方法文章

Merkel细胞多瘤病毒感染与检测

DOI：

10.3791/58950

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2019年2月7日

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1Department of Microbiology, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania, 2Laboratory of Cellular Oncology, National Cancer Institute

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

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本文介绍了一种用于感染原代人皮肤成纤维细胞的默克尔多瘤病毒（MCPyV）实验方案。该方案包括皮肤成纤维细胞的分离、MCPyV病毒颗粒的制备、病毒感染、免疫荧光染色以及荧光原位杂交。本方案可进一步拓展用于研究MCPyV与宿主之间的相互作用，并探索其他可被MCPyV感染的细胞类型。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

默克尔细胞多瘤病毒感染可导致默克尔细胞癌（MCC），这是一种高度侵袭性的皮肤癌。由于缺乏合适的细胞培养模型，目前对默克尔细胞多瘤病毒分子生物学特性及致癌机制的深入研究受到限制。本文介绍了一套用于实现并检测原代人皮肤细胞中默克尔细胞多瘤病毒感染的实验方案。该方案包括人真皮成纤维细胞的分离、重组默克尔细胞多瘤病毒颗粒的制备，以及通过免疫荧光（IF）染色和原位DNA杂交链式反应（HCR）检测病毒感染的方法；其中HCR是一种高灵敏度的荧光原位杂交（FISH）技术。本方案可由相关研究人员加以改进，用于鉴定其他支持默克尔细胞多瘤病毒感染的细胞类型或细胞系。所述FISH方法亦可适用于检测感染人皮肤组织中低水平存在的病毒DNA。

引言

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默克尔细胞多瘤病毒（MCPyV）是一种小型双链DNA病毒，与一种罕见但侵袭性强的皮肤癌——默克尔细胞癌（MCC）相关1,2。MCC的死亡率约为33%，高于黑色素瘤3,4。MCPyV具有一个约5 kb的环状基因组1,5，被一个非编码调控区（NCRR）分为早期和晚期编码区1。NCRR包含病毒复制起点（Ori）以及驱动病毒转录的双向启动子6,7。早期区编码称为大T抗原（LT）、小T抗原（sT）、57kT、替代性LT开放阅读框（ALTO）以及一种自调控miRNA的肿瘤抗原蛋白1,8,9,10。晚期区编码衣壳蛋白VP1和VP211....

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方案

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人新生儿包皮组织取自宾夕法尼亚大学皮肤疾病研究中心。成人人类成纤维细胞取自手术后废弃的正常皮肤组织。所有实验方案均经宾夕法尼亚大学机构审查委员会批准。

1. 人皮肤成纤维细胞的分离

  1. 使用剪刀剪除人类新生儿包皮上的脂肪和皮下组织，并将皮肤样本切成两半或四等份。
  2. 将组织置于含有抗生素-抗真菌剂的 PBS 中，加入终浓度为 10 mg/mL 的分散酶 II（dispase II），在 4 °C 下孵育过夜。
  3. 在无菌的 10 cm 培养皿中，使用显微解剖镊子小心地将表皮与真皮层分离。
  4. 将分离得到的真皮组织转移至含有 5 mL 无胎牛血清培养基的 15 mL 锥形管中，培养基中添加 2 mg/mL IV 型胶原酶（collagenase type IV）及抗生素-抗真菌剂。
  5. 在 37 °C、5% CO2 条件下孵育 4–6 小时，期间定期振荡，直至仅剩少量肉眼可见的组织团块。
  6. 用 10 mL 移液器剧烈吹打十次（反复移液），使真皮组织释放出单个细胞。
  7. 以 180 × g 离心 5 分钟，弃去上清液。
  8. 将解离后的细胞接种于 DMEM 培养基中，培养基中添加 10% 胎牛血清、1% 非必需氨基酸和 1% L-谷氨酰胺，在 37 °C、5% CO2 条件下培养。

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结果

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本论文所述方案可分离出近乎均一的 HDF 细胞群体（图1）。免疫荧光染色结果显示，采用本方案所述条件分离得到的人类真皮细胞中，几乎 100% 的细胞对真皮成纤维细胞标志物波形蛋白（vimentin）和 I 型胶原蛋白（collagen I）24 呈阳性染色，而对人类包皮角质形成细胞标志物 K14 呈阴性（图1）。图2 展示了利用重组 MCPyV 基因组生成 MCPyV 病毒颗粒的过程，以及经超速离心浓缩后的病毒颗粒样本。在观察到梯度离心中位于核心区域的 MCPyV 病毒颗粒条带后（图2B 中箭头所示），收集 500 µL 的组分，并进行 MCPyV 定量 PCR（qPCR）以确定峰值组分。qPCR 分析数据示例如 .......

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讨论

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上述方法包括从人皮肤组织中分离真皮成纤维细胞、制备重组MCPyV病毒颗粒、感染培养细胞、免疫荧光染色，以及一种基于HCR技术改良的高灵敏度FISH方法，这些应能使研究人员分析MCPyV感染27。在体外实现MCPyV感染最关键的步骤之一是制备高滴度的病毒颗粒。采用本文所述的重组MCPyV病毒颗粒制备方案，我们获得了每毫升碘克沙醇溶剂中含1012个基因组拷贝的病毒滴度11,12。这些高滴度的MCPyV制备物使我们能够鉴定出人真皮成纤维细胞（HDFs）是迄今为止唯一被发现能够支持完整MCPyV感染周期的原代皮肤细胞类型24。

采用本文所述方案分离新鲜的人类真皮成纤维细胞，使我们能够控制MCPyV感染实验中所用细胞的质量，并确保从不同患者样本分离的细胞之间实验结果的一致性。所有从新生儿皮肤分离的人类真皮成纤维细胞在使用重组MCPyV病毒颗粒处理前，均应通过q.......

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披露

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作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

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作者谨此感谢 Wistar 研究所的 Meenhard Herlyn 博士和宾夕法尼亚大学的 M. Celeste Simon 博士提供试剂和技术支持。我们同时感谢实验室各位成员的有益讨论。本研究得到了美国国立卫生研究院（NIH）基金项目（R01CA187718、R01CA148768 和 R01CA142723）、美国国家癌症研究所癌症中心支持基金（NCI P30 CA016520）以及宾夕法尼亚大学 CFAR 奖项（P30 AI 045008）的资助。

....

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
胎牛血清HyCloneSH30071.03
MEM 非必需氨基酸溶液，100XThermo Fisher Scientific11140050
GLUTAMAX I，100XThermo Fisher Scientific35050061L-谷氨酰胺
不含钙、镁的 DPBSThermo Fisher Scientific14190136
0.05% 胰蛋白酶-EDTAThermo Fisher Scientific25300-054
DMEM/F12 培养基Thermo Fisher Scientific11330-032
重组人 EGF 蛋白，CFR&D systems236-EG-200于 -80 摄氏度保存
CHIR99021Cayman Chemical13122于 -80 摄氏度保存
CHIR99021SigmaSML1046于 -80 摄氏度保存
IV 型胶原酶Thermo Fisher Scientific17104019
Dispase IIRoche4942078001
抗生素-抗真菌剂Thermo Fisher Scientific15240-062避光保存
DMEM 培养基Thermo Fisher Scientific11965084
Alexa Fluor 594 山羊抗小鼠 IgGThermo Fisher ScientificA11032避光保存
Alexa Fluor 488 山羊抗兔 IgGThermo Fisher ScientificA11034避光保存
OptiPrep 密度梯度介质SigmaD1556避光保存
多聚甲醛SigmaP6148
抗 MCPyV LT 抗体 (CM2B4)Santa Cruzsc-136172批号 # B2717
MCV VP1 兔抗血清兔多克隆血清 #10965https://home.ccr.cancer.gov/lco/BuckLabAntibodies.htm
潮霉素Roche10843555001
碱性成纤维细胞生长因子 (bFGF)，人重组Corning354060于 -80 摄氏度保存
苯并核酸酶SigmaE8263
质粒安全型 ATP 依赖性 DNaseEPICENTREE3101K
探针杂交缓冲液Molecular technologies
探针洗涤缓冲液Molecular technologies
扩增缓冲液Molecular technologies
Alexa 594 标记的发夹探针Molecular technologiesB4避光保存
Triton X-100SigmaX100
Quant-iT PicoGreen dsDNA 试剂Thermo Fisher ScientificP7581
BamHI-HFNEBR3136
Buffer PBQiagen19066
蓝色质粒小提离心柱Qiagen27104
50 mL 圆锥形离心管Corning352070
T4 连接酶NEBM0202T
MagicMark XPThermo Fisher ScientificLC5602

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gjoerup, O., Chang, Y. Advances in Cancer Research. Vande Woude, G., Klein, G. 106, Academic Press. 1-51 (2010).
  2. Feng, H., Shuda, M., Chang, Y., Moore, P. S. Clonal integration of a polyomavirus in human Merkel cell carcinoma. Science. 319, 1096-1100 (2008).
  3. Lemos, B., Nghiem, P.

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