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方法文章

通过唾液酸聚糖的代谢标记鉴定原代神经干细胞与前体细胞的细胞表面标志物

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DOI：

10.3791/58945

⸱

2019年9月7日

 ,  , 
1Brain and Spinal Cord Innovative Research Center of Tongji Hospital, School of Life Sciences and Technology, Tongji University and Frontier Science Research Center for Stem Cells of Ministry of Education, 2College of Chemistry and Molecular Engineering, Peking-Tsinghua Center for Life Sciences, Beijing National Laboratory for Molecular Sciences, Synthetic and Functional Biomolecules Center, and Key Laboratory of Bioorganic Chemistry and Molecular Engineering of Ministry of Education, Peking University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本文介绍了一种结合了 体外 神经-内皮共培养系统及通过生物正交功能基团代谢整合唾液酸聚糖，用于扩增原代神经干细胞与祖细胞，并标记其表面唾液酸糖蛋白，以进行成像或质谱分析细胞表面标志物。

摘要

神经干细胞和祖细胞（NSPCs）是大脑复杂结构和功能的细胞基础，它们位于特化的微环境中。 体内 并可被分离和扩增 体外，可作为修复脑损伤的细胞移植重要资源。然而，由于缺乏特异性的细胞表面标志物，神经干细胞/祖细胞（NSPCs）具有异质性，在分子水平上尚未明确定义，也难以实现纯化。本方案此前已有报道，结合神经细胞-内皮细胞共培养体系与代谢性糖标记技术，用于鉴定原代NSPCs的表面唾液酸糖蛋白组。NSPC-内皮细胞共培养体系可支持原代NSPCs的自我更新与扩增 体外，从而获得足够数量的NSPCs。在培养的NSPCs中，使用带有生物正交功能基团的非天然唾液酸代谢探针标记唾液酸化糖链。通过比较在内皮细胞共培养条件下自我更新的NSPCs与正在分化的神经培养物中的唾液酸化糖蛋白组，我们鉴定出一组在NSPCs中富集的膜蛋白。具体而言，该方案包括：1）建立NSPC-内皮细胞共培养体系以及NSPC分化培养体系；2）使用叠氮糖N-叠氮乙酰甘露胺的全-O-乙酰化形式（Ac4ManNAz）；3）在神经细胞培养物固定后，对修饰的唾液酸聚糖进行生物素偶联，用于成像，或从神经细胞培养物中提取蛋白质用于质谱分析。随后，通过比较扩增的NSPC与分化神经细胞培养物的质谱数据，筛选出富集于NSPC的表面标志物候选分子。该方案对起始材料中低丰度膜蛋白的鉴定具有高度敏感性，经适当修改后，亦可应用于其他系统中的标志物发现。

引言

神经干细胞被定义为一类具有多向分化潜能的细胞群体，能够通过自我更新维持干细胞库，并分化为神经元和胶质细胞。它们是神经系统中的主要 细胞类型，在再生医学中可能具有重要的治疗潜力，例如通过细胞移植方式将其植入病变或受损的大脑组织中1,2。随着发育进程的推进，神经干细胞群体逐渐变得异质化3,4，且大脑中神经干细胞的比例逐步下降5。一般来说，胚胎期神经干细胞及其他神经前体细胞统称为神经干细胞和前体细胞（NSPCs），在小鼠中主要位于生发区，即脑室区和脑室下区6。在胚胎大脑中，神经干细胞可直接或通过中间前体细胞（IPCs）间接产生神经元，在某些物种中还可通过外侧脑室下区前体细胞（oRGs）生成神经元7,8。每种亚型在脑器官发生及临床应用中的作用，取决于其特定的分子特征、形态结构、在干细胞微环境中的位置以及分化潜能9。然而，目前可用的细胞表面标志物尚无法明确区分和纯化不同亚型的NSPCs，这限制了对这些亚型的理解与应用。

原代神经干细胞/前体细胞（NSPCs）表面标志物的鉴定受到三大主要障碍的限制。第一个障碍是组织中NSPCs细胞数量有限，难以 制备适用于常规质谱分析的细胞表面蛋白样品。第二个限制在于难以获得纯化的细胞亚型，从而无法生成亚型特异性的膜蛋白数据。最后，第三个挑战是细胞表面蛋白在全细胞蛋白中所占比例较低，这降低了质谱分析对其检测的灵敏度。

为克服这些问题，我们开发了一种化学蛋白质组学方法，通过代谢标记选择性富集并鉴定原代神经干细胞中的细胞表面蛋白 标记唾液酸糖蛋白10. 为了获得足够数量的NSPCs，我们采用了一种既定方案，通过将NSPCs与小鼠脑微血管内皮细胞系在通透性支撑基质小室中共同培养，从而在体外扩增并维持原代胚胎NSPCs的未分化状态，例如， transwell系统11相比之下，单独培养而未与内皮细胞共培养的NPSCs则生成分化的子代细胞11,12因此，蛋白质 可对这两种培养体系的样本进行比较分析，以鉴定在NSPCs和分化神经元中差异表达的蛋白质。由于大多数细胞表面蛋白均被唾液酸修饰13，非天然唾液酸前体类似物 N-叠氮乙酰甘露糖胺四乙酰化物（Ac4使用 ManNAz 挖掘内源性代谢通路，使内源性新合成的唾液酸聚糖被叠氮基团标记，从而产生一个化学标记位点14通过叠氮-炔烃介导的生物正交反应将生物素偶联至唾液酸糖链，可利用链霉亲和素偶联的荧光染料或基质对细胞表面蛋白进行可视化及富集，进而用于蛋白质组学鉴定14.

在此，我们对在内皮细胞共培养条件下扩增的NSPCs及其分化细胞表面唾液酸化糖蛋白组进行SDS-PAGE凝胶染色分析 非共培养系统。我们还针对这两种培养系统选择性纯化表面唾液酸糖蛋白组，以进行蛋白质组学比较。本方案与 基于传统离心的细胞表面纯化方案15通过特异性标签偶联和亲和纯化减少表面蛋白提取步骤，从而提高提取效率。同时，基于唾液酸化主要发生在细胞表面蛋白的前提，该方法可提高细胞表面蛋白的提取纯度。尽管内皮因子不能完全阻断扩增后NSPCs的分化，但共培养与分化培养之间的比较研究为鉴定富集于干细胞的表面蛋白提供了一种便捷方法，无需通过FACS纯化NPCs后进行蛋白分析。16我们认为，通过适当的改进，该方法可应用于其他系统中表面蛋白的研究。

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方案

​本研究中使用的所有动物实验方案均经清华大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准，并依照IACUC的指南进行操作。清华大学实验动物设施已获得国际实验动物评估和认可委员会（AAALAC）的认证。胚胎发育阶段的确定以检测到阴道栓当天中午为胚胎发育0.5天（E0.5）进行计算。

注意：所有细胞均在细胞培养箱中，于 37 °C 和 5% CO2 条件下进行培养。

1. 在可渗透支持性插件中制备小鼠内皮细胞培养

注意：BEND3 细胞根据制造商说明书进行培养。

  1. 在500 mL DMEM中加入50 mL胎牛血清（FBS）和5 mL青霉素-链霉素溶液，混匀，配制BEND3细胞培养基（BM）。
  2. 吸除培养皿中的培养基，用1 mL PBS洗涤BEND3细胞培养物一次。加入1 mL 0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液，于37 °C孵育4分钟。
  3. 向细胞中加入1 mL BM以中和胰蛋白酶-EDTA，轻轻吹打数次使细胞完全解离。将细胞悬液转移至新的15 mL锥形离心管中，在室温（RT）下以400 ×g离心5分钟，收集细胞沉淀。
  4. 吸除上清液，用9 mL新鲜BM重悬细胞，取1 mL细胞悬液加入一个可渗透支持性插入式培养插件中。在基质的底部腔室中每孔再加入2 mL新鲜BM。继续培养细胞一天。

2. 小鼠原代皮层神经干细胞前体细胞培养的制备

  1. 培养板、木瓜蛋白酶消化液及皮层贴壁培养基（AM）的制备
    1. 使用多聚-L-赖氨酸（PLL）包被6孔板：向6孔板每孔加入1 mL PLL溶液，于室温孵育30分钟。
    2. 将PLL溶液转移至15 mL锥形管中，用双蒸水洗涤孔板3次，自然晾干后备用。
    3. 配制木瓜蛋白酶消化液：在5 mL DMEM中加入50 U木瓜蛋白酶、50 µL L-谷氨酰胺和50 µL 100 mg/mL乙酰-L-半胱氨酸，混匀后于37 °C预热30分钟以激活酶活性。
    4. 配制皮层细胞贴壁培养基（AM）：在50 mL DMEM中加入500 µL L-谷氨酰胺、500 µL丙酮酸钠、500 µL 100 mg/mL N-乙酰-L-半胱氨酸、500 µL N2、1 mL B27以及5 µL 100 µg/mL bFGF，充分混匀后于使用前预热至37 °C。
  2. 原代大脑皮层细胞的制备及后续接种
    1. 通过颈椎脱位法处死一只E10.5天的定时妊娠小鼠。
      注意：在E10.5阶段，大脑皮层中大多数细胞为正在增殖的神经干细胞/前体细胞（NSPCs），可在体外形成大量子代克隆。
    2. 用75%乙醇对腹部进行消毒。使用精细剪刀和微齿镊沿中线右侧剪开皮肤及皮下肌肉以暴露腹腔。用齿镊轻柔地将子宫从腹腔中取出，并用精细剪刀将其完全剪下。
    3. 在10 cm培养皿中用40 mL预冷的HBSS清洗子宫，随后将子宫转移至新的10 cm培养皿中，再次用40 mL预冷的HBSS清洗一次。
    4. 将子宫转移至另一盛有40 mL预冷HBSS的10 cm培养皿中，取出胚胎及其羊膜，使用珠宝工显微镊将胚胎头部与躯干分离。
    5. 用40 mL预冷HBSS清洗胚胎头部，并将其转移至新的含40 mL预冷HBSS的10 cm培养皿中。使用珠宝工显微镊剥离覆盖脑组织的皮肤和软骨，切取大脑皮层并收集于含预冷HBSS的15 mL锥形管中。
    6. 在4 °C、300 x g条件下离心3分钟，使皮层组织沉淀。吸除上清液后，向组织沉淀中加入已激活的木瓜蛋白酶消化 液及15 µL 4 mg/mL DNase I。
    7. 轻轻涡旋短暂重悬组织沉淀，于37 °C孵育30分钟。每隔10分钟轻柔涡旋一次以促进组织解离。
      注意：消化结束后，管内应无可见组织块。
    8. 在4 °C、450 x g条件下离心10分钟，使皮层细胞沉淀。吸除上清液后，用预冷的DMEM洗涤细胞沉淀一次，重复该步骤一次。
      注意：在消化和洗涤过程中，应避免剧烈吹打组织和细胞沉淀，以防产生强剪切力损伤细胞。
    9. 吸除上清液后，向管中加入1.5 mL预冷HBSS，通过轻柔吹打将皮层细胞沉淀解离为单细胞悬液，使用血细胞计数板进行细胞计数。
    10. 向6孔板每孔加入2 mL AM培养基和2 × 104个皮层细胞，于37 °C、5% CO2 条件下孵育3小时，使细胞 贴附于培养板表面。

3. 神经-内皮共培养体系及Ac4ManNAz标记系统的建立

  1. 在小室中接种 BEND3 细胞后的第一天，先轻轻抽吸底部培养室中的培养基，然后抽吸小室中的培养基。用预热的 DMEM 对小室的内表面清洗 3 次，并通过用预热的 DMEM 冲洗小室外表面进行清洗。
  2. 向一个小室中加入 1 mL 预热的 AM，然后将小室转移至含有原代皮层细胞的孔中。将共培养体系在 37 °C 和 5% CO2 条件下孵育 12 小时。
  3. 将 Ac4ManNAz 溶于 DMSO 中，配制成 200 mM 的储存液。在建立神经-内皮共培养体系 12 小时后，向每个底部培养室加入 1 µL Ac4ManNAz 储存液，向每个小室加入 0.5 µL 储存液。立即轻轻振荡培养板，使培养基充分混匀。对于对照组细胞，加入等体积的 DMSO。
  4. 继续在 37 °C 和 5% CO2 条件下培养 5 天。使用含 10 倍浓度 bFGF 的 AM 作为换液培养基（RM）。在此期间，每隔一天向每个小室加入 100 µL RM，向每个底部培养室加入 200 µL RM，以更换内皮细胞和神经细胞的培养基。换液时，不再向培养体系中添加 Ac4ManNAz 或 DMSO。

4. 扩增的原代NSPCs及分化神经元中唾液酸化糖蛋白的免疫荧光染色

  1. 配制BTTAA-CuSO4复合物1的30倍浓缩液，其中含1.5 mM CuSO4和9 mM BTTAA，溶剂为双蒸水。新鲜配制含生物素偶联的缓冲液1，其中含50 µM生物素-炔烃、2.5 mM抗坏血酸钠，以及1×BTTAA-CuSO4复合物，溶于PBS中。
  2. 从共培养板中取出插入物。吸除底部孔中的培养基，并用预热的PBS洗涤神经细胞一次。
  3. 吸除孔中的PBS。每孔加入1 mL预冷的含4%多聚甲醛的PBS溶液，室温固定细胞10分钟。随后用预冷的PBS洗涤细胞3次。
  4. 吸除孔中的PBS，每孔加入1 mL新鲜配制的含生物素偶联的缓冲液1，室温孵育10分钟。
  5. 吸除反应缓冲液，用PBS洗涤细胞3次。配制染色缓冲液，其中含1% FBS和1 µg/mL Alexa Fluor 647标记的链霉亲和素。每孔加入1 mL染色缓冲液，室温孵育30分钟。
  6. 吸除染色缓冲液，用预冷的PBS洗涤细胞3次。配制封闭缓冲液，其中含5% BSA和0.3%非离子型去垢剂Triton X-100，溶于PBS中。每孔加入1 mL封闭缓冲液，室温孵育10分钟。
  7. 将抗nestin抗体和抗β-tubulin III抗体按1:20和1:1,000的比例同时稀释于封闭缓冲液中，配制一抗溶液。吸除孔中的封闭缓冲液，每孔加入1 mL一抗溶液，4 °C孵育过夜。
  8. 吸除孔中的一抗溶液，用预冷的PBS洗涤细胞3次。将Alexa Fluor 488标记的山羊抗小鼠IgG1、Alexa Fluor 546标记的山羊抗小鼠IgG2b以及DAPI按1:1,000的比例共同稀释于封闭缓冲液中，配制二抗溶液。吸除孔中的PBS，每孔加入1 mL二抗溶液，室温孵育2小时。
  9. 吸除抗体溶液，用预冷的PBS洗涤细胞3次。此后，细胞即可用于成像。

5. 从扩增的原代NSPCs和分化的神经元中纯化唾液酸糖蛋白

  1. 配制BTTAA-CuSO4复合物2的15倍浓缩液，其中含1.5 mM CuSO4和3 mM BTTAA，溶剂为双蒸水。配制蛋白重悬缓冲液A，含4% SDS和10 mM EDTA，溶于双蒸水；配制蛋白重悬缓冲液B，含150 mM NaCl、50 mM三乙醇胺和1%聚氧乙烯油醚（例如Brij97），溶于pH 7.4的双蒸水。使用前将缓冲液A与缓冲液B按1:8（体积比）混合，制备完整的蛋白重悬缓冲液。配制蛋白洗涤缓冲液1，含2% SDS的PBS溶液；蛋白洗涤缓冲液2，含8 M尿素的250 mM碳酸氢铵（ABC）溶液；以及蛋白洗涤缓冲液3，含2.5 M NaCl的PBS溶液。
  2. 从共培养板中取出插入式培养小室。吸除底部孔中的培养基，并用预冷的PBS洗涤神经细胞一次。
  3. 吸除孔中的PBS，每孔加入200 µL预冷的RIPA裂解缓冲液。将培养板置于冰上孵育5分钟。收集蛋白裂解液至1.5 mL离心管中。在4 °C、12,000 × g条件下离心10分钟，沉淀细胞碎片。
  4. 将上清液转移至新的1.5 mL离心管中。根据BCA试剂盒说明书测定蛋白浓度，并将蛋白浓度调整至1 mg/mL。
  5. 向1 mL蛋白裂解液中加入100 µM炔基生物素（alkyne-biotin）、2.5 mM抗坏血酸钠和1倍体积的BTTAA-CuSO4复合物2，充分混匀。室温孵育1小时。
  6. 将反应液转移至50 mL锥形管中的20 mL预冷甲醇中。充分混匀后，在-30 °C下过夜孵育，以沉淀蛋白质。
  7. 在4 °C、4,500 × g条件下离心15分钟，收集蛋白沉淀。用20 mL预冷甲醇洗涤蛋白沉淀两次。吸除上清液，用4 mL蛋白重悬缓冲液重悬蛋白沉淀，并将重悬液转移至新的15 mL锥形管中。
  8. 取50 µL链霉亲和素磁珠，用PBS洗涤3次。将洗涤后的磁珠加入蛋白重悬液中。在4 °C下，以20 rpm的转速在垂直旋转仪上孵育3小时。
  9. 依次用6种缓冲液洗涤磁珠：蛋白洗涤缓冲液1、蛋白洗涤缓冲液2、蛋白洗涤缓冲液3、0.5 M ABC、0.25 M ABC和0.05 M ABC。
  10. 洗涤完成后，用20 µL PBS重悬磁珠，并将磁珠转移至新的1.5 mL离心管中。向磁珠中加入20 µL 2倍蛋白上样缓冲液，在95 °C处理10分钟。随后将蛋白样品进行SDS-PAGE电泳，并根据说明书用考马斯亮蓝R-250染色。根据考马斯亮蓝R-250染色结果切取凝胶中的蛋白条带，用于质谱分析。

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结果

体外扩增和代谢标记原代胚胎神经干细胞前体细胞（NSPCs）的整个过程需要6天（图1A）。BEND3细胞系的质量以及新分离的原代NSPCs的状态是实验成功的关键。BEND3细胞可分泌可溶性因子，促进NSPCs的自我更新和增殖。在与神经细胞共培养前，必须确保BEND3细胞无任何污染，细胞分裂活跃且死亡率极低。原代NSPCs的制备需谨慎操作，以避免在解离过程中造成过度损伤。受损的NSPCs可能仍能生长和分化，但其对内皮刺激的响应能力下降，难以维持干性并有效扩增。细胞培养过程中应格外注意无菌操作，因为本方案未建议在原代培养基中添加抗生素。

成功的内皮细胞共培养将诱导神经干细胞/前体细胞（NSPCs）形成较大、片状的克隆。此类特征性的克隆形态在第4天开始明显，并在第6天时尤为典型。在克隆内部，细胞之间保持紧密接触。使用针对NSPC标志物Nestin和神经元标志物β-tubulin III的抗体进行免疫染...

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讨论

表面标志物常用于在体外和体内标记并纯化特定类型的细胞17,18。表面标志物的发现极大地推动了再生医学和干细胞研究的发展，因其提供了分子工具，可从正常或病变组织及培养皿中选择性富集干细胞群体，从而为临床应用或生物学特性研究提供纯化的细胞资源。然而，由于难以从原代组织中分离干细胞，神经干细胞研究中表面标志物的开发进展较为缓慢。本文所述方案基于一种简化的体外平台。通过比较内皮细胞共培养扩增的原代NSPCs与正在分化的神经培养物，可突出显示在扩增NSPCs中差异表达的蛋白质，进而实现进一步鉴定。本方案还提供了一种通过劫持细胞内在代谢途径，利用生物正交基团标记唾液酸聚糖来纯化细胞表面蛋白的替代策略。与传统的细胞表面蛋白纯化方案相比，本方案的优势体现在两个特定方面：1）细胞表面蛋白上唾液酸化的广泛存在确保了对细胞表面蛋白质组的最大覆盖；2） 生物正交基团与其配体之间的反应特异性保证了所获得表面蛋白质组的纯度。因此，在起始材料较少的情况下，本方案可实现更灵敏的蛋白质组学分析。我们已在原代NSPCs表面标志物的研究中验证了该方...

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披露

作者无任何披露事项。

致谢

图 1B、1C、1E 和 1F 经英国皇家化学会许可，改编自 Bai et al.10 感谢 X. C. 实验室的 Yi Hao 协助完成图片编辑。本工作由国家自然科学基金委员会（项目编号：91753206，授予 Q. S. 和 X. C.；项目编号：31371093，授予 Q. S.；项目编号：21425204 和 21672013，授予 X. C.）资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
BEND3ATCCCRL-229
DMEMGibco11960044
L-谷氨酰胺Gibco250300811%
丙酮酸钠SigmaP52801%
N2 添加剂Gibco175020481:100
N-乙酰-L-半胱氨酸SigmaA72501 mM
木瓜蛋白酶WorthingtonLS00372610 U/mL
B27 添加剂Gibco175040441:50
聚-L-赖氨酸SigmaP4707
碱性成纤维细胞生长因子GibcoPHG026110 ng/mL
青霉素-链霉素Gibco151401221%
胎牛血清Gibco1009914110%
HBSSGibco14175095
0.25% 胰蛋白酶-EDTAGibco25200056
DPBSGibco14190094
TranswellCorning3450
多聚甲醛Sigma1581274%
蔗糖SangonA100335
DAPIGibco62248
RIPA 裂解缓冲液Thermo Scientific89900
SDS-PAGE 上样缓冲液 2xSolarbioP1018
6 孔板Corning3335
Tris-甘氨酸蛋白凝胶invitrogenxp00100box
小鼠单克隆抗 Nestin 抗体Developmental Study Hybridoma BankRat-4011:20
小鼠单克隆抗 β-微管蛋白 III 抗体SigmaT88601:1,000
Alexa Fluor 488 标记的山羊抗小鼠 IgG1invitrogenA-211211:1,000
Alexa Fluor 546 标记的山羊抗小鼠 IgG2binvitrogenA-211431:1,000
牛血清白蛋白 VAmresco0332
吐温 X-100Amresco0694
BCA 检测试剂盒Thermo Scientific23225
二甲基亚砜SigmaD2650
Brij97AladdinB129088
CuSO4Sigma209198
炔基-生物素Click Chemistry ToolsTA105
BTTAAClick Chemistry Tools1236
Ac4ManNAzClick Chemistry Tools1084100 µM
9AzSia实验室合成
抗坏血酸钠SigmaA4034
甲醇Sigma34860
EDTASangonA100322
NaClSangonA100241
SDSSangonA100227
Alexa Fluor 647 标记的链霉亲和素invitrogenS213741:1,000
三乙醇胺SigmaV900257
Dynabeads M-280 链霉亲和素 invitrogen60210
碳酸氢铵Sigma9830
考马斯亮蓝 R-250Thermo Scientific20278
异氟烷RWD Life Science Co.970-00026-00
DNase ISigmaDN2512 µg/mL
尿素SigmaU5378

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神经干细胞唾液酸聚糖分析内皮细胞共培养叠氮糖标记生物素偶联质谱分析表面标志物鉴定细胞表面蛋白质组
通过唾液酸聚糖的代谢标记鉴定原代神经干细胞与前体细胞的细胞表面标志物
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