大肠杆菌基于细胞的无细胞蛋白质合成：一种稳健、灵活且易于获取的平台技术的操作方案

摘要

本方案详细说明了在4天或更短时间内制备基于大肠杆菌（E. coli）的细胞提取物并实施体外（in vitro）蛋白质合成反应所需的步骤、成本和设备。为了充分利用该平台的灵活性以适用于广泛的应用，我们讨论了可调整和优化的反应条件。

摘要

在过去的50年中，无细胞蛋白质合成（CFPS）作为一种强大的技术逐渐兴起，能够在试管中利用细胞的转录和翻译能力。由于无需维持细胞的活性，并且消除了细胞屏障，CFPS已成为生物制造传统上难以表达的蛋白质、快速构建代谢工程原型以及功能基因组学等新兴应用的基础。我们所提供的基于大肠杆菌（E. coli）的CFPS平台实施方法，使新用户能够便捷地开展上述多种应用。本文描述了通过使用富集培养基、带挡板的锥形瓶以及可重复调控的超声波细胞裂解方法来制备细胞提取物的技术流程。该提取物可用于蛋白质表达，在实验开始后仅5小时内即可产生900 µg/mL或更高浓度的超折叠绿色荧光蛋白（sfGFP），前提是相关试剂储备已预先配制完成。获取所需试剂的初始成本约为4,500美元，此后可支持数千次反应，每次反应的蛋白质生产成本约为0.021美元/µg，或0.019美元/µL反应体系。此外，由于对试剂预混液进行了优化，该蛋白质表达方法在操作便捷性上可媲美商业系统，而成本仅为后者的极小部分。为了帮助用户充分发挥CFPS平台的灵活性以适应广泛的应用需求，我们总结了该平台中多个可根据可用资源和目标蛋白表达效果进行调节与优化的关键环节。

引言

无细胞蛋白质合成（CFPS）技术在过去50年中已发展成为一项开创性技术，为蛋白质生产、功能基因组学、代谢工程等领域带来了诸多新机遇^1,2与标准相比 在体 蛋白质表达平台中，CFPS 具有三个关键优势：1）该平台的无细胞特性能够实现对细胞可能具有毒性或外源性蛋白的生产^3,4,5,6；2）通过失活基因组DNA并引入编码目标基因的模板DNA，可将反应体系中的全部系统能量导向目标蛋白的表达；3）该平台的开放性使用户能够实时调整并监测反应条件与组分^7,8这种对反应的直接介入支持在扩展的化学体系和氧化还原条件下增强生物系统，以实现新型蛋白质的合成及代谢过程的调控。²

方案

1. 培养基制备与细胞培养

1. 第1天
   1. 划线 E. coli 从甘油菌种中将BL21*(DE3)细胞接种至LB琼脂平板，37 °C条件下培养至少18小时。
   2. 配制50 mL LB培养基，于121 °C液体循环条件下高压灭菌30 min，室温保存。
2. 第2天
   1. 按照补充信息中的说明，配制750 mL的2x YTP培养基和250 mL的0.4 M D-葡萄糖溶液。
   2. 将2倍浓度YTP培养基倒入已灭菌的2.5 L挡板烧瓶中，将D-葡萄糖溶液倒入已灭菌的500 mL玻璃瓶中。在121 °C条件下，对两种溶液均采用液体循环程序进行高压灭菌30分钟。
   3. 确保两种无菌溶液在37 °C下保存，若次日将进行细胞培养，以在接种时最大化细胞生长速率。在接种前请勿混合溶液。
      注意：如有需要，溶液可在 4 °C 下保存 1–2 天，但 2x YTP 培养基极易被污染。
   4. 接种一环经灭菌的接种环，采用无菌操作技术，将单个BL21(DE3)菌落接种于50 mL LB培养基中，过夜培养。
   5. 将50 mL BL21*(DE3) LB培养液置于37 °C、250 rpm的摇床培养箱中，培养15–18小时。
   6. 准备并灭菌第3天和第4天所需的....

结果

我们介绍了一种基于超声处理的 E. coli 提取物制备方案，可在四天内完成，图1 展示了每一天的具体操作流程。各步骤在时间安排上具有一定灵活性，并可在多个节点暂停，但我们发现当前的工作流程执行效果最佳。此外，细胞沉淀（步骤1.3.18）和完全制备好的提取物（步骤2.10）在-80 °C下至少可稳定保存一年，用户可制备较大批量的样品以供后续使用¹⁷。该提取物不仅长期稳定，还可经历至少五次冻融循环而不会显著降低其活性（图4）。因此，若冰箱存储空间有限，可将提取物分装为较大体积的 aliquot 以供多次使用。然而，我们建议尽可能分装为多个较小体积的 aliquot（约100 μL）。

每次制备新的提取物时，建议用户进行镁离子滴定实验，以确.......

讨论

无细胞蛋白质合成已成为一种强大且具有推动作用的技术，适用于从生物制造到生化系统快速原型构建等多种应用。其广泛的应用得益于实时监测、操控和增强细胞机制的能力。尽管该平台技术的影响不断扩大，但由于实验方法在实施过程中存在技术上的细微复杂性，其广泛应用仍进展缓慢。本研究旨在为新实验室建立该技术提供简便性和清晰性。为此，我们提供的基于 E. coli 的无细胞蛋白质合成平台，可由受过基本训练但非专家的实验人员（如本科生）在四天内完成启动（图1）。此外，一旦制备出试剂和提取物的储备液，后续的CFPS批次反应可在仅5小时内完成设置、孵育和定量分析。一次1 L的细胞培养可获得足够进行四百次15 µL CFPS反应的提取物，而其他无细胞试剂的单次批量制备则可支持数千次反应。若需要更大的储备量，试剂制备也可相应放大。CFPS反应可通过使用96孔板或PCR管并行测试多种条件，以高通量方式设置。当使用较小容器时，体积产率会下降，如图2C所示。CFPS反应也可从微升级别放大至数十毫升的总体积，以提高单一条件下的总蛋白产量。在.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
LB培养基	ThermoFisher	12795027
胰蛋白胨	Fisher Bioreagents	73049-73-7
酵母提取物	Fisher Bioreagents	1/2/8013
NaCl	Sigma-Aldrich	S3014-1KG
磷酸氢二钾	Sigma-Aldrich	60353-250G
磷酸二氢钾	Sigma-Aldrich	P9791-500G
D-葡萄糖	Sigma-Aldrich	G8270-1KG
KOH	Sigma-Aldrich	P5958-500G
IPTG	Sigma-Aldrich	I6758-1G
Mg(OAc)₂	Sigma-Aldrich	M5661-250G
K(OAc)	Sigma-Aldrich	P1190-1KG
Tris(OAc)	Sigma-Aldrich	T6066-500G
DTT	ThermoFisher	15508013
tRNA	Sigma-Aldrich	10109541001
亚叶酸	Sigma-Aldrich	F7878-100MG
NTPs	ThermoFisher	R0481
草酸	Sigma-Aldrich	P0963-100G
NAD	Sigma-Aldrich	N8535-15VL
CoA	Sigma-Aldrich	C3144-25MG
PEP	Sigma-Aldrich	860077-250MG
K(Glu)	Sigma-Aldrich	G1501-500G
NH₄(Glu)	MP Biomedicals	02180595.1
Mg(Glu)₂	Sigma-Aldrich	49605-250G
亚精胺	Sigma-Aldrich	S0266-5G
腐胺	Sigma-Aldrich	D13208-25G
HEPES	ThermoFisher	11344041
分子生物学级水	Sigma-Aldrich	7732-18-5
L-天冬氨酸	Sigma-Aldrich	A7219-100G
L-缬氨酸	Sigma-Aldrich	V0500-25G
L-色氨酸	Sigma-Aldrich	T0254-25G
L-苯丙氨酸	Sigma-Aldrich	P2126-100G
L-异亮氨酸	Sigma-Aldrich	I2752-25G
L-亮氨酸	Sigma-Aldrich	L8000-25G
L-半胱氨酸	Sigma-Aldrich	C7352-25G
L-甲硫氨酸	Sigma-Aldrich	M9625-25G
L-丙氨酸	Sigma-Aldrich	A7627-100G
L-精氨酸	Sigma-Aldrich	A8094-25G
L-天冬酰胺	Sigma-Aldrich	A0884-25G
甘氨酸	Sigma-Aldrich	G7126-100G
L-谷氨酰胺	Sigma-Aldrich	G3126-250G
L-组氨酸	Sigma-Aldrich	H8000-25G
L-赖氨酸	Sigma-Aldrich	L5501-25G
L-脯氨酸	Sigma-Aldrich	P0380-100G
L-丝氨酸	Sigma-Aldrich	S4500-100G
L-苏氨酸	Sigma-Aldrich	T8625-25G
L-酪氨酸	Sigma-Aldrich	T3754-100G
Fisherbrand 高级微量离心管：2.0 mL	Fisher Scientific	05-408-138
Fisherbrand 高级微量离心管：1.5 mL	Fisher Scientific	05-408-129
Fisherbrand 高级微量离心管：0.6 mL	Fisher Scientific	05-408-120
PureLink HiPure 质粒提取试剂盒	ThermoFisher	K210007
超声波处理器	QSonica	Q125-230V/50Hz	3.175 mm 直径探头
Avanti J-E 离心机	Beckman Coulter	369001
JLA-8.1000 转子	Beckman Coulter	366754
1L 离心管	Beckman Coulter	A99028
Tunair 2.5L 带挡板摇瓶	Sigma-Aldrich	Z710822
Microfuge 20	Beckman Coulter	B30134
New Brunswick Innova 42/42R 恒温摇床	Eppendorf	M1335-0000
Cytation 5	BioTek
Strep-Tactin XT 初级试剂盒	IBA	2-4998-000
pJL1-sfGFP	Addgene	69496
BL21(DE3)	New England BioLabs