大鼠左心房狭窄诱导的肺静脉动脉化及2型肺动脉高压

摘要

左心房狭窄（LAS）是一种用于研究2型肺动脉高压（PH）及肺静脉动脉化机制的新型外科技术。本文中，我们介绍了一种使用钛夹缩窄大鼠左心房以诱导肺静脉动脉化并形成中度肺动脉高压的实验方案。

摘要

二尖瓣狭窄引起肺静脉动脉化及第2类肺动脉高压（PH）的机制尚不明确。由于缺乏由二尖瓣狭窄（MS）导致的第2类PH啮齿类动物模型，相关疾病机制及潜在治疗策略的研究受到限制。本文介绍一种新型大鼠模型，该模型通过左心房狭窄（LAS）引发肺静脉充血，进而导致肺静脉动脉化和第2类PH。LAS通过使用半闭合钛夹缩窄左心房实现。LAS手术后，经超声心动图检测，二尖瓣跨瓣流入速度大于或等于2.0 m/s的大鼠在8至10周内逐渐发展出肺静脉动脉化和第2类PH。本方案详细阐述了实施LAS手术的逐步操作流程。该LAS大鼠模型模拟了人类二尖瓣狭窄的病理特征，可用于研究肺静脉动脉化的分子机制，并为第2类PH的治疗策略提供临床前评估平台。

引言

本文的目的是演示在大鼠中进行左心房缩窄术（LAS）的逐步操作流程。通过手术诱导产生的LAS在人类中与二尖瓣狭窄（MS）和三房心具有高度相似性，其特征是在左心房内制造机械性梗阻¹。左心室（LV）流入道的梗阻常导致肺静脉循环淤血，患者会逐渐发展为肺动脉高压（PH）。世界卫生组织将由左心疾病引起的PH归为第2类，这是PH中最常见的类型^2,3,4。在患有左心疾病的患者中，若合并PH，其1年标准化死亡率将增加七倍以上⁴。目前，除治疗基础左心疾病（例如，通过手术置换狭窄的二尖瓣）外，尚无获批用于第2类PH的特异性疗法。然而，即使成功实施二尖瓣置换术，在多达一半的MS患者中PH仍无法完全缓解⁵。这种持续存在的PH源于不良的肺血管重构，但其机制尚不明确。因此，动物模型对于深入理解第2类PH中肺血管不良重构的分子机制至关重要。

目前存在少数几种用于研究2型肺动脉高压（PH）的动物模型。在啮齿类动物中，冠状动脉结扎^6,7和横主动脉缩窄^8,9,10是最常用的2型PH动物模型。这些模型的主要缺点是涉及左心室（LV）的损伤，使得2型PH研究结果难以解释。相比之下，在LAS模型中，左心室功能保持完整。此外，LAS模型具有临床相关性，因其可在10周内逐步、渐进地诱导PH的形成¹¹。在人类中，若经二尖瓣多普勒血流速度超过2.0 m/s，则认为二尖瓣狭窄（MS）具有临床意义¹¹；我们亦采用该数值作为临界值，以判断LAS手术是否成功诱导了显著的狭窄。此外，尽管LAS模型仅诱导轻度或中度PH，但其表现出与人类患者相似的典型组织学改变，即肺内静脉动脉化¹¹。LAS大鼠模型是一种新型且具有临床相关性的2型PH模型，其左心室功能得以保留。该模型适用于研究持续性肺血管重构的病理生理机制、识别潜在的分子靶点，并测试针对2型PH的新型治疗方法。

方案

LAS实验方案已获得济生会医科大学动物护理委员会和大学研究与伦理委员会的批准（方案编号 #2015-118）。

1. 术前准备

1. 到达动物房后，让5周龄、体重在150至200 g之间的雄性Sprague Dawley大鼠适应新环境1周，然后再进行手术操作。
2. 术前将以下设备通过高压灭菌进行准备：1）小型动物呼吸机，2）麻醉机，3）插管包（包括一对止血钳、舌压板和18 G套管针），4）外科手术器械（包括一对弯头镊子、一对直头镊子、持针器、胸腔牵开器、剪刀、5-0单股缝合线、施夹器、中大型止血夹和23 G胸腔引流管）。
3. 准备好无菌棉签和纱布，以应对术中出血。
4. 手术过程中使用加热垫维持动物体温在约37 °C。

2. 麻醉与气管插管

1. 将大鼠置于诱导室中，使用5%异氟烷与2 L/min的室内空气混合进行麻醉。
2. 插管前，使用剃毛器剃除大鼠胸部毛发，并涂抹脱毛膏以去除细小毛发。
3. 插管前检查大鼠的足底反射，以确认麻醉成功。
4. 用一根细线钩住大鼠的门齿，并用两枚图钉固定细线。
5. 使用止血钳打开大鼠口腔，并将压舌板插入其口中。
6. 抬起压舌板以观察声带。
   注意：在大鼠头部区域使用强光照射有助于清晰观察声带。
7. 将18 G套管针作为气管内导管插入气管，随后迅速将其连接至呼吸机。
8. 设定潮气量为每克体重10 µL，呼吸频率为每分钟100次。
9. 以2%异氟烷与2 L/min的室内空气混合维持麻醉状态。

3. 手术部位的准备

1. 用氯己定和酒精交替擦洗手术部位3次。
2. 皮下注射0.01 mg/kg的丁丙诺啡。
3. 用无菌巾覆盖大鼠。
4. 检查足底反射，以确认插管成功并维持麻醉状态。

4. 左心房狭窄手术

1. 用直尺在大鼠左侧腋窝下方2 cm处标记切口位置。
2. 用剪刀在左侧胸部外侧壁做一个2 cm的切口。
3. 使用直镊和弯镊分离第四与第五肋骨之间的肋间肌，直至进入胸腔。
4. 将胸腔拉钩插入胸腔内，继续使用直头和弯头镊子分离肋间肌，以直接暴露胸腺和心脏。
5. 用一对直镊子提起胸腺。用剪刀将覆盖在心脏上的胸腺组织剪除。注意避免剪伤或刺破任何主要血管。
6. 用5-0单丝缝线小心穿过左心室表面，位置位于左心耳下方，避免穿刺主要冠状动脉。
7. 缝线就位且无明显出血后，打一个松结。
8. 将缝合线向上前方牵拉，以将心脏从胸腔中提起。
9. 心脏从胸腔取出后，立即在二尖瓣上方的左心房处夹上一个中大型夹子。
   注意：夹子处于半闭合状态，其尖端夹住左心房，导致左心房狭窄。
10. 迅速将心脏放回胸腔，确保心脏在胸腔外的时间不超过30秒。
11. 移除用于提起心脏的固定缝线。
12. 使用5-0单丝缝线，以单纯间断缝合法关闭胸腔。
13. 将连接10 mL注射器的23 G胸管插入胸腔，然后使用单纯间断缝合关闭胸壁肌肉和皮肤。
14. 抽出任何空气、血液和胸腔积液 通过 使用连接的10 cc注射器抽吸插入的胸腔引流管，然后拔出导管。
15. 使用5-0单股缝线，以单纯间断缝合方式闭合皮肤层。
16. 皮下注射0.01 mg/kg的丁丙诺啡。
17. 关闭异氟烷。
18. 观察到自主呼吸后，断开呼吸机。
19. 保持大鼠插管状态，并将其置于加热垫上恢复，直至苏醒。
20. 在观察到以下一项或多项体征后，安全地拔除大鼠的气管插管：大鼠开始活动四肢、恢复翻正反射、恢复咽反射，或出现自主排空行为。

5. 术后护理

1. 每8至12小时皮下注射一次丁丙诺啡，剂量为0.01 mg/kg。术后连续两天每日皮下注射卡洛芬5 mg/kg，之后根据需要给予，若大鼠活动不佳且表现出疼痛迹象。
2. 手术后立即皮下注射5 mL生理盐水，因为大鼠在术后初期可能难以通过饮水管正常饮水。

6. 通过超声心动图确认左心房狭窄手术的成功

1. 术后2周进行经胸超声心动图检查，以测定左心室流入道血流速度。
2. 按照第1节所述步骤对大鼠进行麻醉。
3. 麻醉诱导后，通过鼻罩维持麻醉，使用2%异氟烷与2 L/min室内空气混合气体。
4. 使用剃毛器剃除大鼠胸壁毛发，并用脱毛膏清除残留毛发。
5. 将超声探头置于心脏心尖部，即左侧胸壁第五肋间区域。在此区域内移动探头，直至获得清晰的四腔心切面图像。
6. 采用脉冲波多普勒模式，在二尖瓣环上方测量左心室流入道血流速度。
7. 左心室流入道血流速度大于2.0 m/s时，可在LAS手术后8–10周成功建立中度肺动脉高压模型。

7. 假手术操作

1. 除应用夹子（步骤 4.9）外，执行上述所有步骤以制备年龄匹配的假手术对照（SOC）大鼠。

结果

术后2周通过超声心动图确认LAS的有效性。采用四腔心切面测量，左心室流入道血流速度大于2.0 m/s的大鼠被认为已形成显著性狭窄（图1），并在LAS手术后8至10周稳定发展为中度肺动脉高压及肺静脉动脉化。

LAS 手术后 10 周，LAS 组大鼠出现左心房扩大（图2B），肺充血（图2E），右心室（RV）压力超负荷（图2F)，以及肺静脉血流增加（图 2F,G）与 SOC 组大鼠相比（图 2A-E。LAS组的右心室收缩压也显著升高

讨论

LAS大鼠是一种新型的2型肺动脉高压（PH）模型，已引起领域内研究人员的广泛关注^12,13。与现有的两种2型PH模型——即使用仔猪的肺静脉狭窄（PVS）模型¹⁴和冠状动脉上主动脉缩窄（SAB）大鼠模型^8,9,10——相比，LAS大鼠模型具有多项优势。与PVS仔猪模型相比，LAS大鼠模型的构建成本更低，且在大鼠中进行的手术操作比在仔猪中更简单。与目前最常用的2型PH动物模型SAB大鼠模型相比，LAS模型中2型PH的病理生理机制更为直接，因为在SAB模型中，主动脉缩窄首先导致左心室功能衰竭，继而才引起肺淤血和肺动脉高压。LAS模型与SAB模型在啮齿类动物中很可能互为补充，有助于更深入地理解2型PH的病因学。

LAS 手术中最关键的两个步骤...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
5-0 Prolene 缝线	Johnson & Johnson - Ethicon	8725H	带 HEMO-SEAL 技术的聚丙烯缝线
麻醉机	Wakenyaku Co., Ltd.	BRTK-100A	空气泵和麻醉机
血管导管导丝	自制		将 10 cm 导丝粘接到 1 cc 注射器上
胸腔牵开器	Natsume Seisakusho Co., Ltd.	F-2
23G 胸腔引流管	自制		将 10 cc 注射器连接至 23G 针头并加装塑料管
弯头止血钳	Natsume Seisakusho Co., Ltd.	A-14
加热垫	Vivaria	MP-916-NV	维持体温在 37 摄氏度
Horizon 结扎夹	Teleflex	REF 003200	中-大号
Horizon 手动装夹中-大号结扎夹施夹器	Teleflex	REF 337085	带角度钳口的结扎夹施夹器（20 cm）
持针器	Natsume Seisakusho Co., Ltd.	MC-40
啮齿类动物呼吸机	CWE Inc	SAR-830/P	小型动物呼吸机
剪刀	Natsume Seisakusho Co., Ltd.	B-12	直剪刀，理想情况下带圆头
直头止血钳	Natsume Seisakusho Co., Ltd.	A-7
压舌板	Uchida Yoko Co., Ltd.	8-615-2417	使用宽端