通过Sialoglycan的代谢标记识别主要神经干细胞和祖细胞的细胞表面标记

摘要

这里介绍的是一个协议，结合了体外神经内皮共培养系统和代谢结合的异形理念功能组，以扩大主神经干和祖细胞，并标记其表面用于细胞表面标记的成像或质谱分析的紫锥蛋白。

摘要

神经干细胞和祖细胞（NSPCs）是大脑复杂结构和功能的细胞基础。它们位于体内的专门利基，可以在体外分离和扩展，作为细胞移植修复脑损伤的重要资源。然而，NSPCs是异构的，在分子水平上没有明确定义或由于缺乏特定的细胞表面标记而纯化。先前报道的该协议将神经内皮共培养系统与代谢甘油标记方法相结合，以识别初级NSPCs的表面脂质蛋白酶。NSPC-内皮共培养系统允许在体外自我更新和扩展初级NSPCs，产生足够数量的NSPCs。 培养的NSPC中的Sialoglycan使用非天然的亚西酸代谢报告器进行标记生物正交功能组。通过比较自更新的NSPC中的异二蛋白酶，在内皮共培养中扩展，具有不同的神经培养，我们确定了在NSPCs中丰富的膜蛋白列表。协议详细涉及:1）NSPC内生共文化与NSPC区分文化;2） 标记与阿齐多糖每O-乙酰化N-乙酰氨基苯甲胺（Ac₄曼纳兹）;3）生物锡结合到改性双发胶，用于在神经培养固定后进行成像，或从神经培养中提取蛋白质进行质谱分析。然后，通过对扩展NSPC和分化神经培养的质谱数据的比较分析，选取了NSPC富集表面标记候选物。该协议对识别起始材料中低丰度膜蛋白具有高度敏感性，可应用于其他系统具有适当修改的标记发现

引言

神经干细胞被定义为一个多能细胞群，可以自我更新，以维持干细胞库，分化成神经元和胶质。它们是神经系统中的主要细胞类型，通过细胞移植到病变和受伤^{的大脑1，2，}在再生医学中可能提供巨大的治疗潜力。随着发育的进行，神经干细胞群成为异质^的3、4，神经干细胞在大脑中的比例逐渐^下降5。一般来说，胚胎神经干细胞和其他神经祖细胞，统称为神经干细胞和祖细胞（NSPCs），位于^小鼠6的生殖区、心室区和下室区。在胚胎大脑中，神经干细胞通过中间祖细胞（IPC）直接或间接地产生神经元，在某些物种中，通过外部潜区祖体（oRGs）7、8产生神经元。特定的分子特征、形态、干细胞利基的位置和分化潜力都决定了每个亚型在脑器官生成和临床应用^{中的作用9。}然而，目前可用的细胞表面标记不能明确区分和纯化NSPCs的不同亚型，从而限制了对这些亚型的理解和利用。

主要NSPCs表面标记的识别受到三个主要障碍的限制。第一个是组织中NSPC....

方案

本研究中使用的所有动物规程均经清华大学IACUC（机构动物护理和使用委员会）批准，并按照IACUC的准则执行。清华大学实验室动物设施已获得AAALAC（国际实验室动物护理评估与认证协会）的认可。对于胚胎的分期，鉴定的阴道塞的中天被计算为胚胎日0.5（E0.5）。

注:所有细胞在37°C和5%CO2条件下在细胞培养箱中培养。

1. 在渗透支持插件中制备小鼠内皮培养物

注:BEND3 电池根据制造商的说明进行维护。

1. 通过在500 mL的DMEM中加入50mL的FBS和5mL的青霉素-链霉素，制备BEND3细胞培养基（BM），并混合均匀。
2. 从培养皿中吸出培养基，用1mL的PBS洗涤BEND3细胞培养。在细胞中加入1 mL的0.25%胰蛋白酶-EDTA，并在37°C下孵育细胞4分钟。
3. 在细胞中加入1 mL的BM，以中和胰蛋白酶-EDTA，并轻轻上下移液，使细胞完全分离。将细胞悬浮液转移到新的15 mL锥形管中，并在室温（RT）下离心5分钟，400 x g。
4. 从管中吸出上清液，用9 mL的新鲜BM重新悬浮细胞，然后将1mL的细胞悬浮液加入一个可渗透的支撑插件中。在矩阵的底部腔室每口井再添加 ....

结果

原发性胚胎NSPC的体外扩张和代谢标记整个过程需要6天（图1A）。BEND3细胞系和新鲜分离的初级NSPCs的质量是成功实验的关键。BEND3细胞是可溶性因子的来源，可溶性因子刺激NSPCs的自我更新和增殖。在与神经细胞共同培养之前，应确保BEND3细胞没有任何污染，并且以最小的细胞死亡积极分裂。主 NSPC 必须仔细准备，以避免在分离过程中造成过度损坏。受损的国家自保方案仍可能增长和分化;然而，他们不能很好地对内皮刺激作出反应，以保持茎和扩张。在细胞培养过程中，应格外小心无菌，因为协议并不建议在主要培养基中添加抗生素。

成功的内皮共培养将导致NSPC形成大型的、类似纸张的克隆。这种特征克隆形状在第 4 天变得明显，在第 6 天非常典型。在克隆中，细胞彼此保持密切接触。用抗体对NSPC标记Nestin和神经元标记β-图布林III进行免疫染色应表明，在克隆中，大多数细胞是Nestin^+.......

讨论

表面标记通常用于标记和纯化体外和体内的特定细胞^{类型17、18。}表面标记物的发现为再生医学和干细胞研究做出了巨大贡献，它提供了分子工具，从正常或病理组织和培养皿中选择性地丰富干细胞群，提供纯化细胞用于临床或研究生物特性的资源。然而，由于难以将干细胞与原发性组织分离，神经干细胞研究的表面标记物开发进展缓慢。此处描述的协议基于简化的体外平台。通过将内皮共培养的初级NSPC与不同的神经培养进行比较，在扩大的NSPCs中不同表达的蛋白质被突出显示，并允许进一步识别。我们的方案还提供了一个替代策略来纯化细胞表面蛋白，通过劫持内在代谢途径来标记与生物正交组分离。与纯化细胞表面蛋白的传统方案相比，该协议的优点有两个具体特征:1） 细胞表面蛋白上的同步化的流行确保了细胞表面蛋白体的最大覆盖范围，2） 生物正交组与其配体之间的反应特异性使获得表面蛋白酶的纯度。因此，我们的协议在起始材料较少的情况下进行更敏感的蛋白组分析。我们已经证明了该协议在主要NSPC表面标记中的可行性。通过对体外扩张干细胞进行适当修改，这种化学蛋白酶学方法可以与其他干细.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
BEND3	ATCC	CRL-229
DMEM	Gibco	11960044
L-谷氨酰胺	Gibco	25030081	1%
丙酮酸钠	Sigma	P5280	1%
N2 补充剂	Gibco	17502048	1 至 100
N-乙酰-L-半胱氨酸	Sigma	A7250	1 mM
木瓜蛋白酶	Worthington	LS003726	10 U/mL
B27 添加剂	Gibco	17504044	1 至 50
聚-L-赖氨酸	Sigma	P4707
碱性成纤维细胞生长因子	Gibco	PHG0261	10 ng/mL
青霉素-链霉素	Gibco	15140122	1%
胎牛血清	Gibco	10099141	10%
HBSS	Gibco	14175095
Tripsin-EDTA，0.25%	Gibco	25200056
DPBS	Gibco	14190094
Transwell	Corning	3450
多聚甲醛	Sigma	158127	4%
蔗糖	Sangon	A100335
DAPI	Gibco	62248
RIPA 缓冲液	Thermo Scientific	89900
SDS-PAGE 上样缓冲液 2x	Solarbio	P1018
6 孔板	康宁	3335
Tris-甘氨酸蛋白凝胶	invitrogen	xp00100box
小鼠单克隆抗巢蛋白	发育研究 杂交瘤细胞	大鼠-401	1 至 20
小鼠单克隆抗 β-微管蛋白 III	Sigma	T8860	1 至 1,000
Alexa Fluor 488 山羊抗小鼠 IgG1	invitrogen	A-21121	1 至 1,000
Alexa Fluor 546 山羊抗小鼠 IgG2b	invitrogen	A-21143	1 至 1,000
白蛋白 牛 V	Amresco	0332
Triton X-100	Amresco	0694
BCA检测试剂盒	Thermo Scientific	23225
二甲基亚砜	Sigma	D2650
Brij97	阿拉丁	B129088
CuSO4	Sigma	209198
炔烃-生物素	Click 化学工具	TA105
BTTAA	Click 化学工具	1236
Ac4ManNAz	Click 化学工具	1084	100 µ在
实验室			9AzSia
坏血酸钠	Sigma	A4034
甲醇	Sigma	34860
EDTA	Sangon	A100322
NaCl	Sangon	A100241
SDS	Sangon	A100227
Alexa 面粉 647 偶联的链霉亲和素	invitrogen	S21374	1 至 1,000
三乙醇胺	Sigma	V900257
Dynabeads M-280 链霉亲和素	invitrogen	60210
碳酸氢铵	Sigma	9830
考马斯亮蓝 R-250	Thermo Scientific	20278
异氟醚	RWD 生命科学有限公司	970-00026-00
DNase I	Sigma	DN25	12 µg/mL
尿素	Sigma	U5378