | 553775；RRID:AB_395043 | |
| 抗-CD45.2 | BD Biosciences | 553772；RRID:AB_395041 | |
| 抗-CD62L | BD Biosciences | 560516；RRID:AB_1645257 | |
| 抗-CD69 | BD Biosciences | 552879；RRID:AB_394508 | |
| 抗-CD8a | BD Biosciences | 557959；RRID:AB_396959 | |
| 抗-CD8b | BD Biosciences | 550798；RRID:AB_393887 | |
| 抗-H-2Kb | BD Biosciences | 553570；RRID:AB_394928 | |
| 抗-IFN-γ | BD Biosciences | 557998；RRID:AB_396979 | |
| 抗-IL-2 | BD Biosciences | 554428；RRID:AB_395386 | |
| 抗-TCRβ | Thermo Fisher Scientific | 35-5961-81；RRID:AB_469741 | |
| 抗-TCRVβ13 | BD Biosciences | 553204；RRID:AB_394706 | |
| 抗-TNFα | BD Biosciences | 557644；RRID:AB_396761 |
参考文献
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