利用动态核极化固态核磁共振技术进行结构解析的真菌与植物材料制备

摘要

本文介绍了一种用于制备¹³C,¹⁵N标记的真菌和植物样品的方案，适用于多维固态核磁共振波谱和动态核极化（DNP）研究。

摘要

本方案展示了如何制备均匀¹³C、¹⁵N标记的真菌材料，以及如何对这些软性材料进行处理以用于固态核磁共振和灵敏度增强的动态核极化（DNP）实验。文中还详细描述了植物生物质样品的处理流程。该方法可实现一系列1D和2D ¹³C-¹³C/¹⁵N相关谱图的测量，从而在几乎不干扰样品天然状态的前提下，对复杂生物材料进行高分辨率的结构解析。同位素标记效果可通过1D谱图中的信号强度以及2D相关谱图中的极化转移效率进行定量评估。动态核极化（DNP）样品制备的成功与否可通过灵敏度增强因子进行评价。进一步开展针对多糖和蛋白质结构特征的研究，将有助于构建材料的三维结构模型。这些方法可经修改和调整，用于研究多种富含碳水化合物的材料，包括植物、真菌、藻类和细菌的天然细胞壁，以及合成或设计的碳水化合物聚合物及其与其他分子形成的复合物。

引言

碳水化合物在多种生物过程中发挥核心作用，例如能量储存、结构构建以及细胞识别与黏附。它们在细胞壁中富集，而细胞壁是植物、真菌、藻类和细菌的基本组成成分^1,2,3。细胞壁是生产生物燃料和生物材料的重要来源，同时也是抗菌治疗的潜在靶点^4,5,6,7,8,9。

几十年来，研究人员通过四种主要的生化或遗传方法对这些复杂材料的结构进行表征，极大地推动了当前对其的理解。第一种主要方法依赖于使用强化学试剂或酶进行连续处理，将细胞壁分解为不同组分，随后对各组分中的糖类进行组成和连接方式分析¹⁰。该方法有助于揭示多糖聚合物的区域分布，但由于生物分子的化学和物理特性，其解释可能存在误导性。例如，难以确定碱提取组分是来源于结构松散的单一区域分子，还是来源于空间上分离但溶解度相似....

方案

1. ¹³C、¹⁵N标记的Aspergillus fumigatus液体培养基的培养

1. 未标记和 ¹³C, ¹⁵N标记的培养基
   注意：YPD 培养基（Yeast Extract Peptone Dextrose medium）和改良的最低限度培养基⁴³ 用于真菌培养物的保藏。所有经高压灭菌后的操作均在超净工作台中进行，以尽量减少污染。
   1. 无标记液体培养基的制备：将6.5 g YPD粉末溶解于100 mL蒸馏水中，134 °C高压灭菌25 min。
   2. 无标记固体培养基的制备
      1. 在100 mL蒸馏水中加入1.5 g琼脂和6.5 g YPD粉末。
      2. 在121 °C下高压灭菌25分钟，然后冷却至约50 °C。
      3. 将13-15 mL培养基转移至每个预先灭菌的塑料培养皿中，并立即用盖子盖好。
   3. 样品制备 ¹³C, ¹⁵N标记液体培养基
      注意：为制备用于同位素标记的生长溶液，需使用含有 ¹³C-葡萄糖和 ¹⁵分别配制硝酸钠和微量元素溶液，使用前混合。
      1. 按所列配方制备 ....

结果

同位素标记显著提高了核磁共振（NMR）的灵敏度，使得一系列二维（2D）实验的检测成为可能 ¹³C-¹³C 和 ¹³C-¹⁵利用氮相关谱分析聚合物的组成、水合状态、流动性和堆积方式，并将这些信息整合以构建细胞壁结构的三维模型（图1）。如果均匀标记成功，则可获得一套完整的1D ¹³C 和 ¹⁵1 小时内可采集 N 个谱图，每个标准二维谱图的测量时间不应超过 24 小时。

制备良好的样品通常应具有较高的核磁共振（NMR）信号强度和较窄的谱线宽度。任一参数的下降均表明样品制备未达最佳状态。真菌样品应以从未干燥的方式进行制备，若在装样过程中发生部分脱水，则可能导致谱线显著展宽。如果实验所需时间明显长于完全装填的NMR样品的预期时间，则可能表明标记水平较低。若在二维^.......

讨论

与生化方法相比，固态核磁共振（NMR）具有非破坏性和高分辨率的优势。NMR在组分分析中也具有定量性，且与大多数其他分析方法不同，不会因生物大分子溶解度有限而引入不确定性。本实验方案的建立将有助于未来对富含碳水化合物的生物材料及功能化聚合物的研究。然而需要注意的是，共振归属和数据分析可能耗时较长，通常需要系统的培训。作者目前正在开发相关工具和数据库，以帮助无相关经验的科研人员克服这一障碍。

由于¹³C的天然同位素丰度仅为1.1%，使用未标记材料观测到¹³C-¹³C交叉峰的概率仅为使用均匀标记样品的0.012%（1.1% × 1.1%）。因此，通过本方案实现的同位素富集可将核磁共振灵敏度提高四个数量级，从而实现二维相关实验用于结构测定。

优化且充分水合的样品在二维¹³C-¹³C 相关谱中应表现出尖锐的谱线。A. fumigatus中的β-葡聚糖和植物中的果胶等可移动组分在600–800 MHz核磁共振波谱.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
四水合钼酸铵	Acros Organics	12054-85-2
AMUPol	Cortecnet	C010P002
分析天平	Ohaus	B730439218	型号 PA84C
16 L 生物高压灭菌器	VWR	470230-598
生物安全柜	Labconco corporation	302319100
硼酸	VWR	BDH9222	储存于 15–30 °C
六水合氯化钴(II)	Honeywell|Fluka	60820	≥98 %
五水合硫酸铜(II)	BDH	BDH9312	≥98 %
Corning LSE 摇床培养箱	Thermo Fisher Scientific	7202152
D2O	Sigma Aldrich	151882	99.9 原子% D
d6-DMSO	Sigma Aldrich	151874	99.9 原子% D
d8-甘油	Sigma Aldrich	447498	≥99 原子% D
3.2 kDa 透析袋	Sigma Aldrich	D2272	132724
磷酸氢二钾	VWR	BDH9266	≥98 %
甘油	Sigma Aldrich	G5516	≥99.5 %
Heraus Megafuge 16R 离心机	Thermo Fischer Scientific	750004271	最大相对离心力 25,830 × g
HR-MAS 一次性转子插入套件	Bruker	B4493	Kel-F
七水合硫酸亚铁	Alfa Aesar	14498	≥99+ %
七水合硫酸镁	VWR	10034998	储存于 18–26 °C
四水合氯化锰(II)	Alfa Aesar	11563	≥99 %
磷酸二氢钾	VWR	470302-254	≥99 %
pH 计	Mettler Toledo	B706689216
乙二胺四乙酸四钠	Acros Organics	13235-36-9	≥99.5 %
七水合硫酸锌	Alfa Aesar	33399	≥98 %
12C3, d8-甘油	Cambridge Isotope Laboratory	CDLM-8660	12C3, 99.95%; D8, 98%
13C6-葡萄糖	Sigma Alrdrich	364606	≥99 % (CP)
15N-硝酸钠	Sigma Aldrich	364606	≥98 % 15N, ≥99 (cp)
3.2 mm 宝石NMR转子	Cortecnet	B6939
3.2 mm 硅胶塞	Bruker	B7089
4 mm MAS 转子套件	Bruker	H14355	氧化锆