利用动态核极化固态核磁共振技术进行结构解析的真菌与植物材料制备

摘要

本文介绍了一种用于制备¹³C,¹⁵N标记的真菌和植物样品的方案，适用于多维固态核磁共振波谱和动态核极化（DNP）研究。

摘要

本方案展示了如何制备均匀¹³C、¹⁵N标记的真菌材料，以及如何对这些软性材料进行处理以用于固态核磁共振和灵敏度增强的动态核极化（DNP）实验。文中还详细描述了植物生物质样品的处理流程。该方法可实现一系列1D和2D ¹³C-¹³C/¹⁵N相关谱图的测量，从而在几乎不干扰样品天然状态的前提下，对复杂生物材料进行高分辨率的结构解析。同位素标记效果可通过1D谱图中的信号强度以及2D相关谱图中的极化转移效率进行定量评估。动态核极化（DNP）样品制备的成功与否可通过灵敏度增强因子进行评价。进一步开展针对多糖和蛋白质结构特征的研究，将有助于构建材料的三维结构模型。这些方法可经修改和调整，用于研究多种富含碳水化合物的材料，包括植物、真菌、藻类和细菌的天然细胞壁，以及合成或设计的碳水化合物聚合物及其与其他分子形成的复合物。

引言

碳水化合物在多种生物过程中发挥核心作用，例如能量储存、结构构建以及细胞识别与黏附。它们在细胞壁中富集，而细胞壁是植物、真菌、藻类和细菌的基本组成成分^1,2,3。细胞壁是生产生物燃料和生物材料的重要来源，同时也是抗菌治疗的潜在靶点^4,5,6,7,8,9。

几十年来，研究人员通过四种主要的生化或遗传方法对这些复杂材料的结构进行表征，极大地推动了当前对其的理解。第一种主要方法依赖于使用强化学试剂或酶进行连续处理，将细胞壁分解为不同组分，随后对各组分中的糖类进行组成和连接方式分析¹⁰。该方法有助于揭示多糖聚合物的区域分布，但由于生物分子的化学和物理特性，其解释可能存在误导性。例如，难以确定碱提取组分是来源于结构松散的单一区域分子，还是来源于空间上分离但溶解度相似的分子。第二种方法是对提取的组分或完整的细胞壁采用溶液核磁共振（NMR）技术，测定不同分子之间的共价连接（即交联）^{11,12,13,14,15}。该方法可探测共价锚定点的精细结构，但受限于多糖溶解度低、交联位点数量较少，以及未能考虑稳定多糖堆积的非共价作用力，包括氢键、范德华力、静电相互作用和聚合物缠结。第三种方法通过体外实验测定分离得到的多糖之间的结合亲和力in vitro^16,17,18,19，但纯化过程可能显著改变这些生物大分子的结构和性质，且该方法无法重现生物合成后大分子的复杂沉积与组装过程。最后，某些细胞壁组分合成减弱的遗传突变体在表型、细胞形态和机械性能方面的变化，为多糖的结构功能提供了线索，但仍需更多分子层面的证据，以将这些宏观观察结果与蛋白质机器的工程化功能联系起来²⁰。

多维固态核磁共振（NMR）波谱技术的最新发展与应用为解决这些结构难题提供了独特机遇。二维/三维固态NMR实验能够在不显著干扰样品原始状态的前提下，对富含碳水化合物的材料进行高分辨率的组成与结构分析。已有研究成功应用于植物初生和次生细胞壁、经催化处理的生物质、细菌生物膜、真菌中的色素残余结构，以及最近由本研究作者开展的对致病性真菌Aspergillus fumigatus完整细胞壁的研究^{21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31}。动态核极化（DNP）技术的发展^{32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42}显著促进了NMR结构解析，因为DNP带来的灵敏度提升可大幅缩短对这些复杂生物材料的实验时间。本文所述方案详细介绍了对A. fumigatus真菌进行同位素标记以及制备适用于固态NMR和DNP表征的真菌与植物样品的操作步骤。类似的标记方法经培养基调整后应可适用于其他真菌，而样品制备流程则普遍适用于其他富含碳水化合物的生物材料。

方案

1. ¹³C、¹⁵N标记的Aspergillus fumigatus液体培养基的培养

1. 未标记和 ¹³C, ¹⁵N标记的培养基
   注意：YPD 培养基（Yeast Extract Peptone Dextrose medium）和改良的最低限度培养基⁴³ 用于真菌培养物的保藏。所有经高压灭菌后的操作均在超净工作台中进行，以尽量减少污染。
   1. 无标记液体培养基的制备：将6.5 g YPD粉末溶解于100 mL蒸馏水中，134 °C高压灭菌25 min。
   2. 无标记固体培养基的制备
      1. 在100 mL蒸馏水中加入1.5 g琼脂和6.5 g YPD粉末。
      2. 在121 °C下高压灭菌25分钟，然后冷却至约50 °C。
      3. 将13-15 mL培养基转移至每个预先灭菌的塑料培养皿中，并立即用盖子盖好。
   3. 样品制备 ¹³C, ¹⁵N标记液体培养基
      注意：为制备用于同位素标记的生长溶液，需使用含有 ¹³C-葡萄糖和 ¹⁵分别配制硝酸钠和微量元素溶液，使用前混合。
      1. 按所列配方制备 100 mL 含同位素的最低培养基 表1使用 NaOH (1 M) 或 HCl (1 M) 溶液调节 pH 至 6.6。
      2. 在121 °C下高压灭菌最小培养基25分钟。
      3. 配制 100 mL（1,000 倍浓缩）微量元素溶液，溶解下列所列的盐类 表2 在蒸馏水中。在134 °C下高压灭菌25分钟。冷却后，将溶液于4 °C短期保存。pH值约为6.5，可使用pH计检测。
      4. 向100 mL中加入0.1 mL微量元素溶液 ¹³C, ¹⁵N标记的最低培养基，如所列 表 2 使用前
2. 真菌材料的生长
   1. 在超净工作台中，使用接种环将少量保存的真菌转移至YPD平板。将培养物置于30 °C培养箱中培养2天。
   2. 使用接种环将活跃生长的真菌边缘转移至 ¹³C,¹⁵在超净工作台中进行N标记溶液处理。将培养物置于摇床培养箱中，在30 °C、220 rpm条件下培养3-5天。
   3. 在 4,000 x g 孵育20分钟。移除上清液，收集沉淀。
   4. 使用镊子收集约 0.5 g 充分水合的沉淀物（>用于核磁共振研究的样品需保持50 wt%的水合状态。任何阶段的脱水都会显著降低谱图分辨率。
      注意：如有需要，可分离少量（0.1 g）水合菌丝并在 N₂ 气氛下完全干燥₂ 在通风橱或冻干机中通过气体流动来估计水合程度并计算干重百分比。通常，经过3天后可获得约含0.3 g干重的沉淀物。如果将要进行的核磁共振（NMR）实验耗时较长（>7天）和/或需要固定真菌状态时，可将真菌材料在液氮中深度冷冻₂ 在进一步处理前静置10-20分钟。若实验周期较短（3-6天），可省略冷冻步骤，使样品保持新鲜状态。
   5. 将过量材料与20%（v/v）甘油混合于离心管中，于-80 ᵒC冰箱中长期保存。

2. 用于固态核磁共振和动态核极化研究的 A. fumigatus 制备

1. 用于固态核磁共振实验的 A. fumigatus 样品制备
   1. 将 ¹³C、¹⁵N 标记的真菌样品（步骤 1.2.4）装入截留分子量为 3.5 kDa 的透析袋中，在 4°C 条件下用 1 L 的 10 mM 磷酸盐缓冲液（pH 7.0）透析，总时长为 3 天，以去除培养基中的小分子物质。每天更换缓冲液两次。
      注：也可使用去离子水对样品进行 6–10 次洗涤，以去除残留的小分子物质。
   2. 将样品转移至 15 mL 离心管中，使用台式离心机在 10,000 × g 条件下离心 5 分钟。弃去上清液，收集剩余的真菌材料。
   3. 将 70–80 mg 均匀 ¹³C 标记且充分水合的样品糊状物装入 4 mm ZrO₂ 转子中，或装入 3.2 mm 转子中（30–50 mg）。使用金属棒反复轻压样品，并用滤纸吸除多余水分。
   4. 将转子盖紧后插入核磁共振谱仪中，进行固态核磁共振表征。
      注：建议使用全新的转子，以最大限度降低转子破裂和样品泄漏至核磁共振谱仪中的风险。如有需要，可在转子内部使用带密封螺钉的一次性 Kel-F 插件作为二级容器。
2. 用于动态核极化（DNP）实验的 A. fumigatus 样品制备
   1. 在 1.5 mL 微量离心管中为 ¹³C、¹⁵N 标记的真菌样品配制 100 µL DNP 溶剂^29,44（也称为 DNP 基质）。该 DNP 基质由 d₈-甘油/D₂O/H₂O（体积比 60/30/10）混合而成。
      注：若需检测未标记样品，则应使用 ¹³C 耗尽的 d₈-甘油（¹²C₃，99.95%；D₈，98%）以及 D₂O 和 H₂O 配制 DNP 基质，以避免溶剂产生 ¹³C 信号干扰。
   2. 将 0.7 mg AMUPol⁴⁵ 溶解于 100 µL DNP 溶剂中，配制成 10 mM 的自由基储备液。涡旋振荡 2–3 分钟，确保自由基完全溶解。
   3. 将先前步骤中透析处理的 10 mg ¹³C、¹⁵N 标记真菌材料（见步骤 2.1.1 和 2.1.2）浸入 50 µL AMUPol 溶液中，并使用研钵和研杵轻轻研磨混合物，以确保自由基充分渗透进入多孔的细胞壁。
      注：为减缓水分流失速度，研磨过程也可在微量离心管中使用微型研杵进行。
   4. 向研磨后的样品沉淀中再加入 30 µL 自由基溶液，进一步水合真菌样品。
   5. 将沉淀物装入 3.2 mm 蓝宝石转子中，轻压并去除多余的 DNP 溶剂。插入 3.2 mm 硅胶塞以防止水分流失。通常可将 5–30 mg 样品装入转子中，具体用量需根据即将进行的核磁共振实验的灵敏度要求确定。
   6. 将样品插入 DNP 谱仪并启动旋转，在微波照射下采集 DNP 增强谱图，并与关闭微波时的谱图进行比较。由此可获得增强因子 ε_on/off，对于此类复杂材料，该值通常为 20–40。随后开展设计好的实验以测定细胞壁结构。

3. 用于核磁共振和动态核极化研究的植物生物质制备

1. 固体核磁共振实验用植物材料的制备
   1. 在生长室中使用¹³CO₂气体或¹³C-葡萄糖培养基，自行培养均匀¹³C标记的植物，具体方法如先前文献所述^46,47，或直接从同位素标记公司购买已标记的材料。
      注意：¹³C-葡萄糖仅可用于暗培养条件，以避免光合作用引入¹²C。
   2. 使用实验室剃刀将均匀¹³C标记的植物材料切成小片（通常尺寸为1–2 mm）。
      注意：根据研究目的不同，有时会使用提取后的细胞壁进行结构表征，相关详细实验方案已在先前研究中报道^21,46。
   3. 若样品曾经过干燥处理，则在1.5 mL离心管中向30 mg植物材料加入100 µL水，涡旋混匀，在室温下平衡1天。以4,000 × g离心10分钟，并用移液器去除多余水分。
   4. 若样品在任何阶段均未干燥，则无需进一步处理，直接使用。
   5. 将所得植物材料装填至3.2 mm或4 mm氧化锆（ZrO₂）转子中，用于固体核磁共振实验。
2. DNP实验用植物材料的制备
   1. 按照步骤2.2.1和2.2.2所述方法，配制60 µL浓度为10 mM的AMUPol自由基储备液。
   2. 使用实验室剃刀将待测的均匀¹³C标记植物材料切成小片（尺寸为1–2 mm），并称取20 mg植物材料。
   3. 使用研钵和研杵手工研磨植物碎片至细小颗粒（大小约1–2 mm），最终粉末应呈现均匀外观。
   4. 向植物材料中加入前一步骤（步骤2.2.2）制备的40 µL DNP储备液，轻柔研磨5分钟，以确保自由基均匀混合。
   5. 研磨后，再加入20 µL储备液，进一步润湿植物材料。
   6. 将平衡后的植物样品装填至3.2 mm蓝宝石转子中，用于DNP实验。插入硅胶塞以防止水分流失。

4. 用于碳水化合物富集生物材料初步表征的标准固态核磁共振实验

注意：本节提供了核磁共振（NMR）实验的简要概述。然而，结构解析通常需要深厚的专业知识，因此建议与核磁共振波谱学专家开展合作。

1. 测量1D ¹³C交叉极化（CP）、¹³C直接极化（DP）（分别采用2秒和35秒的循环延迟）以及¹H-¹³C INEPT^48,49谱图，以获得细胞组分动力学分布的一般性认识（图1a）。细胞壁通常为相对刚性的部分，在CP谱图中表现出主导信号。
2. 进行一系列标准的2D ¹³C-¹³C相关实验，用于¹³C信号的共振归属。首先采用反聚焦INADEQUATE^50,51实验获取碳原子连接信息，并结合一系列空间相关实验（如1.5毫秒RFDR⁵²（图1b）和50毫秒CORD/DARR⁵³实验）加以辅助。
   注：若需寻找富含特定组分（例如初生壁或次生壁）的样品，则可能需要分别测量多个样品段或来自多株植物的样品，以确定具有最佳组分构成的样品。
3. 开展2D ¹⁵N-¹³C相关实验，以辅助蛋白质和含氮碳水化合物信号的共振归属。
   注：共振归属通常耗时较长。目前正开发一种新方法，以帮助无相关经验的研究人员更便捷地完成碳水化合物信号的共振归属。
4. 测量更具特异性的实验，以系统确定复杂生物大分子的空间邻近性（图1c、d）、水合状态及分子运动性，进而解析富含碳水化合物材料的三维结构，相关方法此前已有系统描述^22,29。

结果

同位素标记显著增强了核磁共振（NMR）的灵敏度，使得能够采集一系列二维¹³C-¹³C和¹³C-¹⁵N相关谱图，用于分析聚合物的组成、水合状态、分子运动性及堆积方式，这些信息将被整合以构建细胞壁结构的三维模型（图1）。如果实现均匀标记，可在1小时内完成全套一维¹³C和¹⁵N谱图的采集，每张标准二维谱图的测量时间不应超过24小时。

制备良好的样品通常应具有较高的核磁共振（NMR）信号强度和尖锐的谱线。任一参数的下降均表明样品制备未达最佳状态。真菌样品应以从未干燥的方式进行制备，若在装样过程中发生部分脱水，则可能导致谱线显著展宽。如果实验所需时间明显长于完全装填的NMR样品的预期时间，则可能表明标记水平较低。若在二维¹³C-¹³

讨论

与生化方法相比，固态核磁共振（NMR）具有非破坏性和高分辨率的优势。NMR在组分分析中也具有定量性，且与大多数其他分析方法不同，不会因生物大分子溶解度有限而引入不确定性。本实验方案的建立将有助于未来对富含碳水化合物的生物材料及功能化聚合物的研究。然而需要注意的是，共振归属和数据分析可能耗时较长，通常需要系统的培训。作者目前正在开发相关工具和数据库，以帮助无相关经验的科研人员克服这一障碍。

由于¹³C的天然同位素丰度仅为1.1%，使用未标记材料观测到¹³C-¹³C交叉峰的概率仅为使用均匀标记样品的0.012%（1.1% × 1.1%）。因此，通过本方案实现的同位素富集可将核磁共振灵敏度提高四个数量级，从而实现二维相关实验用于结构测定。

优化且充分水合的样品在二维¹³C-¹³C 相关谱中应表现出尖锐的谱线。A. fumigatus中的β-葡聚糖和植物中的果胶等可移动组分在600–800 MHz核磁共振波谱...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
四水合钼酸铵	Acros Organics	12054-85-2
AMUPol	Cortecnet	C010P002
分析天平	Ohaus	B730439218	型号 PA84C
16 L 生物高压灭菌器	VWR	470230-598
生物安全柜	Labconco corporation	302319100
硼酸	VWR	BDH9222	储存于 15–30 °C
六水合氯化钴(II)	Honeywell|Fluka	60820	≥98 %
五水合硫酸铜(II)	BDH	BDH9312	≥98 %
Corning LSE 摇床培养箱	Thermo Fisher Scientific	7202152
D2O	Sigma Aldrich	151882	99.9 原子% D
d6-DMSO	Sigma Aldrich	151874	99.9 原子% D
d8-甘油	Sigma Aldrich	447498	≥99 原子% D
3.2 kDa 透析袋	Sigma Aldrich	D2272	132724
磷酸氢二钾	VWR	BDH9266	≥98 %
甘油	Sigma Aldrich	G5516	≥99.5 %
Heraus Megafuge 16R 离心机	Thermo Fischer Scientific	750004271	最大相对离心力 25,830 × g
HR-MAS 一次性转子插入套件	Bruker	B4493	Kel-F
七水合硫酸亚铁	Alfa Aesar	14498	≥99+ %
七水合硫酸镁	VWR	10034998	储存于 18–26 °C
四水合氯化锰(II)	Alfa Aesar	11563	≥99 %
磷酸二氢钾	VWR	470302-254	≥99 %
pH 计	Mettler Toledo	B706689216
乙二胺四乙酸四钠	Acros Organics	13235-36-9	≥99.5 %
七水合硫酸锌	Alfa Aesar	33399	≥98 %
12C3, d8-甘油	Cambridge Isotope Laboratory	CDLM-8660	12C3, 99.95%; D8, 98%
13C6-葡萄糖	Sigma Alrdrich	364606	≥99 % (CP)
15N-硝酸钠	Sigma Aldrich	364606	≥98 % 15N, ≥99 (cp)
3.2 mm 宝石NMR转子	Cortecnet	B6939
3.2 mm 硅胶塞	Bruker	B7089
4 mm MAS 转子套件	Bruker	H14355	氧化锆