测量啮齿类动物骨骼肌的收缩功能是一种有用的工具，可用于追踪疾病进展以及评估治疗干预的效果。本文描述了一种非侵入性的、可在活体（in vivo）条件下对同一小鼠进行多次重复检测的背伸肌功能评估方法。
本文内容
摘要
摘要
评估骨骼肌收缩功能对于临床和科研目的均具有重要意义。多种状况可能对骨骼肌产生负面影响，导致肌肉质量减少（萎缩）和/或肌肉品质下降（单位肌肉质量产生的力量降低），这些情况在慢性疾病、肌肉特异性疾病、制动以及衰老（肌肉减少症）中普遍存在。动物骨骼肌功能可通过多种不同测试方法进行评估。各种测试方法均存在与生理测试环境相关的局限性，具体测试方法的选择通常取决于实验的性质。本文描述了一种活体内的, 一种非侵入性技术，可在同一小鼠个体上随时间多次进行，从而方便、简便地评估力-频率曲线（FFC），实现对疾病进展和/或治疗效果的监测 一种潜在的治疗方法
引言
骨骼肌是一种重要的代谢组织，约占体重的40%。它在能量代谢和稳态调控中发挥关键作用1。骨骼肌质量的维持依赖于蛋白质合成与降解速率之间的精细平衡1。多种疾病状态会影响骨骼肌中的这些过程，导致肌肉质量净减少（萎缩）。这些疾病包括但不限于癌症、艾滋病、衰老、禁食和肢体固定2,3。在老年人群中，力量的下降与肌肉质量的减少相关，并且是全因死亡率的预测指标4。在此背景下，评估肌肉功能对于确定治疗策略在对抗和/或预防骨骼肌萎缩及功能丧失方面的有效性具有重要意义。
研究人员已采用多种不同方法和动物模型来研究肌肉萎缩的分子通路5,6，以及这些机制对肌肉收缩功能的影响2,3,7。因此，将分子水平的变化与肌肉功能的差异相关联，对于理解分子水平变化如何影响肌肉功能至关重要。
骨骼肌功能的评估，尤其是在小型啮齿类动物中，通常采用三种已有明确描述的方法8,9，以检测力量产生能力的受损情况和/或监测疾病进展。（1）离体（ex vivo）方法：将肌肉从动物体内取出，置于任氏液（Ringer's solution）中孵育，通过场刺激评估肌肉功能10。（2）原位（in situ）方法：肌肉的近端附着点保留在动物体内，远端肌腱连接至力传感器，通过直接刺激神经来评估肌肉功能11。（3）在体（in vivo）方法：将电极植入皮下，以诱发神经驱动的肌肉力量输出9,12。尽管这三种方法适用于不同研究目的，但各自均具有优势与局限性。因此，应根据研究目标选择合适的方法。离体实验的主要局限在于将肌肉脱离其正常生理环境，并依赖场刺激。原位方法可维持正常的血液供应并通过神经进行刺激，但会改变正常解剖结构，且实验为终末性操作，无法对同一动物进行后续肌肉功能的重复测量。本文所述的在体方法最接近正常生理状态，因其保持解剖结构完整、神经-肌肉束未受破坏，且实验非终末性，允许在同一只动物身上进行长期随访测量8。
本文介绍了一种体内实验方法，可在同一动物个体中随时间推移进行多次肌肉功能测量。该方法通过腓神经（又称腓骨神经）刺激，以非侵入性方式评估前小腿间室的肌肉功能，包括负责背屈的胫骨前肌（TA）、趾长伸肌（EDL）和拇长伸肌（EHL）。其中，踝关节背屈的大部分力量由胫骨前肌提供13，而控制脚趾运动的EDL和EHL仅起微弱作用。该非终末性实验方案可保留神经和血液供应的完整性，从而能够在动物模型目前可实现的最生理条件下，长期观察疾病进展及治疗效果。
方案
所有实验程序均经迪肯大学动物伦理委员会批准（项目编号：G19/2014）。
1. 仪器设置
- 确保所有设备均已正确连接。
- 打开计算机、高功率双相刺激器和双模式杠杆系统。
- 在平台上安装小鼠膝夹，并在换能器上安装小鼠足板。
- 将加热平台温度设为 37 °C。
- 在桌面上打开动态肌肉控制软件。
注意： 该软件用于进行功能测试。
2. 软件与模型设置
- 程序打开后（图1），校准换能器并选择 设置 | 我的仪器 | 校准.
- 在 "设置" 按钮，选择 InstantStim 并改变 "运行时间" 参数设置为 120 秒（图1A).
注意： 通过执行单次抽搐、手动设置或根据需要多次启动 InstantStim，也可达到最佳电压。 - 在标有可输入的窗口中 "自动保存基座" 输入自动保存文件的位置名称（例如, 小鼠1-日期-时间点1）。单击该行左侧的复选框以 "自动保存基座" 窗口并将其更改为 启用自动保存.
- 在 DMC 控制屏幕的顶部，前往 测序仪，将打开一个新弹出窗口。选择 开放序列 并选择要使用的预设实验方案（图1B）。点击 加载序列 | 关闭窗口.
注意： 此步骤用于生成力-频率曲线（FFC）测试（1, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 80, 100, 150, 200, 250 Hz）。 - 设置 "范围" 将双相刺激器的旋钮调至 10 mA。
注意： 确保 "调整" 旋钮（右下角）调至零位。此微调装置用于调节电极的位置。
3. 小鼠准备
注意：所有力学测量均在 12 周龄的雄性野生型小鼠（C57BL/6）上进行。
- 将每只小鼠放入麻醉舱内，以1 L/min的氧气流速通过鼻罩吸入5%异氟烷，直至小鼠失去意识。确认麻醉程度充分 通过 足部反射消失
- 使用电动剃毛剪剃除小鼠右腿上的全部毛发。
- 将动物仰卧置于加热平台上，用70%酒精和碘液清洁右后肢（任一侧均可）。此时将异氟烷浓度调整至2%（氧气流速为1 L/min），并在电极放置部位的皮肤上涂抹导电凝胶。
注意： 使用直肠温度探头在操作过程中监测体温，并涂抹眼药膏以防止眼睛干涩和/或损伤。 - 将足部置于脚踏板上，并使用医用胶带固定。夹紧膝部，以在操作过程中稳定和固定腿部。
注意： 一些研究描述了使用一根非常细的针穿过胫骨近端（位于背屈肌后方）的方法12 以提供稳定。本方案选择使用夹具，因其可在避免对膝关节造成不必要压迫或损伤的同时，提供足够的稳定性。该夹具还可避免骨间针可能引发的潜在炎症反应，同时仍允许对肌肉收缩力进行准确评估。此外，小鼠膝关节夹具已成功应用于14. - 此时，使用平台上的旋钮调整小鼠后肢位置，使踝关节呈90°角（图2).
4. 电极位置的优化
- 将小鼠放置于平台后，将电极置于右后肢皮下（皮下组织）位置。
注意：此步骤至关重要，在步骤 4.4 的设置过程中可能需要进行多次调整以达到理想位置。 - 将电极放置于右后肢外侧；一个电极靠近腓骨头，另一个电极更远端地置于腿部外侧（图 2）。
注意：本实验采用定制电极系统以优化此步骤。然而，也可使用该系统制造商提供的电极针完成本测试。 - 完成上述步骤后，在高功率双相刺激器上根据需要调节标有 "ADJUST" 的旋钮，以刺激腓总神经并获得最大背屈力矩。
注意：对于成年野生型小鼠，该电流范围通常低于 2 mA；但具体数值可能因动物的体型、年龄和性别而异。应缓慢增加产生的力（曲线峰值），直至达到最大力量。 - 刺激过程中，顺时针旋转传感器以获得负值（图 3），该操作对于确保电极仅通过腓总神经刺激背屈肌群至关重要。完成此步骤后，使用夹具固定电极，防止实验过程中发生任何移动。
注意：曲线峰值将缓慢增加，最大电流强度定义为连续三次或以上刺激产生相同收缩力时的电流水平。避免将电流调得过高；过高的电流会刺激邻近甚至拮抗肌群收缩，导致共收缩现象，从而产生正值峰值。 - 在软件中停止 Instant Stim 程序。
- 在主界面上，打开标有 "Start Sequence" 的按钮，以启动先前的设置序列（如步骤 2.4 所述）。
5. 结束实验步骤
- 完成力测量后，移除电极，松开膝关节夹具，并移除足部胶带。
- 关闭异氟烷，继续输送氧气数分钟以辅助动物恢复。一旦小鼠开始活动和/或恢复意识并能自主翻身，立即将其放回笼中。
注意：可皮下注射非甾体抗炎药（NSAID）（美洛昔康 1 mg/kg），以预防术后可能的不适和/或疼痛。
6. 数据分析
- 打开数据分析软件。
- 点击屏幕左上角的高通量（High Throughput），选择力频率（Force Frequency）以分析上述设置序列。
- 选择手动（Manual），并将"结束光标"的值更改为3。同时选中去除基线（Remove Baseline）。
- 点击选择文件（Pick Files）以访问先前执行的程序，然后点击分析（Analyze）。此时可在屏幕上查看结果，或将其导出至电子表格中进行进一步分析和/或计算。
注意：数据以 mN 为单位测量；但可通过将力值乘以杠杆臂长度（绝对力）来计算扭矩。如需归一化处理（比力），可将扭矩归一化至体重，或通过终末实验采集年龄匹配个体的肌肉质量。
结果
力-频率曲线是一种有用的测试方法，通过低频和高频刺激肌肉，以区分次优和最优的力反应15。在较低频率下，可引发单次抽搐，激活较少且较小的运动单位；而在较高频率下，则达到稳定的峰值，此时独立的抽搐融合形成强直收缩，并通过激活所有运动单位产生最大力量16。在本实验中，强直收缩曲线始于约 60 Hz，此时可观察到增强效应（图 4A），最大力量在约 150 Hz 时确定（图 4B），此时曲线完全融合并达到平台期9,16。
若结果出现任何偏差，可能表明电极未能对肌肉进行有效刺激。电极放置是该实验准备过程中的关键步骤，因为电刺激必须准确定位以支配腓总神经，从而充分激活该神经所支配的背屈肌群（胫骨前肌、趾长伸肌和拇长伸肌）。正确的电极位置会在该过程中产生负向波峰（图3），而电极位置偏移或电流强度过高则可能导致周围肌肉被刺激，引起邻近肌肉及拮抗肌的共同收缩，进而产生正向波峰。
图5A 显示了一只小鼠在不同时间点的代表性力-频率曲线数据，该操作每周重复一次，共完成5个时间点。这些观察结果显示，在各个时间点和/或测量中，力量输出值保持一致。该操作在不同小鼠之间的测量也表现出一致性，如图5B 所示，该图展示了6只小鼠每周测试一次、在5次不同观察中FFC刺激下曲线下的代表性面积。
图1：软件系统。（A）设置“即时刺激”（Instant Stim）参数的控制软件操作步骤示意图。在背景图片中，点击 Setup | Instant Stim。在弹出的小窗口（前景图片）中设置相关参数。（B）“序列器”（Sequencer）设置界面示意图。请点击此处查看该图的放大版本。
图 2：小鼠实验装置。麻醉动物体位的总体示意图。右侧膝夹固定于使膝关节呈90°，同时足部与踝关节也保持90°（白色虚线所示）。通过刺激腓骨小头下方（远端）的腓神经，可引起背屈肌的收缩。我们使用自行设计的电极（插图）；然而，仪器配套提供的或单独购买的针状电极也同样适用。请点击此处查看该图的放大版本。
图3：电极放置后的输出结果。 当电极置于皮肤下并开始施加电压后，可观察到具有负值的峰值。此时，达到负值（绿色线条）是确保仅在背屈肌群（胫骨前肌、趾长伸肌和拇长伸肌）中实现刺激的关键步骤。实时测量结果由两条红线之间的区域指示。请点击此处查看该图的放大版本。
图4：代表性曲线。（A）60 Hz 下的力曲线样本（小鼠 #06）。（B）150 Hz 下的强直收缩曲线样本（小鼠 #03）。请点击此处查看该图的放大版本。
图 5： 代表性力-频率曲线（FFC）及曲线下面积数据。 (A) 一只样本小鼠（#05）在 5 个不同时间点（第 1、2、3、4 和 5 周）的力-频率曲线（横轴）。(B) 6 只小鼠（分别为 #01、02、03、04、05 和 #06；横轴）在 5 个不同时间点的力-频率曲线曲线下面积（AU，纵轴）。结果以 6 只小鼠共 5 个时间点（测试）的均值 ± 测量标准误（SEM）表示，并采用单因素方差分析（one-way ANOVA）进行统计分析（p < 0.05）。 请点击此处查看该图的放大版本。
讨论
以准确且可重复的方式测量肌肉最大收缩功能，对于遗传性、代谢性及肌肉疾病的渐进性评估至关重要17。同样，体内肌肉收缩功能检测可用于评估针对致残性肌肉疾病的新型治疗方法和治疗手段。本文展示了通过体内实验方法测量小鼠后肢远端背屈肌群力量输出的过程。
商用设备在执行这种非侵入性操作时高效且具有帮助性。该检测在评估肌肉收缩功能方面具有重要优势，同时能够保持天然的生理环境，其中血液供应和神经支配保持完整。然而，其缺点在于肌肉单位横截面积上的力（比力）的标准化，这只能在实验结束后取材的离体肌肉中确定。但非侵入性检测允许在同一只动物上随时间多次测量屈肌的收缩功能，从而减少所需实验动物的数量，特别是在目标为评估相对变化（随时间的绝对力变化）时尤为显著。
为了在各时间点获得一致的数据，进行该操作时必须考虑若干重要步骤。首先，应尽可能标准化动物的体位。其次，在设置过程中，电极位置的放置必须保持一致，以便通过腓神经刺激达到最佳刺激效果（via stimulation of the peroneal nerve）。电极的位置应位于（本例中为右侧）腿的外侧，靠近腓骨头处，另一电极则位于腿外侧更远的下方（图2）。基于此，定制电极的设计确保每次均可将其置于相同位置。然而，使用商业设备配套提供的电极针同样可实现充分的刺激。第三，在电压设置过程中，必须通过顺时针旋转与足板相连的换能器来获得负向波峰。研究表明，对小鼠腿部电极进行正确放置并设置最大电压，是一种可在同一只小鼠身上随时间重复进行的技术。
能够在同一动物的不同时间点评估和追踪肌肉功能，是表征各类肌肉疾病及其进展的重要手段。此外，在小鼠中测量肌肉背屈功能可作为一种工具，用于在接近生理状态且代谢应激最小的环境中评估潜在治疗方法的有效性12。因此，该技术为评估肌肉疾病、疾病进展以及潜在治疗方案提供了有效方法。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本项目经费来自迪肯大学运动与营养科学学院。作者谨此感谢安德鲁·霍华斯先生在优化电极装置方面所做的大量工作。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1300A：三合一整体动物系统 – 小鼠 | Aurora Scientific Inc. | 305C-LR：双模式足板；605A：动态肌肉数据采集与分析系统；701C：电刺激器和809C： in-situ 小鼠装置 | 完整的肌肉功能系统 |
| 导电凝胶 | Livingstone | ECGEL250 | 用于小鼠的导电凝胶 |
| 眼膏 | Alcon | Poly Visc | 药品（眼科用途） |
| 非甾体抗炎药（NSAID） | Ilium | Metacam | 兽用药物（注射剂，5 mg/mL） |
| 异氟烷 | Zoetis | Isoflo | 兽用吸入性麻醉剂 |
参考文献
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