需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用

方法文章

二维静电纺纳米纤维膜扩展为三维支架

6.4K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/58918

⸱

2019年1月7日

 ,  ,  , 
1Department of Surgery-Transplant and Mary & Dick Holland Regenerative Medicine Program, University of Nebraska Medical Center

本文内容

摘要

本文演示了一种通过减压亚临界CO2流体，将传统的二维（2D）静电纺丝纳米纤维膜扩展为三维（3D）支架的技术。这些增强型支架具有三维结构，能够紧密模拟细胞的纳米级拓扑结构信号，并保持封装在纳米纤维内生物分子的功能。

摘要

由于静电纺丝技术能够模拟细胞外基质，并可方便地调控纤维的成分、结构和直径，因此已成为制备合成型功能性支架的首选技术。然而，尽管具有上述优势，传统的静电纺纳米纤维支架仍存在诸多局限性，包括纳米纤维取向无序、孔隙率低、孔径小以及主要为二维膜状结构。因此，迫切需要开发一种新工艺，以克服上述限制。本文介绍了一种新颖且简便的方法：通过亚临界CO2流体减压，将传统的二维纳米纤维膜转化为具有理想厚度、间隙距离、孔隙率和纳米形貌特征的三维支架，从而支持细胞接种与增殖。除了为组织再生提供支架外，该方法还可实现抗菌肽等生物活性分子的包载，用于局部药物递送。这种经CO2膨胀形成的纳米纤维支架在组织再生、伤口愈合、三维组织建模及局部药物递送方面具有广阔的应用前景。

引言

开发一种可植入患者体内以促进组织修复与再生的合成支架，这一理念已在再生医学领域盛行数十年。理想的合成支架应能诱导周围健康组织中的细胞迁移，为细胞的接种、黏附、信号传导、增殖和分化提供结构支持，促进血管化，保障充足的氧气和营养供应，并增强宿主免疫反应，以确保植入后的成功1。此外，它还可作为载体嵌入抗菌分子，以辅助伤口愈合1,3,6,7,8,9。在支架设计过程中，另一个备受关注的特性是能够控制这些生物分子从合成支架中的时序性释放1。

静电纺丝是一种广泛用于制备纳米纤维支架的技术1,2,3,4,5,6此前在构建此类纳米纤维支架方面已有多次尝试，且取得不同程度的成功。然而，传统纳米纤维支架在实现这些目标方面能力有限。传统纳米纤维支架主要为二维膜状结构。1,3这些未膨胀的支架结构致密，孔径较小；这限制了细胞的浸润、迁移和分化，因其无法提供与体内类似环境足够相似的条件 体内1,7,8,9因此，人们已建立更新的3D静电纺纳米纤维支架制备技术，以弥补传统2D纳米纤维膜固有的缺陷。这些技术可制备出3D支架，但由于其制备方法需使用水溶液及冷冻干燥工艺，应用范围受到限制。此类加工过程导致纳米纤维呈随机分布，缺乏有序排列、适宜厚度和/或理想的孔隙率，因而无法提供细胞迁移与增殖所必需的适当纳米形貌信号。上述因素导致先前的3D静电纺纳米纤维支架难以充分模拟活体组织的结构特征1,7,8,9.

近年来，人们尝试开发具有更好细胞外基质（ECM）仿生性能的扩展型三维支架，采用水相硼氢化钠（NaBH4）溶液处理结合预设计的模具，以更精确地控制所得支架的形状7,8。然而，该方法并不理想，因其需要使用水溶液、发生化学反应以及冷冻干燥过程，这些步骤可能干扰聚合物及任何包封的水溶性生物分子。所使用的添加剂在组织再生过程中也可能引发副作用8,9。本文所述的CO2发泡方法显著缩短了加工时间，无需使用水溶液，并在更大程度上保持了生物活性分子的数量及其功能，优于以往 established 的方法9。

在以往的研究中，抗生素、银、1α,25-二羟基维生素D3以及抗菌肽LL-37被单独或联合载入纳米纤维支架中，以研究这些支架释放活性物质以促进伤口愈合的潜力9,10,12,13。为了展示这种纳米纤维支架扩展方法的应用，本研究将荧光染料香豆素6（Coumarine 6）载入支架中，以演示将多种目标化合物包埋于支架内的可行性。这种结合了包封生物活性分子的扩展型纳米纤维支架制备方法，在组织再生、伤口愈合、三维组织模型构建以及药物局部递送方面具有广阔的应用前景。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

以下所述的所有 in vivo 操作均经内布拉斯加医学中心大学动物护理与使用委员会（IACUC）批准。

1. 准备标准静电纺丝所需的溶液

  1. 在20 mL玻璃试管中，将2 g聚(ε-己内酯)（PCL，Mw = 80 kDa）溶于二氯甲烷（DCM）与N,N-二甲基甲酰胺（DMF）的混合溶剂中，溶剂体积比为4:1（v/v），浓度为10%（w/v）。
    注意：操作DCM和DMF时应在通风良好的通风橱中进行，避免接触蒸气。切勿使DCM接触塑料材料。
  2. 将玻璃试管置于实验室旋转混合仪中，直至溶液变为澄清。溶液可过夜混合。
  3. 若需将生物活性物质（如多肽或药物）包埋入支架中，应另配制溶液，并于4 °C保存，待用时取出。
    1. 使用20 mL PCL溶液配制荧光染料溶液（50 μg/mL）。

2. 安装静电纺丝装置（图1A）

  1. 将PCL溶液加入一个装有21号平头针头的20 mL注射器中。确保注射器及相连管路中无气泡。
  2. 将一个旋转钢制滚筒放置在距离针尖12 cm处作为接地收集器。
  3. 使用鳄鱼夹将直流（DC）高压电源连接至针头，并确保收集器已接地。
    警告：在接触任何连接部件前，务必先关闭电源。

3. 电纺丝

  1. 对于20 mL的PCL溶液，将注射泵参数设置如下：直径 = 20.27 mm，流速 = 0.5 mL/h。检查针尖处是否形成液滴。
  2. 若需掺入生物活性分子，请搭建装置以实现同轴电纺丝 (图1B)。使用皮下注射针头自制同轴喷嘴。
    注：此类喷嘴也可商业购买。注意，此处配制染料溶液用于模拟添加此类分子。
    1. 配制1%的荧光染料香豆素6水溶液。取3 mL该1%染料溶液加入小型注射器中。将该注射器连接至与PCL溶液相同的同轴喷嘴。再次确保无气泡存在。
    2. 对于该3 mL溶液，将注射泵参数设置如下：直径 = 9.49 mm，流速 = 0.02 mL/h。检查针尖处是否形成液滴。
  3. 在喷丝头（22号针头）与位于喷丝头20 cm远处的接地收集器之间施加20 kV的电势。在以2,000 rpm旋转的滚筒上收集取向的纳米纤维膜。当PCL纳米纤维膜厚度达到约1 mm时，停止收集。

4. 制备带有阵列孔的PCL纳米纤维膜。

  1. 制备PCL纳米纤维膜。
    1. 将PCL微珠溶解于体积比为4:1（v/v）的DCM和DMF混合溶剂中，配制成浓度为10%（PCL）（w/v）的溶液。使用注射泵以0.7 mL/h的流速推送PCL溶液，同时在喷丝头（22号针头）与接地收集器之间施加20 kV电压，喷丝头与收集器间距为12 cm。
    2. 使用转速大于500 rpm的旋转滚筒收集纳米纤维膜。
  2. 将PCL纳米纤维膜浸入液氮中2 5 分钟（即，变得僵硬）。将PCL纳米纤维膜保存在液氮中2 用直径为0.5 mm的打孔器对PCL纳米纤维膜进行打孔。

5. 带孔阵列与无孔二维纳米纤维膜的扩增 通过 亚临界CO₂2 液体（图2）。

  1. 将PCL纳米纤维膜置于液氮中5分钟，然后在液氮中使用锋利的手术剪将其剪成1 cm × 1 cm的正方形，以避免边缘变形。
  2. 将剪好的纤维膜放入一个30 mL离心管中，并加入约1 g干冰。拧紧管盖，使干冰转化为液态CO2。
  3. 当管内形成液体后，迅速打开管盖释放压力。
    注意：操作液氮和干冰时应穿戴适当的热防护装备。切勿将加压的离心管开口朝向面部。离心管不应重复使用。
  4. 从管中取出并观察膨胀后的支架。将支架转移至新的含干冰的离心管中，重复上述步骤直至达到所需厚度。在与细胞共培养前，使用环氧乙烷对膨胀后的纳米纤维支架进行灭菌处理。

6. 扩展型纳米纤维支架的表征

  1. 使用扫描电子显微镜（SEM）表征扩增的纳米纤维支架的形态与结构。
    1. 将样品用双面导电胶带固定至金属载物钉上，使用溅射镀膜仪在40 mA电流下镀铂40秒。
    2. 根据以往研究，使用扫描电镜（SEM）观察纤维9在15 kV的加速电压下采集图像。
  2. 表征 体外 释放曲线及释放肽段的生物活性
    1. 称量10 mg纳米纤维膜在CO中膨胀前后的重量2.
    2. 将样品浸入PBS缓冲液中，并在不同时间点（0-28天）收集10 μL上清液。
    3. 使用酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒定量检测所收集上清液中LL-37肽的浓度。
  3. 观察细胞浸润 体内 以及宿主反应。
    1. 将9周龄的Sprague-Dawley（SD）大鼠放入麻醉舱中，连接异氟烷挥发罐进行麻醉。待大鼠完全失去知觉后，将其转移至手术台。术中持续通过异氟烷鼻罩连接挥发罐维持麻醉。使用动物专用剃毛器剃除大鼠背部毛发，并用碘伏和酒精进行皮肤消毒。用手术刀在背部脊柱上方区域做1.5 cm切口，建立皮下囊袋。
    2. 使用镊子将一片扩展的纳米纤维支架（1.5 mm 厚）植入每个切口的皮下袋中。使用缝合器闭合切口。
    3. 在1、2和4周时，用95% CO处死大鼠2用手术剪刀轻轻解剖外植体及其周围组织。在进行组织学分析之前，将组织浸入福尔马林中至少3天，然后进行石蜡包埋。使用切片机对组织进行切片，随后进行苏木精和伊红（H&E）染色。&E)，Masson三色染色。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

通过亚临界CO2流体减压将传统的二维静电纺丝纳米纤维膜扩展为三维支架的有效性在多个方面得到了验证：未经处理的支架厚度为1 mm，经一次和两次CO2处理后，厚度分别增至2.5 mm和19.2 mm（图3A-C）。孔隙率——这一对细胞接种至关重要的结构特征——也随厚度增加而相应提高（图3C）。支架的孔隙率从未经处理纤维膜的79.5%分别提升至第一次和第二次处理后的92.1%和99.0%（图3D）。这一点具有重要意义，因为细胞向支架内部的渗透程度及其诱导再生的能力在很大程度上取决于孔隙率1。

SEM 图像显示，未经处理的二维膜具有致密堆积的纤维状结构，经 C...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

将传统的二维静电纺纳米纤维膜转化为三维扩展支架 通过 CO2 减压过程被研究。传统的二维纳米纤维膜成功地被扩展 通过 亚临界CO₂2 液体。关键步骤是在优化条件下制备二维纳米纤维膜，并在不使边缘变形的情况下切割纤维膜例如，使用锋利的手术剪）。此CO2- 扩展的纳米纤维支架相较于传统的二维膜具有多种优势，包括分层结构（图3A- B），较低的包装密度（图3D- H），以及更高的孔隙率（图 3D该扩增方法相较于现有的扩增方法还具有优势，因其处理速度更快，且由于该技术避免了水溶液和冷冻干燥步骤，从而减少了包封的活性生物分子的整体损失。8,9然而，该技术的局限性在于聚合...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

作者声明不存在利益冲突。

致谢

本工作获得了美国国立卫生研究院普通医学科学研究所（NIGMS）资助（J.X. 获资助号 2P20 GM103480-06 和 1R01GM123081）、Otis Glebe 医学研究基金会、NE LB606 项目以及内布拉斯加大学医学中心启动资金的支持。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
聚己内酯Sigma-Aldrich440744
N,N-二甲基甲酰胺Fisher ChemicalD-199-1
二氯甲烷Fisher ChemicalAC61093-1000
香豆素6Sigma-Aldrich546283
旋转钢制滚筒定制在静电纺丝过程中用作收集装置。
注射泵Fisher Scientific14-831-200同轴纺丝需要两个单通道注射泵。
RevolverLab Net InternationalH5600可调节实验室旋转混合仪，用于混合溶液
皮下注射针头（27G × 1 1/2"）EXCELINT International Co26426这是所示示例定制同轴喷嘴的组成部分。
皮下注射针头（21G × 1 1/2"）EXCELINT International Co26416这是所示示例定制同轴喷嘴的组成部分。
高压直流电源Gamma High Voltage ResearchES30
扫描电子显微镜FEINova 2300
荧光显微镜ZeissAxio Imager 2
LL 37 ELISA试剂盒Hycult BiotechHK321-02

参考文献

  1. Chen, S., et al. Recent advances in electrospun nanofibers for wound healing. Nanomedicine. 12 (11), 1335-1352 (2017).
  2. Khandalavala, K., Jiang, J., Shuler, F. D., Xie, J. Electrospun Nanofiber Scaffolds with Gradations in Fiber Organization. Journal of Visualized Experiments. (98), e52626(2015).
  3. Xie, J., Li, X., Xia, Y. Put electrospun nanofibers to work for biomedical research. Macromolecular Rapid Communication. 29 (22), 1775-1792 (2008).
  4. Xie, J., et al. Nanofiber membranes with controllable microwells and structural cues and their use in forming cell microarrays and neuronal networks. Small. 7 (3), 293-297 (2011).
  5. Xie, J., et al. Radially aligned, electrospun nanofibers as dural substitutes for wound closure and tissue regeneration applications. ACS. 4 (9), 5027-5036 (2010).
  6. Xie, J., et al. "Aligned-to-random" nanofiber scaffolds for mimicking the structure of the tendon-to-bone insertion site. Nanoscale. 2 (6), 923-926 (2010).
  7. Jiang, J., et al. Expanded 3D Nanofiber Scaffolds: Cell Penetration. Neovascularization, and Host Response. Advanced Healthcare Materials. 5 (23), 2993-3003 (2016).
  8. Jiang, J., et al. Expanding Two-Dimensional Electrospun Nanofiber Membranes in the Third Dimension by a Modified Gas-Foaming Technique. ACS Biomaterials Science & Engineering. 10 (1), 991-1001 (2015).
  9. Jiang, J., et al. CO2-expanded nanofiber scaffolds maintain activity of encapsulated bioactive materials and promote cellular infiltration and positive host response. Acta Biomaterialia. 68, 237-248 (2018).
  10. Chen, S., et al. Nanofiber-based sutures induce endogenous antimicrobial peptide. Nanomedicine. 12 (10), 2597-2609 (2017).
  11. Dhand, C., et al. Bio-inspired crosslinking and matrix-drug interactions for advanced wound dressings with long-term antimicrobial activity. Biomaterials. 138, 153-168 (2017).
  12. Jiang, J., et al. Local sustained delivery of 25-hydroxyvitamin D3 for production of antimicrobial peptides. Pharmaceutical Research. 32 (9), 2851-2862 (2015).
  13. Jiang, J., et al. 1α, 25-dihydroxyvitamin D3-eluting nanofibrous dressings induce endogenous antimicrobial peptide expression. Nanomedicine (Lond). 13 (12), 1417-1432 (2018).
  14. Ma, B., Xie, J., Jiang, J., Shuler, F. D., Bartlett, D. E. Rational design of nanofiber scaffolds for orthopedic tissue repair and regeneration. Nanomedicine. 8 (9), 1459-1481 (2013).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

标签

二维静电纺纳米纤维膜扩展为三维支架
联系我们
向图书馆推荐

隐私

使用条款

政策

版权所有 © 2026 MyJoVE Corporation。保留所有权利。