已开发出一种定量方法，通过自动分析秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）的表型谱来识别和预测化学品的急性毒性。本实验方案描述了如何在384孔板中用化学品处理线虫、采集视频，以及量化与毒理学相关的表型。
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方法文章
一种通过自动化表型分析预测化学毒性的高通量检测方法 秀丽隐杆线虫
* These authors contributed equally
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摘要
摘要
在高等生物（如小鼠或大鼠）中进行化学品毒性测试由于其寿命较长且饲养维护复杂，耗时且成本高昂。相比之下，线虫Caenorhabditis elegans（C. elegans）具有寿命短、易于培养和繁殖效率高等优势，是进行毒性测试的理想选择。本文介绍了一种在384孔板中对C. elegans进行自动表型分析的实验方案。将线虫在含有液体培养基和化学处理物的384孔板中培养，并对每个孔拍摄视频，以量化化学品对线虫33项特征的影响。实验结果表明，通过量化获得的表型特征可对不同化合物的急性毒性进行分类和预测，并为后续在啮齿类动物模型中开展的传统化学品毒性评估实验提供优先级排序依据。
引言
随着应用于工业生产和人们日常生活的化学物质迅速发展，研究化学品的毒性检测模型显得尤为重要。在许多情况下，啮齿类动物模型被用于评估不同化学物质对健康的潜在毒性。通常，在啮齿类动物（大鼠/小鼠）体内实验中，致死浓度（即不同化学物质的半数致死剂量 [LD50]）被用作传统参数，但该方法耗时较长且成本高昂。此外，根据动物福利与伦理中的“减少、优化、替代”（3R）原则，能够替代高等动物的新方法对科学研究具有重要价值1,2,3。C. elegans 是一种自由生活的线虫，最初从土壤中分离获得。由于其生命周期短、易于培养且繁殖效率高，已被广泛用作实验室研究的模式生物。此外，C. elegans 中许多基本的生物学通路，包括基本生理过程和应激反应，在高等哺乳动物中具有高度保守性4,5,6,7,8。我们及他人的多项比较研究表明，C. elegans 的毒性反应与啮齿类动物中的毒性反应具有良好的一致性9。这些优势使C. elegans 成为在活体条件下检测化学物质毒性的理想模型。
最近，一些研究对表型特征进行了量化 秀丽隐杆线虫这些特征可用于分析化学品的毒性2,3,10 以及线虫的衰老11我们还开发了一种结合液体线虫培养系统与图像分析系统的方法，其中线虫在384孔板中接受不同化学处理进行培养。12该定量技术旨在自动分析线虫在384孔液体培养板中经12-24小时化学处理后的33项参数。实验通过自动显微镜载物台采集视频，随后由定制程序处理视频数据，量化与线虫运动行为相关的33个特征。该方法被用于评估10种化合物处理下线虫表型的变化。结果表明，不同毒性可改变线虫的表型 秀丽隐杆线虫这些定量的表型可用于识别和预测不同化合物的急性毒性。该方法的总体目标是促进实验中表型的观察与定量分析 秀丽隐杆线虫 在液体培养基中。该方法适用于 秀丽隐杆线虫 在化学毒性评估和表型定量分析中，有助于预测不同化合物的急性毒性，并为在啮齿类动物模型中进一步开展传统化学毒性评估试验建立优先级排序。 此外，该方法还可用于新化学物质或作为食品添加剂污染物、药物化合物、环境外源性化合物等的毒性筛选与检测。
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方案
本方案遵循中国北京市疾病预防控制中心动物伦理委员会的动物护理指南。
1. 化学试剂的制备
- 获取化学品（表1 和 材料表）。
- 确定单个化学品的最高和最低剂量，使其在24小时内的最低致死浓度为100%（LC100，24 h），最高非致死浓度为100%（LC0，24 h），以用于线虫实验。使用至少六种不同稀释度的最高浓度溶液（表1）。
注意：对于新化学品，需进行初步的线虫致死率测试9，以探索其LC100和LC0，从而确定合适的剂量。 - 用K缓冲液（材料表）将每种化学品稀释至所需浓度的2倍。使用K缓冲液作为对照，以比较化学品引起的表型变化。
- 例如，配制7个梯度浓度的氯化镉（CdCl2）（表1）。为配制2倍最高浓度的水溶液（4.64 mg/mL），将92.8 mg的CdCl2固体粉末溶解于8 mL K缓冲液中，待粉末完全溶解后加水定容至10 mL。其余浓度梯度通过K缓冲液稀释获得。
- 为化学品浓度梯度中的每一浓度准备八个平行孔。每个孔中含有50 µL的2倍浓度化学品溶液。同时准备至少三组每组八个平行孔，仅含K缓冲液作为 对照（表2）。
注意：简而言之，每种化学品单次剂量需要500 µL的2倍工作液。
2. 线虫制备
- 从秀丽隐杆线虫遗传学中心（Caenorhabditis Genetics Center, CGC）获取野生型 N2 线虫和大肠杆菌（Escherichia coli）OP50 菌株。
- 获取同步化的 L4 期线虫。
- 从划线平板上挑取单个大肠杆菌（E. coli）OP50 菌落，无菌接种于 100 mL LB 液体培养基中，37 °C 过夜培养。
注意：E. coli OP50 菌液现已可用于接种线虫生长培养基（NGM，材料表）平板。 - 将 NGM 培养基倒入 90 mm 塑料培养皿中，倒板次日每皿加入 300 µL E. coli OP50 菌液进行接种。将 N2 线虫接种于含 OP50 的 NGM 平板上，在 20 °C 培养约 2–3 天，直至大多数线虫发育至成虫阶段。
- 用无菌 H2O 将产卵成虫收集至 15 mL 无菌锥形离心管中。静置至少 2 分钟使线虫沉降，吸除上清 H2O，加入 5 mL 漂白液缓冲液（材料表）。
- 涡旋振荡管子 5 分钟，以 1,300 × g 离心 30 秒使卵沉淀，弃去上清液。
- 用 5 mL 无菌 H2O 洗涤卵，涡旋振荡 5 秒；以 1,300 × g 离心 30 秒，移除上清液后再次洗涤。
- 将卵用移液器转移至新的含 OP50 的 NGM 平板上，20 °C 培养。次日清晨观察孵化的 L1 期线虫；线虫约在 40 小时后发育至 L4 期。
- 从划线平板上挑取单个大肠杆菌（E. coli）OP50 菌落，无菌接种于 100 mL LB 液体培养基中，37 °C 过夜培养。
- 用 K 培养基将 L4 期线虫从 90 mm 培养皿中冲洗至 50 mL 无菌锥形管中。在体视显微镜下调整线虫浓度至每 100 µL K 培养基中约含 40 条线虫。向 384 孔板的每孔中加入 50 µL（约含 20 条线虫）。这些同步化的 L4 期线虫可用于后续化学药物处理。
3. 化学处理与视频采集
注意：在384孔板中，线虫（每孔50 µL）接受单个化学物质的六至七个不同剂量处理（表1）。每个剂量准备八个平行孔，每孔含有50 µL的2倍浓度化学溶液（八个孔中加入相同化学物质且浓度相同，表2）。所有视频均使用连接倒置显微镜的数字相机采集（材料表）。化学处理实验持续24小时。在24小时化学处理期间，各孔中均不添加细菌食物。
- 在添加化学物质之前，将含有同步化线虫的384孔板置于自动载物台上，使用预设的采集程序对每个孔进行录像（每秒7帧，持续2秒；扫描每块板约需25 分钟）。
- 向每个孔中加入50 µL根据第1节配制的2倍浓度化学储备液（表2）。将此时设定为0小时时间点。
- 将384孔板在20 °C条件下孵育，并在摇床培养箱中以80 rpm振荡。
- 从培养箱中取出孔板并转移至自动载物台。在12小时和24小时时，对整块板的每个孔进行录像，以检测K培养基中每种特定化学处理下线虫的表型。每块板的扫描约需25分钟。
4. 实验视频处理
注意：已编写并打包了一个用于实验视频和图像处理的程序，可免费下载（参见材料表）。实验视频以图像帧序列的形式存储，每个视频的帧序列均保存在特定目录中。该程序可自动识别线虫并量化其表型。
- 在图形用户界面（GUI，图1）中，添加参数，例如帧序列目录、输出目录、线虫大小参数和运动阈值参数。点击分析按钮以处理实验图像。
- 点击选择按钮以选定源图像目录。
- 在界面中添加中间结果目录。
注意：中间结果包括分割后的图像。这些中间结果有助于对处理后的图像进行视觉观察。 - 在界面中添加最终结果目录。
- 在界面的线虫大小文本框中输入平均线虫大小参数。
注意：实验中使用的大小参数为2,000。 - 在界面中添加移动比例阈值。
注意：实验中使用该比例为0.93。 - 点击分析按钮以开始图像处理。点击重置按钮可清除已添加的参数。
注意：共定义并量化了33个线虫特征。所有定义的表型均按类别排序（见表3）。这些特征可从实验图像中量化获得。通过比较这些特征，可对具有不同毒性的不同化学物质进行定量比较。
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结果
我们测试了线虫在暴露于10多种不同浓度化学物质下的表型12。在该测试中，每种化合物在三个时间点（0 h、12 h和24 h）共量化了33种不同的特征。此前，已有研究对寿命测定中手动分析与自动分析进行了比较11,12。在本实验中，我们发现化学物质及其浓度会影响线虫的表型。该方法的概览见图2。
结果（图3 和 图4c,d）显示，随着化学物质浓度的增加，蠕虫迅速死亡。在较高浓度下，蠕虫的形态比低浓度组或对照组更趋于伸直，弯曲程度降低（图3
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讨论
C. elegans 的优势使其在毒理学研究中的应用日益广泛9，无论是在作用机制研究还是高通量筛选方法中均得到广泛应用。近年来，C. elegans 在补充其他模式系统进行毒理学研究方面发挥了愈加重要的作用，尤其是在新型化学物质的快速毒性评估中表现突出。本文介绍了一种基于384孔板的高通量、定量筛选线虫表型的新方法，可实现化学物质毒性的自动识别与评估。该方法适用于在24小时内完成化学物质的急性毒性测试，若增加数据采集时间点并为线虫提供食物来源（OP50），也可用于亚急性毒性测试。
用于稀释化学品的培养基可能有所不同；在本实验中，我们参考Sofieet al.13 的研究选择使用K培养基。对照组和化学处理组的线虫均在K培养基中培养。人工淡水溶液或低离子强度的土壤溶液可作为K培养基的替代选择。
不同毒性的化学物质会以不同的模式改变秀丽隐杆线虫（C. elegans）...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者感谢 CGC 慷慨提供秀丽隐杆线虫（C. elegans）。本研究得到中国国家重点研发计划（#2018YFC1603102，#2018YFC1602705）；国家自然科学基金项目（#31401025，#81273108，#81641184）；北京市首都卫生发展专项基金（#2011-1013-03）；北京市环境毒理学重点实验室开放基金（#2015HJDL03）；以及中国山东省自然科学基金（ZR2017BF041）的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 2-丙醇 | Sigma-Aldrich | 59300 | |
| 384孔板 | 血栓 | 142761 | |
| 琼脂 | Bacto | 214010 | |
| 硫酸阿托品 | Sigma-Aldrich | PHL80892 | |
| 漂白缓冲液 | 0.5 mL 10 M NaOH，0.5 mL 5% NaClO，9 mL 超纯水 | ||
| 氯化镉 | Sigma-Aldrich | 202908 | |
| 氯化钙 | Sigma-Aldrich | 21074 | |
| CCD相机 | Zeiss | AxioCam HRm | 蔡司显微系统有限公司 |
| 胆固醇 | Sigma-Aldrich | C8667 | |
| 硫酸铜(II) | Sigma-Aldrich | 451657 | |
| 乙醇 | Sigma-Aldrich | 24105 | |
| 乙二醇 | Sigma-Aldrich | 324558 | |
| 甘油 | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| K-培养基 | 3.04 g NaCl 和 2.39 g KCl 溶于 1 L 超纯水中 | ||
| LB肉汤 | 10 g/L 胰蛋白胨 5 g/L 酵母 提取 5 g/L NaCl | ||
| 七水硫酸镁 | Sigma-Aldrich | 63140 | |
| NGM 平板 | 3 g NaCl，17 g 琼脂，2.5 g 蛋白胨溶于 1 L 超纯水中，灭菌后加入 1 mL 胆固醇（乙醇中 5 mg/mL），1 mL MgSO4（1 M），1 mL CaCl2（1 M），25 mL PPB 缓冲液 | ||
| 蛋白胨 | Bacto | 211677 | |
| 氯化钾 | Sigma-Aldrich | 60130 | |
| 磷酸氢二钾 | Sigma-Aldrich | 795496 | |
| 磷酸二氢钾 | Sigma-Aldrich | 795488 | |
| PPB缓冲液 | 35.6 克 K2HPO4，108.3 克 KH2PO4 溶于 1 升超纯水中 | ||
| 摇床 | ZHICHENG | ZWY-200D | |
| 氯化钠 | Sigma-Aldrich | 71382 | |
| 氟化钠 | Sigma-Aldrich | s7920 | |
| 氢氧化钠 | Sigma-Aldrich | 71690 | |
| 次氯酸钠溶液 | Sigma-Aldrich | 239305 | |
| 程序链接 | https://github.com/weiyangc/ImageProcessForWellPlate | ||
| 胰蛋白胨 | Sigma-Aldrich | T7293 | |
| 酵母提取物 | Sigma-Aldrich | Y1625 | |
| 蔡司自动显微镜 | 蔡司 | AXIO Observer.Z1 | 蔡司自动显微镜配备专有软件 Zen2012 和电荷耦合器件（CCD）相机 |
参考文献
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