Murine सीमांत क्षेत्र बी कोशिकाओं के कतरनी प्रवाह प्रेरित प्रवासन का विश्लेषण इन विट्रो में
Summary
सीमांत क्षेत्र बी कोशिकाओं (MZBs) फिर से कतरनी प्रवाह के बल का जवाब-उनके प्रवास के प्रवाह को पथ उंमुख । इस प्रोटोकॉल से पता चलता है कैसे रिकॉर्ड और एक fluidics इकाई, पंप, माइक्रोस्कोप इमेजिंग प्रणाली, और मुफ्त सॉफ्टवेयर का उपयोग कर प्रवास का विश्लेषण ।
Abstract
सीमांत क्षेत्र बी कोशिकाओं (MZBs) बी कोशिकाओं की आबादी है कि माउस प्लीहा सीमांत क्षेत्रों में रहते है कि रोम ढंक रहे हैं । रोम तक पहुंचने के लिए, MZBs रक्त प्रवाह की कतरनी बल माइग्रेट करना चाहिए । हम यहाँ इस प्रवाह-प्रेरित MZB माइग्रेशन इन विट्रो में विश्लेषण करने के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं । सबसे पहले, MZBs माउस तिल्ली से अलग कर रहे हैं । दूसरा, MZBs प्रवाह चैंबर स्लाइड में integrin लाइगैंडों पर बसे हैं, कतरनी प्रवाह को उजागर, और एक खुर्दबीन के नीचे imaged जबकि पलायन । तीसरा, पलायन MZBs की छवियों ImageJ के लिए MTrack2 स्वचालित सेल ट्रैकिंग प्लगइन का उपयोग संसाधित कर रहे हैं, और परिणामस्वरूप सेल पटरियों Ibidi chemotaxis उपकरण का उपयोग quantified हैं । माइग्रेशन डेटा यह प्रकट करता है कि कक्ष कितनी तेजी से चलते हैं, वे कितनी बार दिशा बदलते हैं, चाहे कतरनी प्रवाह वेक्टर उनकी माइग्रेशन दिशा को प्रभावित करे, और जिसमें integrin लाइगैंडों शामिल हों । हम MZBs का उपयोग करते हैं, विधि आसानी से कतरनी प्रवाह के बल पर प्रतिक्रिया करता है कि किसी भी ल्युकोसैट के प्रवास का विश्लेषण करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है ।
Introduction
प्रतिरक्षा कोशिकाओं को मानव शरीर में सबसे अधिक गतिशील कोशिकाओं रहे है और अक्सर रक्त और लसीका प्रवाह से कतरनी बल के साथ संघर्ष करना चाहिए । हालांकि, ल्यूकोसाइट्स1,2,3,4,5के कतरनी बल-प्रेरित प्रवास पर तुलनात्मक रूप से कुछ अध्ययन कर रहे हैं । हम यहां एक विश्वसनीय और मात्रात्मक प्रोटोकॉल के लिए एक प्रतिरक्षा कोशिका की प्रतिक्रिया का विश्लेषण करने के लिए इन विट्रो में प्रवाह प्रस्तुत करते हैं । परख प्रदर्शन घटकों के निर्माण की आवश्यकता नहीं है, और सभी उपकरणों और उपभोग्य सामग्रियों व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं । कक्ष शुद्धिकरण और माइग्रेशन विश्लेषण सहित प्रोटोकॉल, एक ही दिन में किया जा सकता है । अंत में, यद्यपि हम सीमांत क्षेत्र बी कोशिकाओं (MZBs) के प्रवास का वर्णन, प्रोटोकॉल के लिए प्रतिरक्षा कोशिकाओं के अंय प्रकार के प्रवाह के खिलाफ प्रवास का विश्लेषण अनुकूलित किया जा सकता है । इसलिए, यह संभव है कि इस परख का उपयोग करने के लिए व्यवस्थित शर्तों के एक व्यापक पैनल के साथ ल्यूकोसाइट्स की एक विस्तृत रेंज का विश्लेषण ।
MZBs बी कोशिकाओं की आबादी है कि, माउस में, केवल तिल्ली और रोम के इंटीरियर और सीमांत क्षेत्रों6,7,8,9के बीच शटल में पाए जाते हैं । सीमांत क्षेत्र प्रतिरक्षा कोशिकाओं की एक परत लगभग 5 – 10 मोटी कोशिकाओं है । कोशिका परत कूप ढंक और MZBs और मैक्रोफेज के मुख्य रूप से होते हैं, लेकिन यह भी अपरिवर्तनीय प्राकृतिक खूनी टी (iNKT) कोशिकाओं, वृक्ष कोशिकाओं (dc), और न्यूट्रोफिल, अंय लोगों के अलावा10। सीमांत क्षेत्र में कोशिकाओं एकतरफ़ा रक्त प्लीहा धमनियों कि कूप आसपास के एक सीमांत साइनस में समाप्त होने से उत्पंन प्रवाह को उजागर कर रहे हैं । रक्त सीमांत क्षेत्र के माध्यम से सीमांत साइनस में छेद से बहती है और फिर लाल लुगदी में शिरापरक साइनस में एकत्र और संचलन11में बहाल । रक्त के मुक्त प्रवाह MZBs पर बहाकर और उन्हें रक्त में किए गए एंटीजन को उजागर करता है । MZBs के कूप में प्रतिजन ले स्वचालित रूप से सीमांत क्षेत्र और कूप है, जो रक्त के संपर्क में नहीं है के अंदर के बीच । इस प्रकार, कूप की ओर MZBs शटल के रूप में, वे रक्त प्रवाह12 (आंकड़ा 1a) की कतरनी बल विस्थापित करना होगा ।
इस प्रोटोकॉल में, हम वर्णन कैसे मात्रात्मक कैसे MZBs के रूप में प्रतिरक्षा कोशिकाओं को या तो कोई प्रवाह या इन विट्रो में उच्च प्रवाह का जवाब निर्धारित करने के लिए, ताकि वे vivo मेंमाइग्रेट करने के लिए क्रमादेशित रहे है प्रकट करने के लिए । पहले चरण में, MZBs एक माउस तिल्ली वाणिज्यिक उपलब्ध किट से एंटीबॉडी के लिए मिलकर चुंबकीय मोतियों का उपयोग से शुद्ध कर रहे हैं. हौसले से पृथक MZBs एक प्रवाह चैंबर स्लाइड के कुआं में पेश कर रहे हैं, integrin लाइगैंडों पर बसने की अनुमति दी, और माइग्रेशन बफर के प्रवाह को उजागर एक पंप प्रणाली (चित्रा 2a) का उपयोग कर । कोशिकाओं को एक समय चूक वीडियो माइक्रोस्कोप प्रणाली का उपयोग कर imaged रहे हैं । छवियों तो एक मुक्त ImageJ प्लगइन, MTrack213,14, के साथ विश्लेषण के लिए स्वचालित रूप से कोशिकाओं को ट्रैक करने के लिए संसाधित कर रहे हैं । पटरियों तो वेग, सीधे, और माइग्रेशन सूचकांक सहित विभिन्न मापदंडों का निर्धारण करने के लिए मुक्त Ibidi Chemotaxis उपकरण15 के साथ quantified जा सकता है. ये मान माइग्रेशन अवरोधकों, सेल के उत्तेजितकों, chemokines, और अंय माइग्रेशन-कतरनी प्रवाह प्रेरित प्रवास पर रसायनों को प्रभावित करने के क्रम में vivo में प्रतिरक्षा सेल आंदोलन को नियंत्रित करने बलों को समझने के प्रभाव का निर्धारण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
हम यहां कोशिकाओं के प्रवास का विश्लेषण है कि कतरनी प्रवाह के बल का पता लगाने और उनके प्रवास फेरबदल द्वारा प्रतिक्रिया के लिए एक विधि का वर्णन । MZBs के एक विश्लेषण से पता चला है कि MZBs िकैम पर सहज प्रवास-1 और प?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम “ड्यूश Forschungsgemeinschaft” SFB 854/TP11 से K.-D.F से अनुदान द्वारा समर्थित था ।
Materials
| VWR Cell Strainer, 70 µm | VWR | 10199-656 |
| Pre-Separation Filters, 30 µm | Miltenyi | 130-095-823 |
| MZB and FOB cell isolation kit | Miltenyi | 130-100-366 |
| B220 CD45R, clone RA3-6B2, FITC | Biolegend | 103206 |
| CD21 / CD 35, clone 7G6, APC | BD Biosciences | 558658 |
| CD23, clone B3B4, PE | Biolegend | 101608 |
| HBSS | Biochrom | L2035 |
| D-PBS 1x | Gibco by Life Technologies | 14190-094 |
| BSA albumin fraction V, fatty acid-free | Roth | "0052.3" |
| ICAM-1 | R&D Systems | 796-IC-050 |
| Ibidi µ-slides VI 0.4, hydrophobic, uncoated | Ibidi | 80601 |
| Perfusion set, white, 50 cm, 0.8 mm | Ibidi | 10963 |
| Ibidi Pump system | Ibidi | 10902 |
References
- Alon, R., Ley, K. Cells on the run: shear-regulated integrin activation in leukocyte rolling and arrest on endothelial cells. Current Opinions in Cell Biology. 20 (5), 525-532 (2008).
- Dominguez, G. A., Anderson, N. R., Hammer, D. A. The direction of migration of T-lymphocytes under flow depends upon which adhesion receptors are engaged. Integrative Biology (Cambridge). 7 (3), 345-355 (2015).
- Steiner, O., et al. Differential roles for endothelial ICAM-1, ICAM-2, and VCAM-1 in shear-resistant T cell arrest, polarization, and directed crawling on blood-brain barrier endothelium. Journal of Immunology. 185 (8), 4846-4855 (2010).
- Valignat, M. P., Theodoly, O., Gucciardi, A., Hogg, N., Lellouch, A. C. T lymphocytes orient against the direction of fluid flow during LFA-1-mediated migration. Biophysical Journal. 104 (2), 322-331 (2013).
- Woolf, E., et al. Lymph node chemokines promote sustained T lymphocyte motility without triggering stable integrin adhesiveness in the absence of shear forces. Nature Immunology. 8 (10), 1076-1085 (2007).
- Cinamon, G., et al. Sphingosine 1-phosphate receptor 1 promotes B cell localization in the splenic marginal zone. Nature Immunology. 5 (7), 713-720 (2004).
- Cinamon, G., Zachariah, M. A., Lam, O. M., Foss, F. W., Cyster, J. G. Follicular shuttling of marginal zone B cells facilitates antigen transport. Nature Immunology. 9 (1), 54-62 (2008).
- Cyster, J. G., Schwab, S. R. Sphingosine-1-phosphate and lymphocyte egress from lymphoid organs. Annual Reviews in Immunology. 30, 69-94 (2012).
- Schwab, S. R., Cyster, J. G. Finding a way out: lymphocyte egress from lymphoid organs. Nature Immunology. 8 (12), 1295-1301 (2007).
- Cerutti, A., Cols, M., Puga, I. Marginal zone B cells: virtues of innate-like antibody-producing lymphocytes. Nature Reviews Immunology. 13 (2), 118-132 (2013).
- Mebius, R. E., Kraal, G. Structure and function of the spleen. Nature Reviews Immunology. 5 (8), 606-616 (2005).
- Tedford, K., et al. The opposing forces of shear flow and sphingosine-1-phosphate control marginal zone B cell shuttling. Nature Communications. 8 (1), 2261 (2017).
- ImageJ. MTrack2 Available from: https://imagej.net/MTrack2 (2018)
- . MTrack2 Available from: https://valelab4.ucsf.edu/~nstuurman/IJplugins/MTrack2.html (2018)
- . Chemotaxis and Migration Tool Available from: https://ibidi.com/chemotaxis-analysis/171-chemotaxis-and-migration-tool.html (2018)
- Reeves, J. P., Reeves, P. A. Removal of lymphoid organs. Current Protocols in Immunology. , (2001).
- . Manual Tracking Available from: https://imagej.nih.gov/ij/plugins/manual-tracking.html (2018)
- . ibidi Pump System Available from: https://ibidi.com/perfusion-system/112-ibidi-pump-system.html (2018)
