方法文章

剪切应力对活细胞分析的影响 铜绿假单胞菌 使用自动化高通量微流控系统

9.7K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/58926

⸱

2019年1月16日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry, Doane University, 2Department of Biology, Doane University, 3Department of Pathology and Microbiology, University of Nebraska Medical Center, 4Department of Physics and Engineering, Doane University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本文描述了一种高通量微流控生物反应器与荧光显微镜联用的方法，用于分析剪切应力对表达绿色荧光蛋白的铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）生物膜的影响，包括仪器设置、生物膜覆盖率、生长速率及形态学特性的测定。

摘要

高通量微流控 体外 生物反应器结合荧光显微镜已被用于研究细菌生物膜的生长及形态，包括 铜绿假单胞菌 (P. aeruginosa）。在此，我们将描述如何利用该系统研究生长动力学以及表面粗糙度和纹理熵等形态学特性 P. aeruginosa 表达增强型绿色荧光蛋白的菌株PA01（PA01-EGFP）。本详细实验方案将介绍如何培养和接种PA01-EGFP菌液，如何设置显微镜及自动运行程序，并通过微流控装置控制多种剪切力，进行图像分析以测定其生长速率和形态学特征。本文将详细描述一种改进的PA01-EGFP生物膜研究技术，该技术未来可推广应用于其他细菌、真菌或藻类生物膜的研究，借助微流控平台实现。

引言

本实验将演示一种利用自动化的高通量微流控系统，测量剪切应力对荧光标记的铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa，P. aeruginosa）PA01 生物膜形成影响的方法。

生物膜是由胞外聚合物基质组织的微生物群落（如细菌），附着在支撑物表面，通常存在于液体与固体表面的界面处1。这些生物膜群落在环境中可能具有积极作用，例如改善供水管道中的水质以及降解难处理的化合物以实现生物修复2,3。然而，生物膜也可能对人类健康造成严重危害并带来不良后果。例如，人工关节（如髋关节和膝关节植入物）等医疗器械表面容易形成生物膜，导致严重的医疗并发症4,5。生物膜还可进入河流、湖泊等天然水体系统，并侵入供水管道，造成饮用水细菌污染，从而引发感染6,7,8。在海洋环境中形成的生物膜会附着于船舶及其他人工基材表面，由于增加了摩擦阻力，导致燃料消耗上升，造成重大的经济和环境问题9,10。为防止此类问题，已开发出抗菌涂层（如三丁基锡），但这类物质对海洋生物具有毒性11。

P. aeruginosa 是一种革兰氏阴性细菌，在多种环境和营养条件下均具有很强的生存能力12。P. aeruginosa 是社区和医院获得性感染的常见病原体，常与严重烧伤等创伤以及囊性纤维化（CF）5，12，13、艾滋病和癌症患者等免疫功能低下宿主密切相关5，13。P. aeruginosa 生物膜的形成与囊性纤维化（CF）的关联尤为严重，慢性肺部感染是该疾病患者死亡的主要原因5。

标准菌株 P. aeruginosa，PA01，本报告中使用的菌株经遗传修饰以表达增强型绿色荧光蛋白（PA-EGFP）。EGFP 是 GFP 的一种突变体形式，具有更强的荧光特性，可用于 原位 使用荧光显微镜进行生物膜分析14,15,16这种荧光分析方法在生物膜研究中具有优势，因为GFP对细胞生长和功能的影响较小。17例如， 大肠杆菌 与对照细菌相比，标记了GFP的细胞生长良好且持续增殖，未受到任何毒性影响17其他研究报告证实了这一说法18,19,20此外，使用EGFP等荧光报告分子具有快速简便的优点，但仅能检测活细胞，因为死细胞会迅速丧失荧光。21.

生物膜可在多种环境条件下生长，包括不同流速的环境。例如，在河流等高剪切应力环境中，由于水流速度较快，微生物多样性更高22。相反，池塘中的静水或口腔中的生物膜所经历的剪切力则要低得多23。除了流速之外，还有其他因素会影响生物膜的黏附，包括表面粗糙度和疏水性、培养基成分，甚至细菌细胞表面特性1,4,7,24。环境条件还可能导致生物膜空间结构或形态的差异，这包括流动液体施加的剪切应力或营养物质可利用性的梯度等环境因素，以及系统中存在的物种、细胞运动能力以及胞外多糖物质中特定蛋白质等生物学因素25,26,27。在某些条件下，生物膜呈草坪状（光滑且平坦），而在其他条件下则可能呈现粗糙、蓬松甚至蘑菇状的结构28。尽管生物膜草坪结构与蘑菇状结构之间的定性差异可在显微图像中清晰观察到，但要理解生物膜结构与其内部生物学过程之间的关系，仍需系统化且定量的方法来描述其形态。研究人员建议用于研究的形态学参数包括孔隙率、分形维数、扩散长度、基底上的微菌落面积、微菌落体积、粗糙度系数以及纹理熵29,30。

生物反应器被用于生物膜研究，以模拟真实环境条件31。滴流反应器（DFR）可提供一个低剪切力环境，培养基中的营养物质缓慢流经附着在表面的细胞，使其随时间推移形成高细胞密度的生物膜32。CDC反应器是一种通过控制搅拌棒在充满培养基的容器内持续旋转，从而产生高剪切应力流体环境的生物反应器33。这类生物反应器设置简单，但其应用范围有限，原因在于样本量相对较小、培养基消耗量大、由滴流产生的生物危害性废液量多（滴流反应器的滴流速度为125 µL/分钟，而CDC反应器则超过1 mL/分钟），以及需要对大量玻璃器皿和废弃培养基进行高压灭菌处理34。在滴流反应器中，生物膜在表面的生长并不均匀，因为培养基的低剪切力会导致铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）较大聚集体的尾随现象，因此生物膜的生长不够平滑，且不均匀的样品难以通过荧光显微镜进行有效分析35,36。

通过使用中等通量的微流控生物反应器，可以克服一些常见的生物反应器局限性，该反应器仅需几毫升培养基，且反应板体积小，经高压灭菌后可轻松丢弃37。此外，根据孔的数量，单次反应器运行即可完成大量重复实验，从而提供足够数据以进行有意义的统计分析。在图1中，展示了微流控-显微镜系统的各个组成部分，这些部分可实现对温度和流速等条件的精确控制38,39,40。该生物反应器与荧光显微镜联用，可在施加低至高剪切力条件下观察PA01菌株中EGFP标签的荧光信号，从而模拟环境中或生物医学领域中更接近真实的情况。

显微镜-光谱学装置示意图；用于科学研究的光学与光谱分析。
图1：微流控系统的各个组件。 各个组件从左至右依次为：1. CCD相机，2. 带有自动载物台、自动荧光模块和自动对焦模块的高分辨率倒置显微镜，3. 板载载物台，4. 成像系统接口，5. 手动显微镜载物台控制装置，6. 蒸汽捕集器，7. 成像系统控制器（含温度控制器），8. 硬件控制器，9. 荧光控制器，10. 不间断电源，11. 用于图像存储的外置硬盘，12. PC工作站。 请点击此处查看此图的放大版本。

微流控板的局部示意图如图2所示。最常用的板包含48个孔。每个实验需要一个进样孔和一个出样孔，共2个孔，因此可在同一块板上同时进行24个实验。各个通道可设置不同的实验条件，例如细菌菌株、抗菌处理方式、培养基种类，以及每列六个通道的可控剪切流。实验温度在整个板上统一设定并控制。微流控通道设计显示，每个通道均包含一个蛇形区域，以提供足够的背压和可控的剪切力。

微流控装置示意图；明场、荧光显微镜；细胞分析装置。
图2：微流控通道与观察窗口的可视化。 两个进样口和出样口通过微流控通道相连，分别用红色和绿色染料标记。染料显现出各通道中的蛇形区域，该结构可在流体流动过程中产生足够的回压和可控的剪切力。每个观察通道（红色圆圈内）均可使用所需的波长进行成像。图中显示的是使用20倍物镜对含有PA01-EGFP生物膜的单个通道进行拍摄的明场（上图）和荧光（下图）显微图像。比例尺 = 80 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。

本文提供了一步一步的操作指南，使使用与荧光显微镜联用的微流控生物反应器的用户能够在不同剪切环境下开展新型生物膜实验。该方法将有助于拓展除细菌外其他微生物（如真菌和藻类）的相关实验，这些微生物在医学和环境领域具有重要应用41,42,43。详细的操作流程描述了如何培养PA01-EGFP、接种48孔板、设置微流控装置及配套软件、配置荧光显微镜，并演示如何利用软件分析获得生物膜覆盖率、生长速率以及表面粗糙度等形态学特性。

方案

1. 培养基制备

  1. 制备含0.25%葡萄糖的最小培养基（MM）。配制1 L含0.25%葡萄糖的MM时，向去离子水（dH2O）中加入200 mL无菌M9盐溶液、2 mL无菌1 M MgSO4、100 µL无菌1 M CaCl2以及12.5 mL无菌20%（w/v）葡萄糖，定容至最终体积1 L。
  2. 使用无菌操作技术将所需培养基转移至无菌瓶中。根据所用通道数量准备相应体积的培养基。通常，每个通道需要200 µL用于灌注、300 µL用于接种，以及1300 µL用于24小时实验。
  3. 将培养基瓶置于设定为实验温度的培养箱或水浴中。使用前应使培养基达到实验温度，以避免微通道中产生气泡。

2. PA01-EGFP 过夜培养物与实验培养物的制备。

  1. 将15 mL实验培养基加入无菌侧臂锥形瓶中，并接种来自PA01-EGFP涂布的琼脂平板上的一至两个菌落。在培养摇床中培养12–16 h，培养条件为 37 °C 180-220 rpm。
  2. 测定 OD600 过夜培养物的。当OD600 大于0.80时，用新鲜MM稀释过夜培养物至终OD为0.8。将实验培养物置于恒温摇床或水浴中，温度设为 37 °C 直至需要用于接种微流控通道时使用。检测 OD600 再次立即在接种前检测，以确保其OD值与目标OD值相比未发生显著变化600，本例中为 0.8。

3. 仪器启动

  1. 根据用户指南设置系统工作站，设置方式类似于图1所示。为避免仪器与软件连接时出现错误，请按以下顺序开启仪器：
    PC 工作站
    荧光模块。确保荧光快门处于开启状态（快门按钮亮起蓝灯）
    硬件控制器
    成像系统控制器（参见材料表）
    CCD 相机
    成像工作站（显微镜）
    注意：加热板的温度应调节至实验所需的设定温度。
  2. 启动控制应用程序，并输入位于培养板侧面标签上的板编号。
    注意：控制应用程序启动后，将出现两个独立的应用程序窗口，一个用于控制显微镜/成像软件，另一个用于控制泵和微孔板接口的控制模块。如图S1所示，上方窗口打开“多维采集”菜单，下方窗口中控制模块设置为自动运行。

4. 微流控板的引液与接种

注意：引物、接种、细菌附着与生长过程如图3所示。

  1. 从包装中取出48孔微流控板，注意不要触碰板底部的玻璃表面。使用镜头纸、无绒布或低绒擦拭布清洁板底部孔位的玻璃片。
  2. 为润洗微流控通道，用移液器向输出孔中加入200 µL 37 °C的MM培养基，注意避免产生气泡。将板放入板架中，用乙醇擦拭接口，待其干燥后将其密封固定在板架上。
  3. 在控制模块的手动模式下，将流体设置为37 °C的LB培养基，最大剪切力设置为5.00 dyne/cm2。点击输出孔以启动从输出孔到输入孔的流体流动，从而润洗通道。润洗5分钟后，暂停流体流动，准备接种。小心地将板从板架上取下，用移液器吸除输出孔中的残余培养基，但不要移除通向微流控通道内圈的任何培养基。
  4. 为接种实验通道，首先向输入孔中加入300 µL MM培养基，随后向输出孔中加入300 µL细菌培养物。将板重新放回板架，放置前确保擦拭接口。
  5. 在控制模块上，将板架放置于显微镜载物台上后，通过实时摄像画面聚焦单个通道。在实时画面监控下，恢复1.00–2.00 dyne/cm2的流体流动约2–4秒，使细胞进入实验通道，但不进入蛇形通道。将板留在温控载物台上孵育1小时，以促进细胞附着。在1小时孵育期间，可设置控制模块和Montage软件以进行自动运行（步骤5）。
    注意：接种所需时间会因培养基和生物体而异，因此应通过实时画面密切监测，直至优化并确定一般时间范围。板内不同区域的接种可能不均，某些通道列可能需要更长的流体作用时间以实现完全接种。
  6. 附着期结束后，轻柔地将板从载物台上取下，首先用移液器从输出孔吸除细菌，注意避免扰动通道。使用新的移液器吸头，移除输入孔中的培养基。

引物、接种、贴附工作流程；生物反应器示意图；培养基流动；培养生长过程。
图3：PA01-EGFP在微流控通道中引物处理、接种和贴附的实验概览。引物处理、接种和贴附过程如图所示。第一步引物处理需将新鲜培养基引入出口端。接种步骤中，输入端和输出端孔分别加入等体积的培养基和细菌培养液。培养液不应超过实验通道的观察区段（红线），以避免堵塞蛇形通道。孵育期结束后，新鲜培养基持续从入口流入观察腔室，再进入出口。此过程将启动细菌生物膜的贴附与生长。请点击此处查看该图的放大版本。

5. 设置软件

  1. 在软件中打开“多维采集”以控制显微镜图像采集。在“主”菜单下，选择“时间序列”、“多位置载物台”和“多波长”（图S1A）。
    1. 设置“保存”参数时，创建一个简单的“基础名称”，并确保勾选“文件存在时递增基础名称”。点击“选择目录”以指定所有文件的保存文件夹。在“描述”中包含实验的关键信息。
    2. 在“时间序列”选项卡下，将实验总时长“持续时间”设为 24 小时。通过设置“时间间隔”控制图像采集频率，使实验期间每 5 分钟采集一次图像。“时间点数量”将根据设定参数自动调整。
    3. 利用明场显微镜的实时相机画面设置载物台位置，以确保正确放置和聚焦。首先使用 10X 物镜，聚焦于通道中心，该位置位于培养板上刻印的通道编号上方或下方。切换至 20X 物镜，在通道内找到最佳观察区域和焦平面。将该位置添加至列表，或用新设置替换预设的通道位置。
    4. 在“波长”菜单下，将波长数量设为 3。对于波长 1 (W1)，选择 FITC 100% CAM，曝光时间为 10 ms；对于波长 2 (W2)，选择 Brightfield 50% CAM 50% VIS，最小曝光时间为 3 ms；对于波长 3 (W3)，设置为“全部关闭”滤光片，以确保在采集间隔期间最后一个通道无光照。
  2. 设置控制模块时，检查并确认手动运行已停止。
    1. 在“协议设置”选项卡下的“编辑自动运行”菜单中，新建一个持续时间为 24 小时的协议，以设定的剪切速率沿正向流动。通过调节剪切速率，研究其对生物膜生长的影响。点击“添加”并“另存为”该协议。
    2. 在“序列设置”选项卡下，通过选择“LB@37degrees”作为所有通道的默认流体来创建新序列。在“步骤迭代”1 中，对于通道 1–12，选择具有目标剪切速率的协议，并“启用”所有通道；对于通道 13–24，选择具有第二个目标剪切速率的协议，并“启用”所有通道。点击“应用”并“另存为”该序列。
    3. 在“自动运行”菜单中，选择已保存的序列用于自动运行。

6. 定时生物膜生长实验设置

  1. 用移液器将最多 1,300 µL 无菌 MM 加入微流控板的进样孔中。将微流控板放回板位，并用乙醇擦拭接口，待乙醇完全挥发后，再密封微流控板。
  2. 将板位放置到显微镜载物台上，并确保已正确设置实验方案和序列。点击开始以启动自动运行，随后立即点击采集以开始显微镜图像采集。
  3. 在每次图像采集之间调整各载物台位置的焦距和位置。点击暂停，然后在明场波长的实时成像模式下，使用转至功能查看每个载物台位置。通过点击设为当前来设定新的参数。在下一次预定采集时间前点击继续。

7. 定时生物膜生长实验后对图像序列进行审阅与分析

  1. 在软件中，为查看 24 小时自动运行后的每个通道，在 分析工具 下选择 查看多维数据。点击 选择基础文件 | 选择目录，导航至包含目标实验图像序列的文件夹。在出现的文件夹中 数据集 列表中，选择目标数据的基础名称。
  2. 选定目标数据后，点击 查看 以浏览该数据。在 波长 窗口中选择一个波长，以查看对应的数据（图 S2）。
  3. 通过在 载台位置 下选择通道编号，并使用视频控件分析 289 个时间点的数据（假设每 5 分钟获取一次图像，持续 24 小时），逐个通道查看图像序列。记录可用的生长数据。
    注意：在每个通道中，注意观察气泡形成和堵塞情况，这些现象会干扰通道内生物膜的生长，从而影响数据。但如果这些情况在运行后期才出现，则此前的数据仍可能具有利用价值。
  4. 在完成数据浏览并选定用于分析的数据后，为每个通道的图像创建图像堆栈。在 文件 菜单下，选择 打开特殊 | 构建堆栈 | 按编号命名。在 构建堆栈 窗口中，点击 选择第一张图像 按钮，然后在文件夹中选择堆栈的第一张图像；点击 选择最后一张图像 按钮，再选择对应堆栈最后一张图像的文件。点击 确定，即可按时间顺序打开该通道的全部图像堆栈。堆栈可通过 文件 菜单下的 另存为 保存为 tiff 文件。
    注意：不要使用缩略图（thumb images）创建堆栈。这些文件用途不大，可删除以节省硬盘空间。此外，图像文件的命名格式如下：

    BASE NAME_WAVELENGTH_sCHANNEL#_tIMAGE#。

    例如，07062018_W1FITC 100_s12_t112 表示基础名称为“07062018”的数据，对应通道 12、时间点 112、第一波长（FITC 100% 相机）的图像。
  5. 最后，从 文件 下拉菜单中选择 另存为，将序列保存为 tiff 堆栈。堆栈也可叠加并保存为视频文件。详见步骤 9。
  6. 在量化表面覆盖率（%）之前，需校准图像距离。在 分析工具 下，点击 校准距离。选择适当的校准测量值，然后点击 应用于所有打开的图像。
  7. 当堆栈位于序列的第一张图像时，点击 阈值 按钮。使用 亮对象自动阈值 对荧光信号（FITC 波长）进行阈值化，使用 暗对象自动阈值 对明场图像进行阈值化。调整阈值，使其覆盖范围能准确反映图像的实际覆盖情况。
    1. 对于荧光阈值，应使用不含荧光细胞的通道来确定背景信号，并将最小阈值设为排除含非荧光细胞通道中检测到的信号，以确保荧光面积的测量不会被高估。该阈值可能因运行而异，因此建议至少使用一个（或多个）不含荧光细胞的通道作为对照。
    2. 对于明场阈值，若橙色阈值标记未完全覆盖所有细胞，可通过滑动工具栏或使用 分析工具 下的 阈值图像 功能调整最大阈值，使所有细胞均被覆盖，同时排除背景信号。
      注意：尽管理想情况下同一堆栈内所有图像及所有通道均应使用相同的阈值，但某一图像或通道选定的阈值可能不适用于其他图像或通道，因此用户可能需要定期调整阈值范围。出于此原因，建议始终记录所使用的最大和最小阈值，以便日后复查数据。
  8. 为量化覆盖率，在 分析工具 下点击 显示区域统计。确保勾选 使用阈值，选择 整幅图像，并在 获取数据 下确认已选中所需的测量/设置项（阈值面积、平均值、标准差、最小值、最大值和阈值面积百分比）。点击 打开日志，在点击 确定 前确保已选择 DDE 文件。选择 Microsoft Excel 并点击 确定。在打开的电子表格中，点击 记录数据，即可自动记录当前正在分析图像的测量值。
  9. 保持该电子表格打开，使用同一表格收集单个堆栈的所有图像分析数据。在堆栈中跳转至第四张图像，并将阈值调整至最佳设置。在 显示区域统计 界面中点击 记录数据，数值将被记录至电子表格中。此后每隔 15 分钟分析一次图像，并重复此操作。

8. 其他分析：使用生物膜形态学套件中的 Python 脚本进行形态与表面覆盖率测量

  1. 安装包含标准科学模块的 Python 3.6 发行版，可使用标准科学 Python 发行版（如 Anaconda），网址为 https://www.anaconda.com/download。
  2. 通过浏览器访问 https://github.com/cdwentworth/Biofilm-Morphology-Suite.git 获取生物膜形态学分析套件，然后选择 克隆或下载 （绿色按钮）并选择 下载压缩文件解压缩文件，并将代码文件夹移至工作目录。
  3. 通过将图像堆栈复制到“阈值覆盖百分比测量”中来测量百分比阈值覆盖覆盖范围“文件夹中。使用终端窗口导航到该文件夹，然后通过以下命令执行脚本”

    python bfCoverage.py tiffStackName.tif

    从命令行界面，其中 tiffStackName.tif 是包含 TIFF 图像堆栈的文件名。将创建一个文本文件，其中包含每个时间点的覆盖度测量值，该文件将以此名称命名 tiffStackName.txt 并将生成一个名为的图形文件，其中包含覆盖度随时间变化的曲线图 tiffStackName.png.
  4. 使用第8.3步中指定的相同程序测量其他形态学特征：生物膜累积量、粗糙度系数和纹理熵。使用bfAcc.py脚本进行累积量测量，使用roughCoef.py脚本进行粗糙度系数测量，使用TEvsTime.py脚本进行纹理熵测量。

9. 其他软件应用——制作叠加图像和视频

  1. 若使用多个波长，请创建包含这些波长的叠加图像栈。打开所有感兴趣的图像栈，并按照步骤 7.6 中的方法校准距离。
    1. 在 分析工具 下，选择 叠加图像。将源设置为感兴趣的图像栈。在 FITC 图像栈中，点击彩虹色圆圈，并选择绿色滤光片以突出显示该波长。
    2. 使用 bal 调整叠加效果，使 FITC 图像栈在图像中清晰可见。完成所有调整后，选择两个图像栈的 所有层面，然后点击 应用。以与步骤 7.5 中描述的图像栈相同的方式，或按照步骤 9.2 中描述的视频格式保存叠加图像。
  2. 若要将图像栈或叠加图像保存为延时视频，请在 MM 标准 和 图像栈 下点击 生成视频。将源选择为所需的图像栈或叠加图像。点击 保存，并以 Microsoft Video 1 格式保存，质量设置为 70–80。

结果

图4a 展示了在0.2、0.5和1.0 dyne/cm2剪切流条件下进行24小时实验中随时间变化的阈值面积百分比。三种剪切条件下，生物膜覆盖度或阈值表面面积百分比（C [%]）均有所不同。在1.0 dyne/cm2剪切力下，生物膜覆盖速度最快，阈值面积在生长200分钟后从2-5%增加至100%，并在400分钟后进入稳定期。在0.5 dyne/cm2条件下，生物膜覆盖有所延迟，从400分钟开始增加，至800分钟时达到100%覆盖。最低剪切力0.2 dyne/cm2条件下，生物膜覆盖度的增长最为缓慢，覆盖百分比在500分钟才开始上升，但始终未超过65%的阈值面积。这些结果表明，剪切力对生物膜表面覆盖具有直接影响。较高的剪切力似乎是更利于生物膜生长的条件，可能是因为培养基为细菌提供了更多的营养物质，从而促进生物膜更快增殖。

通过覆盖率、累积量、粗糙度和熵图分析生物膜生长动态。
图 4：阈值面积百分比、总生物膜累积量、粗糙度系数和纹理熵。 a) 在24小时时间内，使用0.2、0.5和1.0 dyne/cm2剪切应力条件下的阈值面积百分比（C [%]）。每种剪切条件的数据均来自一个通道。b) 在24小时时间内，使用0.2、0.5和1.0 dyne/cm2剪切应力条件下的总生物膜累积量（相对测量值）随时间的变化。黑色线条为指数模型的最小二乘拟合结果。每种剪切条件的数据均来自一个通道。c) 使用0.2、0.5和1.0 dyne/cm2剪切应力，在24小时内监测PA01-EGFP的粗糙度系数。每种剪切条件的数据均来自一个通道。d) 使用0.2、0.5和1.0 dyne/cm2剪切应力条件下PA01-EGFP的纹理熵。 每种剪切条件的数据均来自一个通道（Valquier-Flynn, H., Sutlief, A.L., Wentworth, C.D., 2018）。 请点击此处查看该图的放大版本。

图4b 与 图4a 所示结果一致。生物膜累积量（N[rel]）的测定基于以下假设：图像中某一点的 GFP 信号与该位置的活细胞密度成正比。结果显示，在 24 小时内，使用 0.2、0.5 和 1.0 dyne/cm2 的剪切应力，总相对生物膜累积量随时间增加，且生长速率从最高剪切应力到最低剪切应力依次下降。存在一个明显的指数生长期，可据此计算出定量的生长速率。

图4c 展示了在剪切流分别为 0.2、0.5 和 1.0 dyne/cm2 条件下的粗糙度系数（Ra）。表面粗糙度通过粗糙度系数进行量化，用于衡量薄膜厚度分布的方差。其正式定义为

加权平均误差公式；数学方程；统计分析；错误率计算

其中 Ti 是 i- 厚度测量， Ta 是平均厚度，且 N 是厚度测量的次数30本研究中描述的方法用于测量活细胞相关的厚度。细胞呈平坦排列时，其粗糙度系数为零；而当厚度相对于平均值存在显著变化时，粗糙度系数则大于一。与剪切力对生长速率及成膜覆盖率百分比阈值的影响类似，生物膜在不同时间点表现出不同的表面形貌。总体而言，Ra 随着时间的推移，所有剪切条件下的表面粗糙度均有所降低，表明所有表面均变得更加光滑。然而，与0.2 dyne/cm的最低剪切条件相比，0.5和1.0 dyne/cm的较高剪切条件2 随着时间的推移，表面变得更加平滑，表明较快的剪切流动有助于形成更平滑且更均匀的表面，其中最高的剪切力为1.0 dyne/cm2 降至0.2 R以下a.

表面的光滑度、规则性或粗糙度也可通过纹理熵（TE）来表示。TE 是图像分析中用于衡量二维图像随机性程度的一种特性，其计算基于 Haralick 定义的灰度共生矩阵。 等，用于检测某一位置的像素值是否与另一位置的像素值存在相关性44相关性越高，熵值越低。 图4d 展示了在0.2、0.5和1.0 dyne/cm剪切流下的TE2. 在所有剪切条件下，TE 值均随时间推移而增加，但在 900 分钟时，1.0 dyne/cm² 的最高剪切应力比更低的剪切应力更早达到最大 TE 值（1.0）。最低剪切应力为 0.2 dyne/cm²2 具有最低的TE（0.8），在1,000分钟时达到最大值。然而，0.5 dyne/cm的中间剪切应力2 达到其最大TE值（1.2）的时间明显晚于高剪切应力或低剪切应力条件。

粗糙度系数和熵值衡量的是不同的特征。虽然平坦的薄膜具有较低的粗糙度系数和较低的熵值，但厚度变化显著的薄膜可能具有较高的粗糙度系数，但如果其变化呈正弦规律而非随机，则熵值仍可能较低。在此情况下，Ra 随剪切应力和时间的增加而减小，而熵值的变化趋势无法直接与随时间施加于生物膜形成的剪切应力相关联。

多维采集设置、用于光谱分析的孔板示意图软件界面。
图S1：控制软件窗口的图像截图。 打开“多维采集”菜单的软件窗口（顶部）。设置为自动运行的控制模块（底部）。请点击此处查看该图的放大版本。

用于图像分析的显微镜软件界面；集成形态学测量分析、数据采集。
图S2 软件用于查看数据的图像采集界面。 从分析工具菜单中选择多维数据查看工具后，显示的应用程序窗口。 请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

本文讨论的微流控系统和图像分析方法侧重于开展微流控生物膜实验，以确定那些无需共聚焦显微镜研究中通常所需的完整三维信息即可获取的形态学特性。这些特性包括微菌落基底覆盖面积（覆盖率百分比）、通过粗糙度系数测量的表面粗糙度以及纹理熵。此外，还提出了一种用于估算生物膜细胞总相对积累量的方法，据此可计算对数生长期的生长速率。

该方法中有几个虽小但十分关键的步骤需要特别强调。在不同实验之间或同一实验中不同孔之间操作时，用酒精擦拭接口有助于避免其他细菌的污染。引液和接种也极为重要，因为引液步骤可使操作者确认哪些通道能够让培养基顺畅流过，而不会出现干扰或堵塞。通道也应避免受到扰动（即 在启动后，应持续用培养基充满通道，以提高实验成功率，避免产生气泡或堵塞。接种步骤可根据细菌类型进行调整，以优化细胞的贴附效果。例如，若细胞贴附不佳，可在接种前对微流控板表面进行修饰，或延长孵育时间。确保显微镜正确设置以获得清晰对焦的图像也至关重要，实验过程中应定期监测，以保证获取高质量图像。若图像失焦，应在实验继续进行的同时及时调整显微镜。在图像采集期间，最后一个波长应设置为 全部关闭 为避免在图像采集间隔的等待时间内，滤光片和照明仅暴露于单一通道，采取了相应措施。此外，用于确定表面覆盖率百分比（% surface coverage）的图像分析方法为自主设计，因为Montage软件手册中未明确说明该操作流程。为进一步拓展图像分析，以确定表面粗糙度等其他特性， 等等基于开源 Python 的代码45 在内部开发并共享至 GitHub 代码仓库。由于本地硬盘可存储和管理的数据量有限，因此需要使用外接硬盘或在线数据共享平台（如 CyVerse）46.

传统的生物反应器，例如 CDC 反应器和滴流反应器34，需要大量培养基，提供的样本量较少，且对设备灭菌要求较高。相比之下，这种高通量平台的优势包括能够控制剪切力、流速，以及假设 体外 实验与……高度相似 体内 条件。该系统的缺点包括需要多种附件和软件，这些组件必须按照特定的事件顺序进行精细的设置。此外，设备附带的操作手册未能充分解释实验的每个步骤以及软件指令，因此实验过程中常出现各种错误，如通道堵塞、细胞无法生长或附着，以及无法获得高质量的显微图像或视频。仪器本身及耗材（如微流控板）价格相对昂贵，每块微流控板售价超过200美元，且不可重复使用。因此，尽管该技术能够产生强有力的研究结果，但其使用所需的技术专业知识水平较高，必须由领域专家进行反复培训。本报告旨在解决这一问题，为这些生物反应器的新用户提供一份研究生物膜特性的操作指南。

微流控系统能够进行细胞分析，已引起微生物学、免疫学、血液学、肿瘤学和干细胞研究等多个科学领域的广泛关注。更具体而言，该技术已催生大量与医学应用高度相关的研究论文37,47，包括微生物口腔黏附48，确定生物表面活性剂对 铜绿假单胞菌 和 金黄色葡萄球菌49,50，宿主-病原体相互作用在 E. coli51，链球菌 黏附52，以及囊性纤维化的治疗53. 鉴于该微流控系统具有高度的多功能性，预计未来将有越来越多的此类系统在全球范围内得到应用。

某些特定的实验步骤需要仔细考虑。培养基可用去离子水（dH2O）稀释至50%以帮助防止气泡产生和堵塞，但在本实验中并非必需。接种时所用的OD600具体数值必须通过生长实验的预试验来确定，以明确在特定实验条件下最适宜的数值。在密封前，孔中若存在气泡，可能导致微流控通道中出现气泡，应通过刺破或使用移液枪头吸除的方式予以清除。应避免细菌进入细小的蛇形通道中。在接种过程中，通过保持进样端和出样端培养基体积相等，可控制因液体体积产生的压力所导致的流动，使流动仅由系统施加的压力驱动。校准距离应在安装期间由公司代表设置，这些参数针对每台相机具有特异性。

在为图像寻找最具代表性的阈值时，会遇到若干挑战。如果背景区域的平均像素强度不一致，设定最大阈值可能会很困难，这种不一致可能是由于选择的载物台位置未对准通道中心，或培养板上有碎片所致。在MM Standard模块下，点击Process，然后选择Background and Shading Correction工具以校正这些不一致性。然而，该工具通常仅在用户已采集了接种前通道的图像并可用作参考图像时才有效。或者，若无法获得背景/明暗校正的参考图像，用户则需凭经验设定一个阈值，使其尽可能覆盖整个图像中的细胞区域，同时不包含背景信号。另一种方法是选择排除不一致区域的代表性区域进行测量：点击Rectangular Region、Ellipse Region或Trace Region来选定区域，并在Analysis Tools下的Show Region Statistics窗口中选择Active Region而非Entire Image。若使用代表性区域对明场图像进行阈值分割，则应在对应的FITC图像中使用相同的区域进行测量。记录与该代表性区域相关的具体空间统计参数（Left、Top、Width、Height、Area、Perimeter）有助于在对应的FITC图像中准确定位并测量相同区域。

为防止硬盘上数据积聚导致计算机运行变慢，可购买外接硬盘用于数据存储。另一种用于数据存储及促进数据共享的方案是使用 CyVerse 生物信息学平台。访问 http://www.cyverse.org/ 在 CyVerse 系统注册账户。登录后，启动 Discovery Environment，然后选择 "Log in CyVerse"。选择 "Data"，并导航至您的文件夹。如果图像堆栈位于本地计算机上，则选择 "Upload"，然后选择 "Simple Upload from Desktop"。找到图像堆栈文件并选择上传。如果合作者拥有 CyVerse 账户并被授予相应权限，则可与他们共享文件或文件夹。若要将数据文件夹向公众共享，则需依据 CyVerse 认可的标准为每个文件添加元数据。此操作流程不在本文讨论范围内，因此不予详述。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作得到了美国国立卫生研究院（NIH）下属的国立普通医学科学研究所（NIGMS）资助（项目编号：5P20GM103427）

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
氯化铵，ACS级VWRBDH9208-500G最小培养基成分之一
BioFlux 1000 48孔低剪切力微流控板Fluxion Biosciences910-0047
BioFlux 1000Z 微流控成像系统Fluxion BiosciencesBF 1000Z
二水氯化钙，ACD级VWR97061-904最小培养基成分之一
无水葡萄糖，ACS级VWRBDH9230-500G最小培养基成分之一
硫酸镁，ACS级VWREM-MX0070-1最小培养基成分之一
磷酸二氢钾，ACS级VWRBDH9268-500G最小培养基成分之一
铜绿假单胞菌GFPATCC15692GFP本研究所用的铜绿假单胞菌PA01菌株，经GFP修饰。
氯化钠，ACS级VWRBDH9286-500G最小培养基成分之一
磷酸二氢钠，无水，试剂级VWR97061-942最小培养基成分之一

参考文献

  1. Donlan, R. M., et al. Model System for Growing and Quantifying Streptococcus pneumoniae Biofilms In Situ and in Real Time. Applied and Environmental Microbiology. 70 (8), 4980-4988 (2004).
  2. Lührig, K., et al. Bacterial Community Analysis of Drinking Water Biofilms in Southern Sweden. Microbes and Environments. 30 (1), 99-107 (2015).
  3. Singh, R., Paul, D., Jain, R. Biofilms: implications in bioremediation. Trends in Microbiology. 14 (9), 389-397 (2006).
  4. Veerachamy, S., et al. Bacterial adherence and biofilm formation on medical implants: A review. Proceedings of the Institution of Mechanical Engineers, Part H: Journal of Engineering in Medicine. 228 (10), 1083-1099 (2014).
  5. Lyczak, J. B., Cannon, C. L., Pier, G. B. Establishment of Pseudomonas aeruginosa infection: lessons from a versatile opportunist. Microbes and Infection. 2 (9), 1051-1060 (2000).
  6. Percival, S. L., Knapp, J. S., Edyvean, R., Wales, D. S. Biofilm Development On Stainless Steel In Mains Water. Water Research. 32 (1), 243-253 (1998).
  7. Percival, S. L., Knapp, J. S., Wales, D. S., Edyvean, R. G. J. The effect of turbulent flow and surface roughness on biofilm formation in drinking water. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology. 22 (3), 152-159 (1999).
  8. Ling, F., Whitaker, R., LeChevallier, M. W., Liu, W. -T. Drinking water microbiome assembly induced by water stagnation. The ISME Journal. , 1(2018).
  9. Moss, B. Water pollution by agriculture. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 363 (1491), 659-666 (2008).
  10. Schultz, M. P., Bendick, J. A., Holm, E. R., Hertel, W. M. Economic impact of biofouling on a naval surface ship. Biofouling. 27 (1), 87-98 (2011).
  11. Tornero, V., Hanke, G. Chemical contaminants entering the marine environment from sea-based sources: A review with a focus on European seas. Marine Pollution Bulletin. 112 (1-2), 17-38 (2016).
  12. LaBauve, A. E., Wargo, M. J. Growth and Laboratory Maintenance of Pseudomonas aeruginosa. Current Protocols in Microbiology. 25 (1), 1-8 (2012).
  13. He, J., et al. The broad host range pathogen Pseudomonas aeruginosa strain PA14 carries two pathogenicity islands harboring plant and animal virulence genes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (8), 2530-2535 (2004).
  14. Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nature Methods. 2 (12), 905-909 (2005).
  15. Zhang, G., Gurtu, V., Kain, S. R. An Enhanced Green Fluorescent Protein Allows Sensitive Detection of Gene Transfer in Mammalian Cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 227 (3), 707-711 (1996).
  16. Patterson, G. H., Knobel, S. M., Sharif, W. D., Kain, S. R., Piston, D. W. Use of the green fluorescent protein and its mutants in quantitative fluorescence microscopy. Biophysical Journal. 73 (5), 2782-2790 (1997).
  17. Chalfie, M., Tu, Y., Euskirche, G., Ward, W. W., Prashert, D. C. Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263 (5148), 802-805 (1994).
  18. Heim, R., Prasher, D., Tsien, R. Wavelength mutations and posttranslational autoxidation of green fluorescent protein. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, 12501-12504 (1994).
  19. Bakke, R., Kommedal, R., Kalvenes, S. Quantification of biofilm accumulation by an optical approach. Journal of Microbiological Methods. 44 (1), 13-26 (2001).
  20. Heydorn, A., et al. Statistical analysis of Pseudomonas aeruginosa biofilm development: impact of mutations in genes involved in twitching motility, cell-to-cell signaling, and stationary-phase sigma factor expression. Applied and Environmental Microbiology. 68 (4), 2008-2017 (2002).
  21. Wilson, E., et al. Using Fluorescence Intensity of Enhanced Green Fluorescent Protein to Quantify Pseudomonas aeruginosa. Chemosensors. 6 (21), (2018).
  22. Fang, H., Chen, Y., Huang, L., He, G. Analysis of biofilm bacterial communities under different shear stresses using size-fractionated sediment. Scientific Reports. 7 (1), 1299(2017).
  23. Saunders, K. A., Greenman, J. The formation of mixed culture biofilms of oral species along a gradient of shear stress. Journal of Applied Microbiology. 89 (4), 564-572 (2001).
  24. Valquier-Flynn, H., Wilson, C. L., Holmes, A. E., Wentworth, C. D. Growth Rate of Pseudomonas aeruginosa Biofilms on Slippery Butyl Methacrylate-Co-Ethylene Dimethacrylate (BMA-EDMA), Glass and Polycarbonate Surfaces. Journal of Biotechnology & Biomaterials. 7 (4), (2017).
  25. Trulear, M. G., Characklis, W. G. Dynamics of biofilm processes. Journal (Water Pollution Control Federation). 54 (9), 1288-1301 (1982).
  26. Machineni, L., Rajapantul, A., Nandamuri, V., Pawar, P. D. Influence of Nutrient Availability and Quorum Sensing on the Formation of Metabolically Inactive Microcolonies Within Structurally Heterogeneous Bacterial Biofilms: An Individual-Based 3D Cellular Automata Model. Bulletin of Mathematical Biology. 79 (3), 594-618 (2017).
  27. Jiao, Y., et al. Identification of Biofilm Matrix-Associated Proteins from an Acid Mine Drainage Microbial Community. Applied and Environmental Microbiology. 77 (15), 5230-5237 (2011).
  28. Flemming, H. C., Wingender, J. The Biofilm Matrix. Nature Reviews Microbiology. 8 (9), 632-633 (2010).
  29. Yang, X., Beyenal, H., Harkin, G., Lewandowski, Z. Quantifying biofilm structure using image analysis. Journal of Microbiological Methods. 39 (2), 109-119 (2000).
  30. Heydorn, A., et al. Quantification of biofilm structures by the novel computer program COMSTAT. Microbiology. 146 (10), 2395-2407 (2000).
  31. Azeredo, J., et al. Critical review on biofilm methods. Critical Reviews in Microbiology. 43 (3), 313-351 (2017).
  32. Goeres, D. M., et al. A method for growing a biofilm under low shear at the air liquid interface using the drip flow biofilm reactor. Nature Protocols. 4 (3), 783-788 (2009).
  33. Goeres, D. M., et al. Statistical assessment of a laboratory method for growing biofilms. Microbiology. 151, 757-762 (2005).
  34. Swartz, K., Stephenson, R., Hernandez, M., Jambang, N., Boles, B. R. The use of Drip Flow and Rotating Disk Reactors for Staphylococcus aureus biofilm analysis. Journal of Visual Experiments. (46), e2470(2010).
  35. Werner, E., et al. Stratified Growth in Pseudomonas aeruginosa Biofilms. Applied and Environmental Microbiology. 70 (10), 6188-6196 (2004).
  36. Wilson, C., et al. The Quantitative Assessment of Pseudomonas aeruginosa (PA)14 Biofilm Surface Coverage on Slippery Liquid Infused Polymer Surfaces (SLIPS). International Journal of Nanotechnology in Medicine & Engineering. 3 (3), 35-42 (2018).
  37. Samarian, D. S., Jakubovics, N. S., Luo, T. L., Rickard, A. H. Use of a High-throughput In Vitro Microfluidic System to Develop Oral Multi-species Biofilms. Journal of Visualized Experiments. (94), 52467(2014).
  38. Rusconi, R., Garren, M., Stocker, R. Microfluidics Expanding the Frontiers of Microbial Ecology. Annual Review of Biophysics. 43, 65-91 (2014).
  39. Kim, J., Park, H. -D., Chung, S. Microfluidic Approaches to Bacterial Biofilm Formation. Molecules. 17 (8), 9818-9834 (2012).
  40. Mosier, A. P., Cady, N. C. Analysis of bacterial surface interactions using microfluidic systems. Science Progress. 94 (4), 431-450 (2011).
  41. Nobile, C. J., Johnson, A. D. Candida albicans Biofilms and Human Disease. Annual Review of Microbiology. 69, 71-92 (2015).
  42. Chandra, J., Kuhn, D. M., Mukherjee, P. K., Hoyer, L. L., McCormick, T., Ghannoum, M. A. Biofilm Formation by the Fungal Pathogen Candida albicans: Development, Architecture, and Drug Resistance. Journal of Bacteriology. 183 (18), 5385-5394 (2001).
  43. Vasconcelos, M. A., et al. Effect of Algae and Plant Lectins on Planktonic Growth and Biofilm Formation in Clinically Relevant Bacteria and Yeasts. BioMed Research International. 2014, 9(2014).
  44. Haralick, R. M., Shanmugam, K., Dinstein, I. Textural Features for Image Classification. IEEE Transactions on Systems, Man, and Cybernetics. 3 (6), 610-621 (1973).
  45. Wentworth, C. D. Biofilm Morphology Suite. , Available from: https://github.com/cdwentworth/Biofilm-Morphology-Suite.git (2018).
  46. Cyverse. , Available from: https://user.cyverse.org/services/mine (2018).
  47. Benoit, M. R., Conant, C. G., Ionescu-Zanetti, C., Schwartz, M., Matin, A. New Device for High-Throughput Viability Screening of Flow Biofilms. Applied and Environmental Microbiology. 76 (13), 4136-4142 (2010).
  48. Ding, A. M., Palmer, R. J., Cisar, J. O., Kolenbrander, P. E. Shear-Enhanced Oral Microbial Adhesion. Applied and Environmental Microbiology. 76 (4), 1294-1297 (2010).
  49. Diaz De Rienzo, M. A., Stevenson, P. S., Marchant, R., Banat, I. M. Effect of biosurfactants on Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus biofilms in a BioFlux channel. Applied Microbiology and Biotechnology. 100 (13), 5773-5779 (2016).
  50. Moormeier, D. E., Bayles, K. W. Staphylococcus aureus Biofilm: A Complex Developmental Organism. Molecular Microbiology. 104 (3), 365-376 (2017).
  51. Tremblay, Y. D. N., Vogeleer, P., Jacques, M., Harel, J. High-Throughput Microfluidic Method To Study Biofilm Formation and Host-Pathogen Interactions in Pathogenic Escherichia coli. Applied and Environmental Microbiology. 81 (8), 2827-2840 (2015).
  52. Nobbs, A. H., Lamont, R. J., Jenkinson, H. F. Streptococcus Adherence and Colonization. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 73 (3), 407-450 (2009).
  53. Díez-Aguilar, M., Morosini, M. I., Köksal, E., Oliver, A., Ekkelenkamp, M., Cantón, R. Use of Calgary and Microfluidic BioFlux Systems To Test the Activity of Fosfomycin and Tobramycin Alone and in Combination against Cystic Fibrosis Pseudomonas aeruginosa Biofilms. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 62 (1), 01650-01717 (2018).

重印与许可

标签

剪切应力对活细胞分析的影响 铜绿假单胞菌 使用自动化高通量微流控系统
联系我们
向图书馆推荐

隐私政策

使用条款

政策

版权所有 © 2026 MyJoVE Corporation。保留所有权利。