Merkel细胞多瘤病毒感染与检测

摘要

本文介绍了一种用于感染原代人皮肤成纤维细胞的默克尔多瘤病毒（MCPyV）实验方案。该方案包括皮肤成纤维细胞的分离、MCPyV病毒颗粒的制备、病毒感染、免疫荧光染色以及荧光原位杂交。本方案可进一步拓展用于研究MCPyV与宿主之间的相互作用，并探索其他可被MCPyV感染的细胞类型。

摘要

默克尔细胞多瘤病毒感染可导致默克尔细胞癌（MCC），这是一种高度侵袭性的皮肤癌。由于缺乏合适的细胞培养模型，目前对默克尔细胞多瘤病毒分子生物学特性及致癌机制的深入研究受到限制。本文介绍了一套用于实现并检测原代人皮肤细胞中默克尔细胞多瘤病毒感染的实验方案。该方案包括人真皮成纤维细胞的分离、重组默克尔细胞多瘤病毒颗粒的制备，以及通过免疫荧光（IF）染色和原位DNA杂交链式反应（HCR）检测病毒感染的方法；其中HCR是一种高灵敏度的荧光原位杂交（FISH）技术。本方案可由相关研究人员加以改进，用于鉴定其他支持默克尔细胞多瘤病毒感染的细胞类型或细胞系。所述FISH方法亦可适用于检测感染人皮肤组织中低水平存在的病毒DNA。

引言

默克尔细胞多瘤病毒（MCPyV）是一种小型双链DNA病毒，与一种罕见但侵袭性强的皮肤癌——默克尔细胞癌（MCC）相关^1,2。MCC的死亡率约为33%，高于黑色素瘤^3,4。MCPyV具有一个约5 kb的环状基因组^1,5，被一个非编码调控区（NCRR）分为早期和晚期编码区¹。NCRR包含病毒复制起点（Ori）以及驱动病毒转录的双向启动子^6,7。早期区编码称为大T抗原（LT）、小T抗原（sT）、57kT、替代性LT开放阅读框（ALTO）以及一种自调控miRNA的肿瘤抗原蛋白^1,8,9,10。晚期区编码衣壳蛋白VP1和VP2¹¹....

方案

人新生儿包皮组织取自宾夕法尼亚大学皮肤疾病研究中心。成人人类成纤维细胞取自手术后废弃的正常皮肤组织。所有实验方案均经宾夕法尼亚大学机构审查委员会批准。

1. 人皮肤成纤维细胞的分离

1. 使用剪刀剪除人类新生儿包皮上的脂肪和皮下组织，并将皮肤样本切成两半或四等份。
2. 将组织置于含有抗生素-抗真菌剂的 PBS 中，加入终浓度为 10 mg/mL 的分散酶 II（dispase II），在 4 °C 下孵育过夜。
3. 在无菌的 10 cm 培养皿中，使用显微解剖镊子小心地将表皮与真皮层分离。
4. 将分离得到的真皮组织转移至含有 5 mL 无胎牛血清培养基的 15 mL 锥形管中，培养基中添加 2 mg/mL IV 型胶原酶（collagenase type IV）及抗生素-抗真菌剂。
5. 在 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育 4–6 小时，期间定期振荡，直至仅剩少量肉眼可见的组织团块。
6. 用 10 mL 移液器剧烈吹打十次（反复移液），使真皮组织释放出单个细胞。
7. 以 180 × g 离心 5 分钟，弃去上清液。
8. 将解离后的细胞接种于 DMEM 培养基中，培养基中添加 10% 胎牛血清、1% 非必需氨基酸和 1% L-谷氨酰胺，在 37 °C、5% CO₂ 条件下培养。

结果

本论文所述方案可分离出近乎均一的人类真皮成纤维细胞（HDFs）群体（图1）。如免疫荧光染色所示，采用本方案所述条件分离得到的人类真皮细胞中，几乎100%的细胞对真皮成纤维细胞标志物波形蛋白（vimentin）和I型胶原蛋白（collagen I）²⁴呈阳性染色，而对人类包皮角质形成细胞标志物K14呈阴性（图1）。图2展示了利用重组MCPyV基因组产生MCPyV病毒颗粒的过程，以及超速离心浓缩后的病毒颗粒样本。在观察到梯度介质核心处浓缩的MCPyV病毒颗粒条带后（见图2B中标记箭头处），收集500 µL的组分，并进行MCPyV定量PCR（qPCR）以确定峰值组分。qPCR分析结果示例见图2

讨论

上述方法包括从人皮肤组织中分离真皮成纤维细胞、制备重组MCPyV病毒颗粒、感染培养细胞、免疫荧光染色，以及一种基于HCR技术改良的高灵敏度FISH方法，这些应能使研究人员分析MCPyV感染²⁷。在体外实现MCPyV感染最关键的步骤之一是制备高滴度的病毒颗粒。采用本文所述的重组MCPyV病毒颗粒制备方案，我们获得了每毫升碘克沙醇溶剂中含10¹²个基因组拷贝的病毒滴度^11,12。这些高滴度的MCPyV制备物使我们能够鉴定出人真皮成纤维细胞（HDFs）是迄今为止唯一被发现能够支持完整MCPyV感染周期的原代皮肤细胞类型²⁴。

采用本文所述方案分离新鲜的人类真皮成纤维细胞，使我们能够控制MCPyV感染实验中所用细胞的质量，并确保从不同患者样本分离的细胞之间实验结果的一致性。所有从新生儿皮肤分离的人类真皮成纤维细胞在使用重组MCPyV病毒颗粒处理前，均应通过q.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
胎牛血清	HyClone	SH30071.03
MEM 非必需氨基酸溶液，100X	Thermo Fisher Scientific	11140050
GLUTAMAX I，100X	Thermo Fisher Scientific	35050061	L-谷氨酰胺
不含钙、镁的 DPBS	Thermo Fisher Scientific	14190136
0.05% 胰蛋白酶-EDTA	Thermo Fisher Scientific	25300-054
DMEM/F12 培养基	Thermo Fisher Scientific	11330-032
重组人 EGF 蛋白，CF	R&D systems	236-EG-200	于 -80 摄氏度保存
CHIR99021	Cayman Chemical	13122	于 -80 摄氏度保存
CHIR99021	Sigma	SML1046	于 -80 摄氏度保存
IV 型胶原酶	Thermo Fisher Scientific	17104019
Dispase II	Roche	4942078001
抗生素-抗真菌剂	Thermo Fisher Scientific	15240-062	避光保存
DMEM 培养基	Thermo Fisher Scientific	11965084
Alexa Fluor 594 山羊抗小鼠 IgG	Thermo Fisher Scientific	A11032	避光保存
Alexa Fluor 488 山羊抗兔 IgG	Thermo Fisher Scientific	A11034	避光保存
OptiPrep 密度梯度介质	Sigma	D1556	避光保存
多聚甲醛	Sigma	P6148
抗 MCPyV LT 抗体 (CM2B4)	Santa Cruz	sc-136172	批号 # B2717
MCV VP1 兔抗血清		兔多克隆血清 #10965	https://home.ccr.cancer.gov/lco/BuckLabAntibodies.htm
潮霉素	Roche	10843555001
碱性成纤维细胞生长因子 (bFGF)，人重组	Corning	354060	于 -80 摄氏度保存
苯并核酸酶	Sigma	E8263
质粒安全型 ATP 依赖性 DNase	EPICENTRE	E3101K
探针杂交缓冲液	Molecular technologies
探针洗涤缓冲液	Molecular technologies
扩增缓冲液	Molecular technologies
Alexa 594 标记的发夹探针	Molecular technologies	B4	避光保存
Triton X-100	Sigma	X100
Quant-iT PicoGreen dsDNA 试剂	Thermo Fisher Scientific	P7581
BamHI-HF	NEB	R3136
Buffer PB	Qiagen	19066
蓝色质粒小提离心柱	Qiagen	27104
50 mL 圆锥形离心管	Corning	352070
T4 连接酶	NEB	M0202T
MagicMark XP	Thermo Fisher Scientific	LC5602