由小型环状DNA分子构建的稳定DNA序列基序、一维和二维纳米结构

摘要

本文介绍了一种小环状DNA分子的T4连接与变性聚丙烯酰胺凝胶纯化、环状瓦片的退火与非变性聚丙烯酰胺凝胶分析、一维和二维DNA纳米结构的组装与原子力显微镜成像，以及有限DNA纳米结构的琼脂糖凝胶电泳与离心纯化等详细实验方案。

摘要

本文介绍了一种合成小型环状DNA分子、退火环状DNA结构单元以及构建一维和二维DNA纳米结构的详细实验方案。数十年来，DNA纳米技术的快速发展主要得益于线性DNA作为起始材料的应用。例如，DAO（双交叉、反平行、奇数半转）瓦片是构建二维DNA晶格的知名结构单元；DAO的核心结构由两条线性单链寡核苷酸组成，类似于两条绳索打成一个右旋 granny 结 结。本文介绍一种新型DNA瓦片，称为cDAO（耦合DAO），其以长度为c64nt或c84nt（即64或84个核苷酸的环状单链DNA）的小型环状单链DNA作为支架链，以多条线性单链DNA作为订书链构建而成。利用cDAO瓦片可组装出完美的1D和2D纳米结构，包括无限延伸的纳米线、纳米螺旋、纳米管、纳米带以及有限尺寸的纳米矩形。文中详细描述了实验方案：1）通过T4连接酶制备小型环状寡核苷酸，并采用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）进行纯化；2）退火形成稳定的环状瓦片，随后进行非变性PAGE分析；3）组装无限延伸的1D结构（纳米线、纳米环、纳米螺旋）、无限延伸的2D结构（纳米管和纳米带的晶格）以及有限尺寸的2D纳米矩形，随后通过原子力显微镜（AFM）成像进行表征。该方法简便、稳健且成本较低，适用于大多数实验室。 关键词：cDAO，环状DNA，DNA纳米技术，纳米结构，T4连接酶，PAGE，原子力显微镜，AFM，纳米线，纳米螺旋，纳米管，纳米带，纳米矩形

引言

几十年来，DNA分子已被用于构建多种纳米结构。典型的结构基元包括DAE（双交叉、反平行、偶数半圈）和DAO瓦片^1,2,3、星形瓦片^4,5,6,7、单链（ss）瓦片^8,9,10以及DNA折纸结构^11,12,13。这些DNA基元和晶格由线性单链DNA组装而成。最近，我们及其他研究者报道了使用环状单链寡核苷酸作为支架来构建基元、一维纳米管和二维晶格的方法^14,15,

方案

1. 环状DNA的制备

1. 直接使用商业公司提供的所有线性DNA，无需进一步纯化。
2. 将DNA样品在5,000 × g离心5分钟，使所有DNA沉淀聚集于管底。加入适量TE缓冲液（10 mM Tris，1 mM EDTA，pH 8.0）溶解DNA。
3. 使用微量紫外分光光度计在260 nm处测定每种ss-DNA溶液的浓度为"a" ng/µL。根据公式 b = a × 10³ /（DNA链的分子量），将"a" ng/µL转换为"b" µM。调节TE溶液的用量，配制10 µM的DNA储备液。
4. 直接使用T4 DNA连接酶连接商业公司提供的c64nt、c74nt和c84nt的5'-磷酸化线性DNA模板的3'和5'末端（图1）。
5. 在200 µL PCR管中，将5'-磷酸化线性DNA链（3.5 µM）与其对应的splint DNA链（4.5 µM）混合于80 µL TE缓冲液中¹⁵。将该管置于装有95 °C热水的敞口保温瓶中，让热水在实验室环境下自然冷却至室温（25 °C），耗时约2–3小时。
6. 向混合物中加入10 µL 10× T4缓冲液（660 mM Tris-HCl，66 mM MgCl₂，100 mM DTT，1 mM ATP）和....

结果

环状DNA在变性PAGE中的迁移速度略慢于其前体线性DNA图2因为环状DNA内部的孔洞被凝胶纤维穿透并阻碍^23,24,25寡聚单体环化的正确连接反应效率取决于底物序列和浓度、反应温度、时间 等等当线性DNA前体的浓度足够高（约3.5 µM）时，本方案中的c64nt（或c84nt）环化产物及其前体参照物可在TLC板上经紫外光照射直接观察到条带，无需染色。若环状DNA条带模糊或不可见，表明连接反应失败或产物得率极低。有时在线性前体条带上方会出现两条条带，提示除正确的寡聚单体环外还形成了寡聚二聚体环。此时应忽略上方条带，仅收集下方条带。纯化后的环状DNA产物经真空干燥后可在离心管中呈现为白色粉末。除变性PAGE外，DNA纯度也可通过紫外分光光度计测定。DNA的吸收峰位于260 nm处。衡量DNA纯度的两个标准指标为2.......

讨论

本文介绍的实验方案主要聚焦于小环状DNA分子的合成以及DNA纳米结构的组装。大多数随机测序得到的DNA设计均可用于本方案。环状DNA的纯度对于DNA组装的成功至关重要。通过降低5'-磷酸化线性DNA的浓度，可以提高环化反应的产率；然而，这将增加获得相同数量环状DNA所需的工作量。连接引导DNA链（splint DNA）的长度也会影响连接反应的准确性，针对c64nt和c84nt，其长度优化为约20个核苷酸。

适量的镁离子（例如在组装过程中及组装完成后，溶液中镁离子浓度（12.5 mM）对于DNA纳米结构的形成与维持至关重要。因此，在退火、天然聚丙烯酰胺凝胶电泳（native PAGE）、琼脂糖凝胶电泳以及聚乙二醇缓冲液离心纯化、原子力显微镜（AFM）成像等各个环节中，始终维持12.5 mM的镁离子浓度。 等等.

对于5 × 6 cDAO-c64nt-O和5 × 6 cDAO-c74&84nt-O的有限矩形组装体，琼脂糖凝胶纯化不会影响其结构细节，而聚乙二醇缓冲液离心纯化则会破坏高分辨.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
T4 连接酶	TaKaRa	2011A
T4 缓冲液	TaKaRa	2011A
TE 缓冲液	Sangon	B548106
保温瓶	Thermos	SK-3000
PCR 仪	Bio Gener	GE4852T
外切酶 I	TaKaRa	2650A
外切酶 I 缓冲液	TaKaRa	2650A
30% (w/v) 丙烯酰胺/双丙烯酰胺溶液 (19:1)	Sangon	B546016
TAE 预混粉末	Sangon	B540023
Mg(Ac)2·4H2O	南京化学试剂	C0190550223
尿素	Sangon	A510907
TEMED	BBI	A100761
过硫酸铵	南京化学试剂	13041920295
电源	北京六一	DYY-8C
水浴锅	Sumsung	DK-S12
甲酰胺	BBI	A100314
DNA Marker (25~500 bp)	Sangon	B600303
DNA Marker (100~3000 bp)	Sangon	B500347
上样缓冲液	Sangon	B548313
PAGE 电泳系统	北京六一	24DN
滤膜	ASD	5010-2225	0.22 µM
紫外成像系统	Tanon	2500R
正丁醇	Sangon	A501800
无水乙醇	SCR	10009257
NaOAc	南京化学试剂	12032610459
离心机	eppendorf	Centrifuge 5424R
真空浓缩仪	CHRIST	RVC 2-18
紫外分光光度计	Allsheng	Nano-100
核酸染料	Biotium	16G1010	GelRed
琼脂糖	Biowest	G-10
琼脂糖电泳系统	北京六一	DYCP-31CN
加热板	江苏金坛	DB-1
TBE 预混粉末	Sangon	B540024
过滤柱	Bio-Rad	7326165	Freeze 'N Squeeze 柱
AFM	Bruker	Dimension FastScan
PEG8000	BBI	A100159
云母片	Ted Pella	BP50
空气中使用的三角形 AFM 探针	Bruker	FastScan-C
液体中使用的三角形 AFM 探针	Bruker	ScanAsyst-fluid+
DNA 单链	Sangon