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方法文章

基于逆电子需求狄尔斯-阿尔德反应的预靶向放射免疫治疗

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DOI：

10.3791/59041

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2019年1月29日

 ,  , 
1Department of Chemistry, Hunter College of the City University of New York, 2Ph.D. Program in Chemistry, Graduate Center of the City University of New York, 3Department of Radiology, Memorial Sloan Kettering Cancer Center, 4Department of Radiology, Weill Cornell Medical College

本文内容

摘要

本方案描述了一种的合成与表征方法 转反式环辛烯（TCO）修饰的抗体和一个 177Lu标记的四嗪（Tz）放射性配体用于预靶向放射免疫治疗（PRIT）。此外，本文还详细介绍了这两种构建物的使用方法 体内 在结直肠癌小鼠模型中进行生物分布与长期治疗研究。

摘要

尽管放射免疫治疗（RIT）是一种具有前景的癌症治疗策略，但放射性标记抗体较长的药代动力学半衰期可能导致正常组织受到较高的辐射剂量。毫不奇怪，目前已开发出多种不同策略以克服这一令人困扰的局限性。其中最有前景的方法之一是预靶向放射免疫治疗（PRIT）。PRIT 的基本原理是将放射性核素与免疫球蛋白分离，分别注射，随后使其在体内结合 体内 在靶组织处。该方法利用了抗体卓越的肿瘤靶向特性，同时规避了其药代动力学方面的缺陷，从而降低了对非靶组织的辐射剂量，并使得半衰期传统上被认为过短而不适用于传统放射免疫偶联物的放射性核素得以应用。在过去五年中，本实验室及其他研究团队已开发出一种方法 体内 基于逆电子需求的狄尔斯-阿尔德（IEDDA）反应的预靶向技术 转反式环辛烯（TCO）和四嗪（Tz）。该策略已成功应用于多种抗体-抗原系统的预靶向正电子发射断层扫描（PET）和单光子发射计算机断层扫描（SPECT）成像。在近期发表的两篇论文中，我们已在胰腺导管腺癌和结直肠癌的小鼠模型中验证了基于IEDDA的PRIT的有效性。在本方案中，我们描述了使用PRIT的实验流程 177Lu-DOTA标记的四嗪放射性配体([177Lu]Lu-DOTA-PEG7-Tz）以及一种经TCO修饰的靶向结直肠癌的huA33抗体变体（huA33-TCO）。具体而言，我们将描述huA33-TCO的构建、[177Lu]Lu-DOTA-PEG7-Tz，以及其性能表现 体内 结直肠癌小鼠模型中的生物分布与长期治疗研究

引言

放射免疫治疗（RIT）——利用抗体将治疗性放射性核素递送至肿瘤——长期以来一直是癌症治疗的一种颇具吸引力的方法1,2事实上，美国食品药品监督管理局已批准两种放射性免疫缀合物用于治疗非霍奇金淋巴瘤，这进一步印证了其应用前景： 90Y-伊布替妥单抗 替克索坦 和 131I-tositumomab3,4然而，即使在RIT发展的早期阶段，其临床应用前景也因一个关键并发症而受到阻碍：对健康组织的高辐射剂量率5,6一般来说，用于放射免疫治疗的放射性免疫结合物通常标记有长半衰期的放射性核素（例如， 131我 [t½ = 8.0 天] 和 90Y [t½ = 2.7 天]，其物理半衰期与免疫球蛋白较长的药代动力学半衰期高度匹配。这一点至关重要，因为它可确保抗体在经过数天循环并达到最佳生物分布后，仍有足够的放射性存留。然而，血液中较长的滞留时间与较长的物理半衰期相结合，不可避免地导致健康组织受到辐射，从而降低治疗比，并限制治疗效果7已探索多种策略以解决此问题，包括使用截短的抗体片段，如 Fab、Fab'、F(ab')2、小抗体和纳米抗体8,9,10最具前景且引人入胜但无疑也最为复杂的替代方法之一是 体内 预靶向11.

体内 预靶向是一种核成像与治疗策略，旨在利用抗体极高的亲和力与特异性，同时规避其药代动力学方面的缺陷11,12,13为此，传统放射免疫治疗中使用的放射性标记抗体被分解为两个组分：一种小分子放射性配体和一种能够结合的免疫偶联物 两者 一种肿瘤抗原及前述放射性配体。首先注射免疫偶联物并给予其“先机”，通常为数天时间，使其在靶组织中积聚并从血液中清除。随后给予小分子放射性配体，该配体或与肿瘤部位的免疫偶联物结合，或迅速从体内清除。本质上， 体内 预靶向技术依赖于在体内进行放射性化学反应。通过减少放射性物质在体内的循环，该方法既能同时降低对健康组织的辐射剂量，又有助于放射性核素的使用例如， 68Ga, t½ 68 分钟211；As，t½ 半衰期较短（约7.2小时），通常认为不适合用于基于抗体的载体。

从20世纪80年代末开始，几种不同的方法相继出现 体内 已开发出多种预靶向策略，包括基于双特异性抗体、链霉亲和素与生物素相互作用以及互补寡核苷酸杂交的策略14,15,16,17,18然而，每种方法都因各种复杂因素而在不同程度上受到限制，其中最著名的是链霉亲和素修饰抗体所引发的强烈免疫原性19,20在过去的五年中，我们团队及其他研究者开发了一种方法 体内 基于快速且生物正交的逆电子需求狄尔斯-阿尔德连接反应的预靶向技术 转反式环辛烯（TCO）和四嗪（Tz）21,22,23,24最成功的策略采用了TCO修饰的抗体和携带Tz的放射性配体，因为TCO通常更稳定 体内 其Tz伴侣（图1)25,26与其它预靶向方法类似，首先给予 mAb-TCO 免疫偶联物，使其有足够时间从循环系统中清除并富集于肿瘤组织。随后注射小分子 Tz 放射性配体，该配体将在靶组织内与免疫偶联物发生点击反应，或迅速从体内清除。 体内 预靶向策略在多种不同的抗体/抗原系统中已证明对PET和SPECT成像具有高度有效性， consistently 产生高对比度的图像，并可实现短半衰期放射性核素的应用，例如 18F (t½ = 109 分钟）和 64Cu (t1/2 = 12.7 小时21,22,24最近，基于点击化学的预靶向放射免疫治疗（PRIT）在胰腺导管腺癌（PDAC）和结直肠癌的小鼠模型中已显示出疗效。27,28为此，治疗性放射性核素 177卢（β最大 = 498 keV，t1/2 6.7天）联合使用两种不同的抗体：5B1，靶向在胰腺导管腺癌（PDAC）中普遍表达的糖类抗原19.9（CA19.9）；以及huA33，靶向A33，一种在细胞中表达的跨膜糖蛋白 >95%的结直肠癌。在这两种情况下，这种策略对于 177Lu-PRIT在肿瘤组织中产生高放射性浓度，形成剂量依赖性的治疗效果，同时与传统直接标记的放射免疫结合物相比，降低了正常组织中的放射性浓度。

在本文中，我们描述了使用PRIT的实验方案 177Lu-DOTA标记的四嗪放射性配体([177Lu]Lu-DOTA-PEG7-Tz）以及一种经TCO修饰的huA33抗体变体（huA33-TCO）。更具体而言，我们描述了huA33-TCO的构建方法（图2），[的合成与放射性标记177Lu]Lu-DOTA-PEG7-Tz (图3 和 图4，以及其性能 体内 结直肠癌小鼠模型中的生物分布与长期治疗研究。此外，在代表性结果与讨论部分，我们展示了一组示例数据，探讨了该方法优化的可能策略，并将此策略置于更广泛的研究背景中进行讨论。 体内 预靶向与PRIT。最后，需要强调的是，尽管我们选择聚焦于使用huA33-TCO和[177Lu]Lu-DOTA-PEG7本方案中的-Tz策略具有高度模块化特性，可针对多种抗体和放射性核素进行适应性调整。

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方案

本研究中描述的所有体内动物实验均按照批准的方案进行，并遵循纪念斯隆-凯特琳癌症中心、威尔康奈尔医学中心和亨特学院机构动物护理与使用委员会（IACUC）的伦理指南。

1. huA33-TCO 的制备

注意：人源化A33-TCO的合成此前已有报道29。然而，为便于读者理解，本文在此重复该方法，并对条件进行了优化调整。

  1. 在1.7 mL微量离心管中，配制125 μL浓度为40 mg/mL（0.15 M）的(E)-环辛-4-烯基 2,5-二氧代-1-吡咯烷基碳酸酯（TCO-NHS）的无水二甲基甲酰胺（DMF）溶液。该溶液可分装后于-80 °C冷冻保存，供后续实验使用。
  2. 在另一个1.7 mL微量离心管中，将huA33溶于1 mL磷酸盐缓冲液（PBS；含2.7 mM氯化钾、137 mM氯化钠和11.9 mM磷酸钾，pH 7.4），配制成5 mg/mL的溶液。
  3. 使用少量（<5 μL）0.1 M Na2CO3溶液，将步骤1.2中抗体溶液的pH调节至8.8–9.0。可使用pH试纸或配备微电极的pH计监测pH值，并注意避免pH超过9.0。
  4. 向步骤1.3所述的抗体溶液中，缓慢加入相当于抗体摩尔量40倍的TCO-NHS体积。例如，若溶液中含有5 mg（30 nmol）huA33，则加入9.0 μL（1.20 μmol）浓度为40 mg/mL（0.15 M）的TCO-NHS溶液。
    注意：TCO-NHS具有疏水性。将其加入抗体溶液时应缓慢加入并同时搅拌，以防止沉淀。最终反应体系中DMF的体积不得超过10%。
  5. 将反应体系置于25 °C恒温混匀仪中，在温和振荡（500 rpm）条件下孵育1小时。
  6. 孵育1小时后，使用预装的一次性尺寸排阻脱盐柱纯化huA33-TCO免疫偶联物。
    1. 按照供应商说明对尺寸排阻柱进行平衡，以去除储存过程中可能存在的防腐剂。典型操作为用相当于柱体积的PBS洗涤5次：即5 × 2.5 mL PBS。
    2. 将反应混合物加至尺寸排阻柱中，并记录反应混合物体积。
    3. 待反应混合物完全进入柱体后，加入适量PBS，使上样总体积达到2.5 mL。例如，若偶联反应后总体积为1.3 mL，则需额外加入1.2 mL PBS。
    4. 用2 mL PBS作为洗脱液收集产物。
      注意：此步骤将获得最终产物huA33-TCO，溶于2 mL PBS（pH 7.4）中。
  7. 使用紫外-可见分光光度计在280 nm波长处测定huA33-TCO的浓度。大多数IgG的摩尔消光系数（ε280）为210,000 M-1cm-1。
  8. 若需要更高浓度的免疫偶联物溶液，可使用截留分子量为50,000的离心过滤装置，按照制造商说明对huA33-TCO溶液进行浓缩。
    注意：许多抗体在浓缩过程中可能发生聚集或沉淀。当首次对新抗体进行此操作时，研究人员应参考相关文献或依据自身处理该抗体的经验谨慎操作。
  9. 若需立即使用，将制备完成的huA33-TCO免疫偶联物避光保存于4 °C；若计划在4天以后使用，则应避光保存于-80 °C。
    注意：本步骤可作为实验流程的合理暂停点。制备完成的huA33-TCO免疫偶联物在-80 °C避光保存条件下至少可稳定存放6个月。

2. Tz-PEG7-NHBoc 的合成

  1. 在1.7 mL 微量离心管中，溶解5 mg 四嗪 N-羟基琥珀酰亚胺酯（Tz-NHS；12.6 μmol）溶于0.15 mL无水二甲基亚砜（DMSO）中。
  2. 在另一个1.7 mL微量离心管中，溶解8 mg的Boc保护氨基PEG聚合物O-(2-氨基乙基)-O′-[2-(Boc-氨基)乙基]六乙二醇（NHBoc-PEG7-NH）2；17.1 μmol）溶于0.15 mL无水DMSO中。
  3. 向Tz-NHS溶液中加入3 μL三乙胺（TEA）（21.3 μmol，1.7摩尔当量），充分混匀。
  4. 将粉红色的四嗪溶液加入 NHBoc-PEG7-NH2 将第2.2步的溶液加入并室温（RT）轻柔振荡孵育反应混合物30分钟。
  5. 30分钟后，用H将反应液按1:1稀释2O，并使用反相C18 高效液相色谱法（HPLC）分离未反应的四嗪-NHS与四嗪-聚乙二醇（Tz-PEG）7-NHBoc。使用无酸溶剂以防止Boc保护基过早脱除。同时监测Tz-PEG­7-NHBoc 和 Tz-NHS 在 525 nm 波长下的情况。
    注意：保留时间显然高度依赖于各实验室的HPLC设备（泵、色谱柱、管路、 等等。），纯化前应运行适当的对照。然而，为举例说明，若使用5:95的乙腈/水（MeCN/H₂O）梯度2O（两者 无 任何添加剂）至95:5乙腈/水2在30分钟内，流速为1 mL/min，采用分析型4.6 mm × 250 mm C18色谱柱被使用时，Tz-NHS 和 Tz-PEG 的保留时间7-NHBoc 的保留时间分别为约 16 分钟和 18 分钟。
  6. 使用液氮冷冻收集的HPLC洗脱液，并用铝箔包裹已冻结的收集管。将冷冻后的收集管置于冻干机中过夜，以去除HPLC流动相。所得产物为特征性的亮粉色固体。
    注意：若无液氮，可将收集的HPLC洗脱液置于干冰中或-80 °C超低温冰箱中过夜冷冻。

3. Tz-PEG7-NH2的合成

  1. 将步骤 2.6 的产物 Tz-PEG7-NHBoc，加入1.5 mL二氯甲烷（DCM），并将该溶液转移至小型圆底烧瓶中。
  2. 向第3.1步得到的粉红色溶液中逐滴加入0.25 mL三氟乙酸（TFA）。
  3. 室温下轻柔振荡孵育反应体系30分钟。
  4. 30分钟后，蒸发溶剂 通过 旋转蒸发。水浴温度不得超过37 °C。
  5. 将粉红色粘稠产物用0.5 mL水溶解。
  6. 使用反相 C 柱纯化产物18 高效液相色谱法分离Tz-PEG7-NH2 从Boc保护的前体中。同时监测Tz-PEG­7-NHBoc 和 Tz-PEG7-NH2 在525 nm波长下。
    注意：保留时间显然高度依赖于各实验室的高效液相色谱设备（泵、色谱柱、管路， 等等。），且应在纯化前运行适当的对照。然而，为举例说明，若采用5:95的乙腈/水梯度（MeCN/H₂O）2O（两者均具有 0.1% 三氟乙酸）至 95:5 乙腈/水2在30分钟内，流速为1 mL/min，采用分析型4.6 mm × 250 mm C18使用色谱柱时，Tz-PEG 的保留时间7-NHBoc 和 Tz-PEG7-NH2 分别为 18 分钟和 13 分钟。
  7. 使用液氮冷冻收集的HPLC洗脱液，并用铝箔包裹已冻结的收集管。将冷冻后的收集管置于冻干机中过夜，以去除HPLC流动相。所得产物为亮粉色固体。
  8. 将第3.7步的产物Tz-PEG重新溶解7-NH2，加入150 μL DMSO，转移至1.7 mL微量离心管中。
  9. 测定 Tz-PEG 的浓度7-NH2 使用紫外-可见分光光度计监测525 nm波长。Tz-PEG的摩尔消光系数7-NH2 (ε525) 为 535 M-1厘米-1.

4. Tz-PEG7-DOTA 的合成

  1. 将 Tz-PEG­7-NH2（4.5 mg，6.9 μmol）溶于 0.15 mL DMSO 中（或直接使用步骤 3.8 中制备的溶液）。
  2. 向步骤 4.1 所得含四嗪的溶液中加入 22 当量的 TEA（21 μL，0.15 mmol）。
  3. 加入 10 mg（14.2 μmol）固体 p-SCN-Bn-DOTA，并涡旋混合溶液约 2 分钟，或直至物质完全溶解。
  4. 在室温下轻轻振荡孵育反应 30 分钟。
  5. 30 分钟后，用 H2O 将反应液按 1:1 稀释，并采用反相 C18 HPLC 纯化产物，以去除未反应的 p-SCN-Bn-DOTA。p-SCN-Bn-DOTA 可在 254 nm 波长下监测，而 Tz-PEG­7-DOTA 最佳监测波长为 525 nm。
    注意：保留时间明显依赖于各实验室的 HPLC 设备（泵、色谱柱、管路等），因此在纯化前应运行适当的对照。然而，作为示例，若使用 30 分钟内从 5:95 MeCN/H2O（均含 0.1% TFA）线性梯度洗脱至 95:5 MeCN/H2O 的条件，并采用 4.6 × 250 mm 分析型 C18 色谱柱，则 Tz-PEG­7-DOTA 与 p-SCN-Bn-DOTA 的保留时间分别约为 15.6 分钟和 16.1 分钟。
  6. 使用液氮冷冻收集的 HPLC 洗脱液，并用铝箔包裹已冻结的收集管。将冷冻后的收集管置于冻干机中过夜，以除去 HPLC 流动相。所得产物为亮粉色粉末。
  7. 将产物重新溶解于 0.15 mL DMSO 中，并使用紫外-可见分光光度计在 525 nm 波长处测定其浓度。Tz-PEG7-DOTA 的摩尔消光系数（ε525）为 535 M-1cm-1。
  8. 通过核磁共振（NMR）和高分辨质谱（HRMS）分析最终化合物，以确认合成成功。本研究中所有化合物的实验测定化学位移和分子量见表 1。
  9. 将纯化的 Tz-PEG7-DOTA 溶液避光保存于 -80 °C。
    注意：此步骤可作为流程中的合理暂停点。在此条件下，完成的 Tz-PEG­7-DOTA 前体至少可稳定保存 1 年。

5. 177Lu 对 Tz-PEG7-DOTA 的放射性标记

警告：本实验步骤涉及放射性物质的操作与处理。在进行这些步骤之前——或进行任何其他涉及放射性的工作之前——研究人员应咨询所在机构的辐射安全部门。应采取一切可能措施，以尽量减少电离辐射的暴露。

注意：处理少量放射性金属时，建议所有缓冲液均不含痕量金属，以防止干扰配位位点的结合。

  1. 在1.7 mL离心管中，加入200 μL用1 M HCl调节至pH 5.5的0.25 M醋酸铵缓冲液。
    注意：如果用于标记的放射性活度低于370 MBq，则缓冲液体积应减少至100 µL。
  2. 加入适量的[177Lu]LuCl3 加入缓冲液中。添加的量取决于实验中的受试者数量以及给予的放射性剂量。建议额外加入相当于1-2个剂量的放射性物质，以预防纯化步骤中可能发生的放射性损失。
  3. 加入 Tz-PEG7-将DMSO中的DOTA加入第5.2步的放射性混合物中。Tz-PEG的用量7-DOTA 的用量取决于被测受试者的数量。有关此主题的更多细节，请参见步骤 6.2.2.2。
  4. 将溶液在37 °C下孵育20分钟。
  5. 使用50 mM EDTA（pH 5.5）作为流动相，通过放射性即时薄层色谱法（radio-iTLC）验证放射性标记是否完全。标记的[177Lu]Lu-DOTA-PEG7-Tz 将保持在基线水平 — Rf = 0 — 而游离的 [177Lu]Lu3+ 将由EDTA螯合并随溶剂前沿移动，Rf = 1.0 (图3B).
  6. 如果未能实现定量标记，可添加额外配体以络合游离的放射性金属。或者，纯化已标记的[177Lu]Lu-DOTA-PEG7使用 C 进行 -Tz18 cartridge。请遵循制造商提供的使用说明。以下提供一个示例操作流程。
    1. 用大容量注射器缓慢将5 mL乙醇通过固相萃取柱，以润洗活化柱体。随后依次通过5 mL乙腈和5 mL去离子水（DI H₂O）。2O.
    2. 用较小的注射器吸取第5.3步中的放射性配体溶液，并缓慢注入C18 柱。然后，用10 mL去离子水洗涤柱2O 以去除任何未结合的 [177Lu]LuCl3.
    3. 用500 µL乙醇洗脱。用干燥的氮气或氩气以低流速吹扫容器10–15分钟，以去除终产物中的任何乙醇。随后，将放射性配体重悬于生理盐水中，体积依据步骤6.2.2.2确定。

6. 体内 研究

警告：与第5节相同，本实验步骤涉及放射性物质的操作与处理。在进行这些步骤之前，研究人员应咨询所在机构的辐射安全部门。应采取一切可能措施，将电离辐射的暴露降至最低。

  1. 动物准备
    1. 在雌性裸鼠中，皮下接种 5 × 106 个悬浮于 150 μL 细胞培养基与基质（例如，Matrigel）1:1 混合液中的 SW1222 结直肠癌细胞，并使其生长形成体积为 100–150 mm3 的异种移植瘤（接种后 14–18 天）。
    2. 用于生物分布实验的动物分组
      1. 当通过游标卡尺测量确定肿瘤达到足够大小后，将动物进行分组，以确保每组的平均肿瘤体积大致相同。可通过在尾巴上用永久性墨水标记（单条带、双条带、等）来区分每笼中的动物。
    3. 用于纵向治疗研究的动物分组
      1. 当通过游标卡尺测量确定肿瘤达到足够大小后，为每只动物佩戴耳标，以确保在整个实验过程中正确追踪个体。
        注意：数字耳标可能在实验过程中脱落。因此，建议以系统化方式配合使用耳缘缺口标记（即，右侧、左侧、双侧、右侧×2、左侧×2）。
      2. 将动物分组，使每组的平均肿瘤体积大致相等。可使用电子表格程序执行以下动物分组方法：
        1. 在三列中分别列出动物编号、耳缘缺口模式和肿瘤体积。
        2. 按肿瘤体积从小到大排序数据。
        3. 在第四列中为每只动物分配笼号，并以蛇形模式循环分配。例如，若有 5 个笼子，则该列填写为“5, 4, 3, 2, 1, 1, 2, 3, 4, 5…”直至所有动物均分配完毕。
        4. 分配完笼号后，按笼号对数据进行排序。若使用耳缘缺口标记，需确保每个笼内每只动物的耳缘缺口模式唯一。若某笼中出现重复模式（两个或以上相同模式），则将其中一只小鼠与另一笼中缺少该模式的小鼠互换，直至每个笼中所有动物的耳缘缺口模式均唯一。
  2. 制剂配制与注射
    注意：生物分布实验与治疗研究的注射顺序如下：首先注射 huA33-TCO，经过预设时间间隔后，再注射 [177Lu]Lu-DOTA-PEG7-Tz。
    1. 免疫偶联物
      1. 将第 1.9 步所得 huA33-TCO 溶液取适量，用 0.9% 无菌生理盐水稀释至浓度为 0.8 mg/mL。
      2. 用经含 1% 牛血清白蛋白（BSA）PBS 预处理的注射器吸取 150 µL（100 µg）huA33-TCO 溶液，并将注射器置于冰上保存。
        注意：BSA 处理可减少抗体非特异性结合至注射器管壁。
      3. 将动物置于加热灯下 3 分钟，以扩张尾静脉。
      4. 将 huA33-TCO 溶液经尾静脉注入荷瘤小鼠体内。允许 24 小时（或其他预设时间间隔）使 huA33-TCO 在小鼠肿瘤中富集。
    2. 放射性配体
      1. 按照第 5 节所述方法对 Tz-PEG7-DOTA 进行放射性标记。
      2. 用 150 μL 0.9% 无菌生理盐水配制剂量，其中 Tz-PEG7-DOTA 的摩尔量为所给予 huA33-TCO 量的 1.1 倍。例如，若向动物注射了 100 μg（0.67 nmol）huA33-TCO，且 [177Lu]Lu-DOTA-PEG7-Tz 反应混合物的比活度为 12.4 GBq/μmol，则每份剂量应含有 9.14 MBq 放射性活度，相当于 0.74 nmol 的 Tz（相对于 huA33-TCO 为 1.1 摩尔当量）。
      3. 将动物置于加热灯下 3 分钟，以扩张尾静脉。
      4. 将放射性配体剂量经尾静脉注入荷瘤小鼠体内。注射的放射性活度由研究人员确定。已有发表数据表明，在 7.4–55.5 MBq 范围内，肿瘤大小呈现剂量依赖性的治疗效应。
  3. 生物分布
    1. 在给予放射性配体后的预定时间点，使用 2% O2 / 6% CO2 气体混合物对每组小鼠实施安乐死。
      注意：遵循机构关于二次物理安乐死方法（例如，颈椎脱位）的相关规定。
    2. 对每只动物，取出所有目标器官，在水浴中清洗以去除多余血液，并在空气中用纸巾晾干 5 分钟。建议取样器官顺序如下：血液、肿瘤、心脏、肺、肝、脾、胃、小肠、大肠、肾、肌肉、骨、皮肤、尾。
    3. 充分干燥后，将器官放入预先称重的一次性培养管中。再次称量装有器官的管子，以获得各器官或组织的质量。
    4. 使用γ计数器测量各管中的放射性活度。将γ计数器测得的活度校准至用于测量注射剂量的探测器。在每台仪器上测量 177Lu 的放射性标准品，并确定用于活度与每分钟计数（cpm）之间换算的校准因子。
    5. 将生物分布数据绘制成柱状图（见图5），显示各器官的平均标准化摄取值，并用误差棒表示一个标准差。样本组间摄取差异的统计学显著性可通过非配对 t 检验评估，当 p < 0.05 时认为具有显著性。
  4. 治疗监测
    1. 使用游标卡尺测量椭圆形肿瘤的最长边（长度）以及与之垂直的宽度。采用椭球体积公式计算肿瘤体积：(4/3)πL·W·H，简化为 ½L·W2，假设高度约等于宽度。
      注意：若有设备，也可使用手持式肿瘤测量仪（见材料表）。
    2. 用天平称量每只小鼠的体重，以追踪其随时间的体重变化。
    3. 重要的是，需密切观察每只动物的外观，注意是否存在痛苦迹象，如弓背或皮肤血管破裂（可能提示血液毒性）。
      注意：在纵向治疗研究期间，应每隔 1–2 天采集一次肿瘤测量数据。
    4. 将纵向治疗研究的数据绘制成随时间变化的平均肿瘤体积曲线，必要时可对起始肿瘤体积进行归一化处理。同一天不同样本组间摄取差异的统计学显著性可通过非配对 t 检验评估，当 P < 0.05 时认为具有显著性。更深入的统计分析应由专业生物统计学家指导进行。

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结果

TCO 与 huA33 的偶联依赖于胺反应性 TCO-NHS 与免疫球蛋白表面赖氨酸残基之间的偶联反应。该方法具有高度的稳健性和可重复性，通常可获得每单克隆抗体 2–4 个 TCO 的标记程度。本研究中，采用 MALDI-ToF 质谱法确认标记程度约为 4.0 TCO/mAb；使用荧光团修饰的四嗪作为报告分子时也得到了相似的结果24。四嗪配体的合成分为三个步骤：（1）将 Tz-NHS 与单-Boc 保护的 PEG 连接子偶联；（2）脱去该中间体的保护基，得到 Tz-PEG7-NH2；（3）在 p-SCN-Bn-DOTA 与 Tz-PEG7-NH2 之间形成硫脲键。该合成过程相对简便，以约 75% 的总收率获得 Tz-PEG7-DOTA。各中间体均通过高分辨质谱（HRMS）和 1H-NMR 进行表征；相关数据见表 1。

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讨论

这种方法的优势之一是 体内 预靶向——尤其是基于双特异性抗体和放射性标记半抗原策略的预靶向——具有模块化特性： 转-cyclooctene（TCO）部分可连接至任意抗体，且四嗪类放射性配体可用种类极为广泛的放射性核素进行标记，同时不损害其与对应点击反应伴侣的反应能力。然而，将此方法拓展至其他抗体/抗原体系并非简单复制本文所述方案即可实现。显然，任何尝试构建新的单克隆抗体-TCO（mAb-TCO）免疫偶联物或新型含四嗪放射性配体的研究，均需配套开展相应的化学与生物学表征实验，包括稳定性与反应活性检测。但除此之外，尚有两个关键变量需特别关注并进行系统探索与优化：（1）给予的mAb-TCO免疫偶联物的质量剂量；（2）mAb-TCO注射与放射性配体给药之间的间隔时间。这两个因素均可显著影响最终结果 体内 预靶向系统的性能表现。例如，若免疫偶联物剂量过高或间隔时间过短，可能导致放射性配体与仍在血液循环中的免疫偶联物发生点击反应，从而引起血液中放射性活度浓度过高。相反，若免疫偶联物用量过低或间隔时间过长，则可能因未能充分饱和抗原或由于四嗪的不可避免（尽管缓慢）异构化，导致肿瘤内放射性活度浓度无谓...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者感谢 Jacob Houghton 博士的有益讨论。 作者还感谢美国国立卫生研究院（NIH）提供的慷慨资助（R00CA178205 和 U01CA221046）。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
(E)-环辛-4-烯基 2,5-二氧代-1-吡咯烷基碳酸酯（TCO-NHS）Sigma-Aldrich764523储存于 -80 °C
2,5-二氧代-1-吡咯烷基 5-[4-(1,2,4,5-四嗪-3-基)苄基氨基]-5-氧代戊酸酯（Tz-NHS）Sigma-Aldrich764701储存于 -80 °C
乙腈（MeCN）Fisher ScientificA998-4
乙酸铵（NH4OAc）Fisher ScientificA639-500
Boc-PEG7-胺（O-(2-氨基乙基)-O′-[2-(Boc-氨基)乙基]六乙二醇）Sigma-Aldrich70023储存于 -20 °C
二氯甲烷（DCM）Fisher ScientificD143-1
二甲基亚砜（DMSO），无水Fisher ScientificD12345
EMD Millipore Amicon Ultra-2 离心过滤装置Fisher ScientificUFC205024
GE Healthcare 一次性 PD-10 脱盐柱Fisher Scientific45-000-148
N,N-二甲基甲酰胺（DMF），无水Fisher ScientificAC610941000
磷酸盐缓冲液（PBS）Fisher Scientific70-011-04410 倍浓缩液
p-SCN-Bn-DOTAMacrocyclicsB-205储存于 -20 °C
三乙胺（TEA）Fisher ScientificAC157911000
三氟乙酸（TFA）Fisher ScientificA116-50
肿瘤测量仪Peira TM900Peira TM900

参考文献

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