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通过下一代测序鉴定小鼠和人类抗体库

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DOI：

10.3791/58804

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2019年3月15日

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1Graduate School of Life and Environmental Sciences, University of Tsukuba, 2Center for Influenza Virus Research, National Institute of Infectious Diseases, 3School of Science and Technology, Kwansei Gakuin University, 4Department of Pathology, National Institute of Infectious Diseases, 5Division of Infectious Diseases Pathology, Department of Global Infectious Diseases, Tohoku University Graduate School of Medicine, 6Division of Molecular Pathobiology, Research Center for Zoonosis Control, Hokkaido University, 7Division of Collaboration and Education, Research Center for Zoonosis Control, Hokkaido University, 8Global Station for Zoonosis Control, GI-CoRE, Hokkaido University, 9Department of Immunology, National Institute of Infectious Diseases, 10Faculty of Life and Environmental Sciences, University of Tsukuba

本文内容

摘要

本文介绍了针对完整抗体库结构与组成的分析及可视化方法。该方法涉及利用高通量测序技术获取大量抗体RNA序列。

摘要

抗体对抗原识别的巨大适应性是获得性免疫系统的基础。尽管我们已经了解获得性免疫系统产生大量抗体库的分子机制，但至今仍无法全面掌握完整的抗体库整体图景。特别是B细胞库，由于其抗体克隆数量极为庞大，一直被视为一个“黑箱”。然而，新一代测序技术正在推动突破性进展，使我们对B细胞库的理解不断深入。本文中，我们描述了一种简单且高效的方法，用于可视化和分析单个小鼠及人类的完整抗体库。从小鼠的免疫器官（代表性地取自脾脏）和人类的外周血单个核细胞中提取总RNA，经逆转录后，采用5'-RACE方法进行扩增。利用通用的正向引物和针对抗体类别特异性恒定区的反义引物，使抗体mRNA得以均匀扩增，其比例反映了它们在抗体群体中的实际频率。扩增产物通过新一代测序（NGS）进行测序，每个免疫学样本可获得超过105条抗体序列。我们还介绍了抗体序列分析的相关方案，包括V(D)J基因片段注释、抗体库的宏观视图以及我们的计算分析方法。

引言

抗体系统是获得性免疫系统的基本组成部分之一。由于其具有高度的多样性、精确的抗原识别特异性以及抗原特异性B细胞的克隆扩增能力，该系统对入侵病原体具有强大的防御作用。单个个体中能够产生抗体的B细胞库估计超过1015种1。这种巨大的多样性是由免疫球蛋白基因位点中的VDJ基因重排所介导产生的2。因此，全面描述B细胞库的组成及其在抗原免疫刺激下的动态变化，虽然具有挑战性，但对于深入理解机体针对入侵病原体的抗体应答机制至关重要。

由于B细胞受体库具有极高的多样性，长期以来被视为一个“黑箱”；然而，随着高通量测序（NGS）技术的出现，人们得以深入理解其复杂性并取得突破性进展3,4。完整的抗体受体库已成功实现分析，最初在斑马鱼中完成5，随后在小鼠6和人类中也相继实现6,7。尽管NGS现已成为研究适应性免疫应答的有力工具，但针对个体动物之间抗体受体库共性与差异的基础性分析仍显不足。

据报道，在小鼠中，个体间的IgM抗体库几乎完全相同，而IgG1和IgG2c的抗体库在不同个体之间则存在显著差异8。除了V基因的使用谱型外， naive 外周B细胞中VDJ谱型的出现频率在不同个体之间也高度相似8。对VDJ区氨基酸序列的分析还显示，不同小鼠中出现相同连接序列的频率远高于此前预期8。这些结果表明，抗体库的形成机制可能是确定性的，而非随机的5,8,9。此外，小鼠抗体库发育过程也已成功通过高通量测序（NGS）进行了分析，进一步凸显了NGS在深入解析抗体免疫系统方面的潜力10。

在本报告中，我们描述了一种简单且高效的方法，用于在全局水平上可视化和分析抗体组库。

方案

所有动物实验均按照机构指南进行，并获得日本国家传染病研究所动物护理和使用委员会的批准。本报告中作为代表性结果使用的健康成年志愿者外周血单个核细胞（PBMC）采样，已获得日本东京国家传染病研究所伦理委员会的批准，并使用经伦理委员会批准的表格获取了每位参与者的书面知情同意书。

1. 引物设计

  1. 设计一种通用的cDNA正向引物，用于无偏倚地扩增免疫球蛋白mRNA，该方法类似于5'-RACE11,12 和 SMART-PCR13 技术中所采用的方法。
  2. 针对免疫球蛋白VH基因的扩增，以免疫球蛋白恒定区中类别特异性的序列为反向引物8,14（图1A）。
    注意：可根据需要在上述任一引物中添加多重标签序列，用于标记来自不同样本来源的文库分子。此外，也可根据所用试剂盒说明书添加用于巢式PCR的序列15。
通用上游引物5'- AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3'
小鼠免疫球蛋白的下游引物（参考文献8）
IgM_CH1:5'- CACCAGATTCTTATCAGACAGGGGGCTCTC -3'
IgG1_CH1:5'- CATCCCAGGGTCACCATGGAGTTAGTTTGG -3'
IgG2c_CH1:5'- GTACCTCCACACACAGGGGCCAGTGGATAG -3'
IgG3_CH1:5'-ATGTGTCACTGCAGCCAGGGACCAAGGGA-3'
IgA_CH1:5'-GAATCAGGCAGCCGATTATCACGGGATCAC-3'
Igκ_CH1:5'- GCTCACTGGATGGTGGGAAGATGGATACAG -3'
Igλ_CH1:5'- CTBGAGCTCYTCAGRGGAAGGTGGAAACA -3'
人免疫球蛋白的下游引物（参考文献14）
IgM_CH1:5'- GGGAATTCTCACAGGAGACG -3'
IgG_CH1:5'- AAGACCGATGGGCCCTTG -3'
IgD_CH1:5'- GGGTGTCTGCACCCTGATA -3'
IgA_CH1:5'- GAAGACCTTGGGGCTGGT -3'
IgE1_CH1:5'- GAAGACGGATGGGCTCTGT -3'
IgE2_CH1:5'- TTGCAGCAGCGGGTCAAGGG -3'
Igκ_CH1:5'- TGCTCATCAGATGGCGGGAAGAT -3'
Igλ_CH1:5'- AGAGGAGGGCGGGAACAGAGTGA -3'

表1：免疫球蛋白PCR扩增的引物序列

2. 免疫细胞和组织中的核酸分离

注意：以下步骤适用于从小鼠脾脏中提取核酸，但也可用于其他免疫组织和人类细胞，例如淋巴结或外周血单个核细胞（PBMCs）（图1B）。

  1. 解剖组织， 例如，取8周龄C57BL/6小鼠的脾脏，通过不锈钢网筛（200至400 µm) 加入 2 mL PBS 缓冲液以获得分散的细胞。将细胞悬液转移至 2.0 mL 微离心管中，在 600 × g 条件下离心 5 分钟 × g 和 4 ˚C. 弃去上清液。
  2. 加入800 µL ACK裂解缓冲液（150 mM NH4Cl, 1 mM KHCO₃3，0.1 mM Na2将EDTA（pH 7.2）加入沉淀中，冰上孵育2分钟，以裂解组织中的红细胞。
  3. 用 2 mL PBS 洗涤组织细胞 3 次，随后在 600 × g 离心 5 分钟 × g 和 4 ˚C.
  4. 加入800 µL 酚/硫氰酸胍试剂加入沉淀中，充分涡旋混匀，并在约 25 ℃ 下孵育 ˚5分钟，4℃
  5. 加入氯仿（200 µL），手动振荡15秒，然后在约25℃下孵育2分钟 ˚C.
  6. 通过离心分离各相，12,000 × g 离心 15 分钟 × g 和 25 ˚C，并将上层水相转移至新管中。
  7. 加入一倍体积的70%乙醇，短暂涡旋振荡后，将溶液加入硅胶柱中。
  8. 用 30–100 μL 洗脱 RNA µ升水
  9. 使用荧光计定量初始RNA浓度（材料表).
  10. 将纯化的 RNA 储存于 -80 ˚C.

3. cDNA 合成与 PCR 扩增

注意：下述方法基于5'-RACE11,12 和 SMART-PCR 技术13。反应的详细步骤及优化方法见试剂盒说明书15。小鼠免疫球蛋白的起始材料为步骤2.10所得样品；人免疫球蛋白的起始材料为人组织样本（例如外周血单个核细胞，PBMC），其处理方法如步骤2.3至2.10所述。

  1. 从2到10的RNA样本中合成第一链cDNA µg 总 RNA 模板，使用 5'-RACE CDS 引物（含 oligo-dT）和 SMART-PCR 寡核苷酸（材料表根据制造商的说明15.
    1. 对于小鼠免疫球蛋白，使用通用正向引物和免疫球蛋白类别特异性反向引物，通过高保真DNA聚合酶对cDNA进行PCR扩增（表1）。设定热循环条件为：94 ˚C 2分钟，随后40个循环：94 ˚C，30 秒，59 ˚C，30 秒，72 ˚C，持续30秒，随后在72℃进行最终延伸步骤 ˚5 分钟，65°C
      注意：典型的实验会扩增 IgM、IgG1、IgG2c、Igk 和 Igl 免疫球蛋白类别，以分析初始型、依赖 Th1 的和依赖 Th2 的 B 细胞（图3).
    2. 对于人免疫球蛋白，执行以下操作：1st 使用通用正向引物和免疫球蛋白类别特异性反向引物进行 PCR（表1）并添加标签序列。通过2为每个样本加入索引序列nd 使用含索引序列的引物进行PCR。采用以下PCR条件和Taq DNA聚合酶：94 ˚C，2 分钟，21 个循环（1st PCR）或 32 个循环（2nd PCR）在 94 ˚C，30 秒，59 ˚C，30 秒，72 ˚C，30 秒。
      注意：典型的实验会扩增IgM、IgD、IgG（IgG1、IgG2、IgG3和IgG4）、IgA（IgA1和IgA2）、IgE、Igk和Igl免疫球蛋白类别，以检测所有B细胞群体图4).
  2. 在琼脂糖凝胶上电泳PCR产物，并使用硅胶膜离心柱纯化600至800 bp的片段。
    1. 将3.2.1或3.2.2步骤中的样品在2%琼脂糖凝胶上进行电泳。
    2. 在紫外透射仪上观察DNA条带，切取包含600至800 bp宽条带的凝胶片段。
    3. 加入10 μ每10 mg胶块加入L膜结合溶液，混匀后于50–65℃孵育 °C，直至胶块完全溶解。
    4. 将凝胶溶液转移至硅胶膜离心柱中。用洗涤缓冲液洗涤一次，用50 μL洗脱液洗脱DNA。 μ无核酸酶水 L（材料表).
  3. 使用荧光计对纯化的扩增产物进行定量，并将每个免疫球蛋白类别等量混合用于高通量测序。
    注意：通常为 2-10 μ每个免疫球蛋白类别回收得到 g 扩增子 DNA。将各样品溶液按相等的 DNA 量等比例混合，以获得 50 μ含 10-20 ng DNA 的 L 溶液μL.
  4. 使用基于微毛细管电泳的DNA片段分析芯片来确定文库的大小和浓度（材料表). 将文库保存于 -20 °C.

4. 文库的高通量测序

  1. 为测序运行生成 SampleSheet.cvs 文件，指定样本名称、索引信息，并指示仅生成 .fastq 文件。
  2. 解冻试剂盒（材料表）和文库。
  3. 配制 0.2 N NaOH，并将文库稀释至所需摩尔浓度。
  4. 清洗并干燥流动池。将 600 μL 稀释并变性的文库溶液加入试剂盒的孔中。
  5. 启动测序运行。

5. NGS 数据的质量控制

  1. 使用以下方法对 FASTQ 数据进行质量控制 "FASTX-Toolkit"16.
    注意：所用参数设置的一个基本示例如下：
    fastq_quality_trimmer -v -t 20 -l 200 -i [InFilename.fastq] -o [InFilename.fastq]
    fastq_quality_filter -v -q 20 -p 80 -i [InFilename.fastq] -o [InFilename.fastq]
    fastx_reverse_complement -v -i [InFilename.fastq] -o [InFilename.fastq]
  2. 格式化输出文件 "fasta 核酸序列 (.fna)" 通过以下命令：
    fastq_to_fasta -v -n -i [InFilename.fastq] -o [InFilename.fna]

6. 从 .fna 数据中提取和分析免疫球蛋白序列

注意：示例程序在 UNIX 环境中实现。由于性能可能依赖于操作系统和硬件环境，请将其作为示例参考使用。作者不对任何错误或遗漏承担责任。编程语言 Perl17、R18 及所需模块需根据所引用网站的说明进行安装。IgBLAST 程序需根据相应网站的说明进行安装19,20。

  1. 从 https://github.com/KzPipeLine/KzPipeLine 下载以下用于免疫组库分析的内部程序示例：
    03_PipeLine_Mouse.zip；用于小鼠抗体序列分析的一组示例程序。
    05_PipeLine_Human.zip；用于人源抗体序列分析的一组示例程序。
  2. 从测序数据中提取抗体序列：使用 Perl 程序在序列数据（.fna 文件）中搜索各免疫球蛋白恒定区的特征序列，从而提取每种免疫球蛋白类别（Ig-class）的免疫球蛋白（Ig）序列（表 2）。
    1. 对于小鼠免疫球蛋白重链（IgH）基因，使用以下命令提取序列：
      ​$ perl 01_KzMFTIgCmgggaNtdVer3_Kz160607.pl [输入文件名] [输出文件名（后缀）]
    2. 对于小鼠免疫球蛋白轻链（IgL）基因，使用以下命令提取序列：
      ​$ perl 01_KzMFTCkltNtdVer1_170810.pl [输入文件名] [输出文件名（后缀）]
    3. 对于人源免疫球蛋白重链（IgH）基因，使用以下命令提取序列：
      ​$ perl 01_KzMfHuIgHCmgadeNtdVer1_Kz180312.pl [输入文件名] [输出文件名（后缀）]
    4. 对于人源免疫球蛋白轻链（IgL）基因，使用以下命令提取序列：
      $ perl 01_KzMfHuIgCkltNtd_180316.pl [输入文件名] [输出文件名（后缀）]
  3. 注释 V(D)J 基因重排并检查其功能性：
    注意：以下所述方法使用独立版本的 IgBLAST19 对序列中的 V(D)J 基因片段进行注释。请按照文献20 所述设置 V(D)J 基因数据库及 IgBLAST 的参数。
    1. 使用以下命令注释小鼠免疫球蛋白重链（IgH）基因：
      $ igblastn -germline_db_V $IGDATA/ImtgMouseIghV_NtdDb.txt -germline_db_J $IGDATA/ImtgMouseIghJ_NtdDb.txt -germline_db_D $IGDATA/ImtgMouseIghD_NtdDb.txt -organism mouse -domain_system imgt -query ./$InFile -auxiliary_data $IGDATA/optional_file/mouse_gl.aux -show_translation -outfmt 7 >> ./$OutName
    2. 使用以下命令注释小鼠免疫球蛋白轻链（IgL）基因：
      $ igblastn -germline_db_V $IGDATA/ImtgMouseIgkV_NtdDb.txt -germline_db_J $IGDATA/ImtgMouseIgkJ_NtdDb.txt -germline_db_D $IGDATA/ImtgMouseIghD_NtdDb.txt -organism mouse -domain_system imgt -query ./$InFile -auxiliary_data $IGDATA/optional_file/mouse_gl.aux -show_translation -outfmt 7 >> ./$OutName
    3. 使用以下命令注释人源免疫球蛋白重链（IgH）基因：
      $ igblastn -germline_db_V $IGDATA/ImtgHumanIghV_NtdDb.txt -germline_db_J $IGDATA/ImtgHumanIghJ_NtdDb.txt -germline_db_D $IGDATA/ImtgHumanIghD_NtdDb.txt -organism human -domain_system imgt -query ./$InFile -auxiliary_data $IGDATA/optional_file/Human_gl.aux -show_translation -outfmt 7 >> ./$OutName
    4. 使用以下命令注释人源免疫球蛋白轻链（IgL）基因：
      $ igblastn -germline_db_V $IGDATA/ImtgHumanIgkV_NtdDb.txt -germline_db_J $IGDATA/ImtgHumanIgkJ_NtdDb.txt -germline_db_D $IGDATA/ImtgHumanIghD_NtdDb.txt -organism human -domain_system imgt -query ./$InFile -auxiliary_data $IGDATA/optional_file/human_gl.aux -show_translation -outfmt 7 >> ./$OutName
  4. 可视化抗体组库的整体特征。
    1. 使用以下命令可视化小鼠 IgH 组库：
      $ . 00a1_3DView_MoIgH_Kz180406.sh
      ​注意：输入文件为 filename.fna（序列数据），建议使用步骤 6.2.1 的输出文件。该文件需放置于名为“filename”的下级目录（文件夹）中。在 shell 脚本的第 50 行，为 Para_4 指定“filename”。
    2. 使用以下命令可视化人源 IgH 组库：
      $ . 00a1_3DView_HuIgH_Kz180411.sh
      ​注意：输入文件为 filename.fna 序列数据，建议使用步骤 6.2.3 的输出文件。该文件需放置于名为“filename”的下级目录（文件夹）中。在 shell 脚本的第 46 行，为 Para_4 指定“filename”。
    3. 使用以下命令可视化小鼠 IgL 组库：
      $ . 00_2DViewS_MoIgL_Kz180406.sh
      ​注意：在此流程中，Igk 与 Igl 被同时处理。输入文件为 filename.fna（序列数据），建议使用步骤 6.2.2 的输出文件。该文件需放置于名为“filename”的下级目录（文件夹）中。在 shell 脚本的第 53 行，为 Para_4 指定“filename”。输出文件名以“IgKlCount.txtDim2Rpm.txt”结尾，提供二维柱状图的坐标数据（图 3，IgL）。
    4. 使用以下命令可视化人源 IgL 组库：
      $ . 00_2DView_HuIgL_Kz180319.sh
      注意：在此流程中，Igk 与 Igl 被同时处理。输入文件为 filename.fna 序列数据，建议使用步骤 6.2.4 的输出文件。该文件需放置于名为“filename”的下级目录（文件夹）中。在 shell 脚本的第 53 行，为 Para_4 指定“filename”。输出文件名以“IgKlCount.txtDim2Rpm.txt”结尾，提供二维柱状图的坐标数据（图 4，IgL）。

结果

小鼠的抗体库

可以从脾脏、骨髓、淋巴结或血液等细胞或组织中整体观察小鼠抗体库的概况。图3展示了来自未免疫小鼠脾脏的IgM、IgG1、IgG2c和免疫球蛋白轻链（IgL）库的代表性结果。读数数量的汇总见表3。例如，在475,144条读数中，有166,175条包含IgM特异性特征序列（表2），其中133,371条被IgBLAST19推断为VDJ功能性产物。

图3展示了通过3D-VDJ图谱呈现的VDJ重排谱型，其中每个球体的大小代表测序读段的相对数量，即整个B细胞中抗体mRNA的数量。该三维网格由110个IGHV、12个IGHD和4个IGHJ基因构成，其排列方式反映了这些基因在染色体上的顺序。此外，被IgBLAST模糊分配的基因被分别收集在每个IGHV、IGHD和IGHJ基因行的最后一个位置，从而在立方体中形成了7,215个节点。

此外，图3 展示了一个二维VJ图（2D-VJ-plot），显示了IgL组库中VJ重排的分布情况。图中每个条形的长度代表相应序列读数的相对数量。x轴代表101个IGLVκ基因和3个IGLVλ基因，y轴代表4个IGLJκ基因和3个IGLJλ基因。未注释的V基因和J基因显示在右侧边框处。

这些有效读段所产生的互补决定区3（CDR3）序列构成了抗原结合特异性的主要部分，其序列信息由IgBLAST输出结果提供。CDR3序列可进行统计学分析，包括生物学或技术重复样本，具体方法如前所述8,10。

人类抗体库

可以从包括外周血单个核细胞（PBMCs）或病理组织在内的多种组织中整体分析人源抗体库。图4展示了来自正常PBMCs的IgM、总IgG（IgG1、IgG2、IgG3和IgG4）、总IgA（IgA1和IgA2）、IgD、IgE以及IgL库的代表性结果。表3总结了测序读段数量。例如，90,238/1,582,754条读段包含IgM特异性特征序列，其中67,896/90,238条读段为VDJ功能性重排产物。

VDJ重排的序列谱系在三维VDJ图中展示，其中每个球体的大小代表测序读段的相对数量，即来自全部PBMC的抗体mRNA数量（图4）。该三维网格由56个IGHV、27个IGHD和6个IGHJ基因构成，按其在染色体上的排列顺序进行排列。此外，由IgBLAST无法明确分配的基因分别在每个IGHV、IGHD和IGHJ基因行的末尾单独表示，从而在立方体中形成11,172个节点。

IgL组库中VJ重排的分布情况以二维VJ图展示，其中每个条形的长度代表相应序列读数的相对数量（图4）。横轴代表41个IGLVκ和32个IGLVλ基因，纵轴代表5个IGLJκ和5个IGLJλ基因。未注释的V基因和J基因显示在右侧边框处。

人类CDR3序列由IgBLAST输出提供，并可按照先前所述方法进行统计分析8,10。

免疫球蛋白类别正向引物反向引物
小鼠免疫球蛋白重链（C57BL/6）
IgMAGTCAGTCCTTCCCAAATGTCGACATTTGGGAAGGACTGACT
IgG1AAAACGACACCCCCATCTGTCGACAGATGGGGGTGTCGTTTT
(IgG1 变体)AAAACAACACCCCCATCAGTCGACTGATGGGGGTGTTGTTTT
IgG2cAAAACAACAGCCCCATCGGTCGACCGATGGGGCTGTTGTTTT
IgG3GTGATCCCGTGATAATCGGCTAGCCGATTATCACGGGATCAC
IgATCCCTTGGTCCCTGGCTGCAGTCCCTTGGTCCCTGGCTGCAG
小鼠免疫球蛋白轻链（C57BL/6）
IgκCTGTATCCATCTTCCCACCATCCAGTGAGCGCTCACTGGATGGTGGGAAGATGGATACAG
Igλ1TGTTTCCACCTTCCTCTGAAGAGCTCGAGCTCGAGCTCTTCAGAGGAAGGTGGAAACA
Igλ2TGTTTCCACCTTCCTCTGAGGAGCTCAAGCTTGAGCTCCTCAGAGGAAGGTGGAAACA
Igλ3TGTTTCCACCTTCCCCTGAGGAGCTCCAGCTGGAGCTCCTCAGGGGAAGGTGGAAACA
Igλ4TGTTCCCACCTTCCTCTGAAGAGCTCAAGCTTGAGCTCTTCAGAGGAAGGTGGGAACA
人免疫球蛋白重链
IgMGGGAGTGCATCCGCCCCAACGTTGGGGCGGATGCACTCCC
IgGGCTTCCACCAAGGGCCCATCGATGGGCCCTTGGTGGAAGC
IgAGCATCCCCGACCAGCCCCAAGACCGATGGGGCTGTTGTTTT
IgDGCACCCACCAAGGCTCCGGATCCGGAGCCTTGGTGGGTGC
IgEGCCTCCACACAGAGCCCATCGATGGGCTCTGTGTGGAGGC
人免疫球蛋白轻链
IgκACTGTGGCTGCACCATCTGCGCAGATGGTGCAGCCACAGT
Igλ1,2,6GTCACTCTGTTCCCGCCCTCGAGGGCGGGAACAGAGTGAC
Igλ3,7GTCACTCTGTTCCCACCCTCGAGGGTGGGAACAGAGTGAC

表2：免疫球蛋白特征序列汇总

小鼠 IgH总读数IgMIgG1IgG2c
输入475,144
含 IgC166,175229,67136,628
VDJ 可读框133,371196,58331,446
小鼠 IgL总读数IgKappaIgLambda
输入527,668
含 IgC178,94821,446
VJ 可读框160,92416,988
人 IgH总读数IgMIgGIgAIgDIgE
输入1,582,754
含 IgC90,2385,29894,06175,5492,932
VDJ 可读框67,8962,77578,20356,4953
人 IgL总读数IgKappaIgLambda
输入1,582,754
含 IgC120,31664,148
VJ 可读框97,16952,324

表3：实验中读段数量的汇总

figure-results-1
图 1：分析单只小鼠抗体库的测序策略示意图。（A）从免疫细胞或组织中提取的总RNA经反转录后，使用通用上游引物和免疫球蛋白类别特异性下游引物进行PCR扩增。来自每种免疫球蛋白类别的扩增产物被混合后用于高通量测序。（B） 生物学重复样本（如C57BL/6小鼠的脾脏）处理方式如下：从脾脏样本中纯化总RNA，通过5'-RACE方法使用通用引物和抗体类别特异性引物扩增cDNA，随后使用针对单只小鼠的标记引物进行高通量测序。图中部分内容经许可改编自8。请点击此处查看本图的放大版本。

figure-results-2
图2：分析单只小鼠抗体库的数据处理流程示意图。 经高通量测序获得的扩增子序列按以下步骤进行处理：（1）检查读段序列中是否存在抗体类别特异性的特征序列；（2）使用IMGT/HighV-Quest和/或IgBLAST对序列中的V、D和J基因片段进行鉴定；（3）收集包含功能性VDJ连接的序列；（4）利用这些序列进行抗体库整体特征、CDR3等的分析。请点击此处查看本图的放大版本。

figure-results-3
图3：小鼠抗体库的全局数据可视化。 各抗体类别总体库谱型通过3D-VDJ图进行可视化展示。x轴表示染色体上排列顺序的110个IGHV基因，y轴和z轴分别表示12个IGHD基因和4个IGHJ基因。每个节点上球体的体积代表测序读段数量。红色球体：未注释的V、D和J基因。IgL读段分布显示在2D-VJ图中，其中每个条形的长度代表相对读段数。x轴表示101个IGLVκ和3个IGLVλ基因，y轴表示4个IGLJκ和3个IGLJλ基因。未注释的V和J基因显示在右侧边框处。请点击此处查看该图的放大版本。

figure-results-4
图4：人类抗体库的全局数据可视化。 各抗体类别总体库谱型通过3D-VDJ图进行可视化展示。x轴表示染色体上排列顺序的56个IGHV基因，y轴和z轴分别表示27个IGHD基因和6个IGHJ基因。每个节点上球体的体积代表测序读段数量。红色球体：未注释的V、D和J基因。IgL读段在2D-VJ图上排列，其中每个条形的长度代表读段的相对数量。x轴表示41个IGLVκ和32个IGLVλ基因，y轴表示5个IGLJκ和5个IGLJλ基因。未注释的V基因和J基因显示在右侧边框处。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

本文所述方法利用下一代测序技术（NGS）对采用5'-RACE方法扩增的抗体RNA进行分析。与使用简并性5'-VH基因引物的方法相比，该方法使用通用正向引物可均衡地扩增每种抗体类别对应的mRNA。此外，通过使用针对抗体基因恒定区1（CH1）的反向引物，可实现对特定免疫球蛋白类别的库谱分析。这对于解析类别特异性的抗体应答，以及比较未免疫与免疫后抗体库谱具有重要意义8,9。

该方法最可能的缺陷是扩增的免疫球蛋白信息量不足。通过本方案获得的抗体库深度在很大程度上取决于步骤 3.1 和 3.2 中描述的 PCR 扩增。如果未能获得理想的库深度，强烈建议调整步骤 3.2.1 或 3.2.2 中模板 cDNA 与引物的比例。

通常，NGS 产生的抗体序列读段中约有 20% 为模糊序列21。即使采用已建立的"校正方法"，仍有 5–10% 的序列保持模糊3。因此，我们对序列进行了分析，并筛选出含有对应于免疫球蛋白恒定区（CμH1、Cγ1H1、Cγ2cH1 等）特征序列的原始读段。因此，体细胞高频突变的分析需要仔细审慎的评估。

该方法的一个局限性在于无法推断出免疫球蛋白重链和轻链的配对关系，因此通过该方法获得的免疫组库图谱并不完整。然而，可以通过对数据进行统计分析来近似推断出排名靠前的链对10。此外，最近已有研究报道了一种用于测序免疫球蛋白配对链的新方法3,4。

基于免疫球蛋白基因特征序列的存在，从输出的.fna数据中提取了免疫球蛋白序列。随后对V、D和J基因片段进行注释，并评估V(D)J重排的功能性。同时对互补决定区3（CDR3）序列进行了注释。这些对.fna数据中免疫球蛋白序列的系统性分析由IMGT/HighV-QUEST服务器提供支持22,23,24。然而，构建自动化处理流程具有分析大规模实验数据的优势。通过使用独立运行的IgBLAST协议19，可根据不同研究目的定制化建立分析流程。该方法需要具备基本的编程能力，但对免疫球蛋白系统的深入分析极为有用。文中所述流程即为定制化协议的示例（图2）。

抗体序列读段的数量与样本中抗体RNA的含量成正比，反映了特定时间点抗体系统的抗体组成5,8,25。本文所述方法利用R语言程序，对抗体库的V(D)J构成长远概览进行分析8,18,26。

对单个未成熟小鼠IgM抗体库的全局分析显示，其VDJ谱型相较于IgG1或IgG2c具有高度保守性8。据报道，未成熟斑马鱼的VDJ组合具有高度刻板性9。相比之下，人类的VDJ组合则被报道为高度偏倚6。未成熟B细胞中这种高度保守且具有确定性的VDJ谱型，可能由偏倚的VDJ重排或体内自身抗原介导的阴性选择所产生。例如，IGHV11-2在胎儿IgM抗体库中优先表达27，这种优势表达被认为与其对衰老红细胞的自身反应性有关27。有趣的是，在我们先前发表的未成熟IgM分析中，IGHV11-2同样是出现频率最高的主要抗体库成分8。

本文所述方法通过全面分析个体体内产生的抗体库空间，有助于解析抗原响应性抗体库，避免关键抗体库的意外遗漏8,10。该方法还可用于研究抗体网络的精细动态变化，从而加速发现针对新出现病原体的保护性抗体。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本研究由日本医疗研究开发机构（AMED）资助，资助编号为JP18fk0108011（KO和SI）及JP18fm0208002（TS、KO和YO），并获得日本文部科学省科研费资助（15K15159）支持（KO）。我们感谢山口沙由里和佐佐木理惠提供的宝贵技术支持。同时感谢Editage（www.editage.jp）提供英文语言编辑服务。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.2 mL 离心管条Thermo Fisher ScientificAB0452120 条
100 bp DNA MarkerTOYOBODNA-0350.5 mL
2100 生物分析仪系统Agilent TechnologiesG2939BA /2100
乙酸Wako017-00256500 mL
琼脂糖，NuSieve GTGLonza50084
氯化铵Wako017-02995500 g
氯仿Wako038-02606500 mL
Dulbecco's PBS (-)“Nissui”NISSUI 08192
乙二胺四乙酸二钠盐二水合物（2NA）Wako345-01865500 g
Falcon 40 µm 细胞滤网Falcon352340每箱 50 个
ling lock 管 1.7 mLBM EQUIPMENTBM-15
ling lock 管 2.0 mLBM EQUIPMENTBM-20
MiSeq 试剂盒 v2illuminaMS-102-2003500 个循环
MiSeq 系统illuminaSY-410-1003
NanoDrop 2000c 分光光度计 Thermo Fisher Scientific
碳酸氢钾Wako166-03275500 g
PureLink RNA 小量提取试剂盒life technologies12183018A
Qubit 3.0 荧光计Thermo Fisher ScientificQ33216
Qubit dsDNA HS 检测试剂盒Thermo Fisher ScientificQ32854500 次检测
SMARTer RACE 5’/3’ 试剂盒 Clontech 634858
TaKaRa Ex Taq Hot Start 版本 Takara Bio Inc. RR006A 
Trizma 碱基SigmaT60661 kg
TRIzol 试剂AmbionThermo Fisher Scientific15596026100 mL
超透明 qPCR 封口膜Thermo Fisher ScientificAB0866120 条
UltraPure 溴化乙锭Thermo Fisher Scientific15585011
Wizard SV 凝胶与 PCR 产物纯化系统 Promega A9282

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V D J 5 RACE

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