该方法提供了一种将光遗传学与基因编码的钙离子传感器相结合的技术，用于成像模式生物 C. elegans 体壁肌肉中胞质钙离子的基础水平以及刺激诱导的钙瞬变动态变化。
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本文内容
摘要
摘要
模式生物 C. elegans 为进行活体钙成像提供了优良的实验体系。其透明的身体结构和可进行遗传操作的特性，使得基因编码的钙离子传感器能够在特定细胞中靶向表达。本实验方案概述了利用这些传感器对目标细胞（特别是线虫体壁肌细胞）中钙离子动态进行活体成像的方法。通过共表达突触前通道视紫红质，可使用蓝光脉冲刺激兴奋性运动神经元释放乙酰胆碱，从而引起肌肉去极化及胞质钙离子水平的可重复变化。本文讨论了两种不同难度的线虫固定技术。对这两种技术的比较表明，两种方法均能保持神经肌肉接头的生理状态，并可对钙瞬变信号进行可重复的定量分析。结合光遗传学与功能性钙成像技术，可在多种突变体背景下评估突触后钙处理与钙稳态的变化。所展示的数据验证了两种固定方法的有效性，并重点研究了 C. elegans 肌浆（内质）网钙离子ATP酶以及钙激活的BK钾离子通道在体壁肌钙调节中的作用。
引言
本文介绍了利用光遗传学神经刺激对C. elegans体壁肌肉进行活体钙成像的方法。通过在肌肉中表达基因编码的钙指示剂（GECI），并结合蓝光诱导的神经元去极化，可建立一个能够清晰观察诱发性突触后钙瞬变的系统。该方法避免了电刺激的使用，从而实现了对影响突触后钙动力学的突变体进行非侵入性分析。
单荧光蛋白基因编码的钙离子指示剂（GECIs），例如 GCaMP，其结构包含一个荧光蛋白分子，在N端融合肌球蛋白轻链激酶的M13结构域，C端融合钙调蛋白（CaM）。当结合钙离子后，对钙具有高亲和力的CaM结构域发生构象变化，进而诱导荧光蛋白产生构象改变，导致荧光强度增强1。GCaMP的激发波长为488 nm，因此不适合与通道视紫红质（channelrhodopsin）联合使用，因为后者具有相近的激发波长（473 nm）。因此，为了将钙离子检测与通道视紫红质刺激相结合，需要将GCaMP中的绿色荧光蛋白替换为红色荧光蛋白mRuby，从而形成RCaMP。利用在肌肉中表达的RCaMP，结合胆碱能运动神经元中表达的通道视紫红质，可在同一只线虫中实现光遗传学操控与功能成像的同步应用，用于研究神经肌肉接头（NMJ）的功能2。
使用通道视紫红质可绕过对 C. elegans 神经肌肉接头进行去极化所需的电刺激，后者只能在....
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方案
1. 显微镜设置
- 使用具备荧光功能的复式显微镜。本研究中，数据采集采用配备LED激发光源的直立显微镜（材料表）。
- 为清晰观察体壁肌肉中的荧光变化，应使用高倍物镜。
- 对于解剖制备样本，使用60倍、数值孔径（NA）1.0的水浸物镜（材料表）。
- 对于使用纳米珠的制备样本，使用60倍、数值孔径（NA）1.4的油浸物镜（材料表）。该放大倍数可确保肌肉结构在相机传感器上获得足够的分辨率。
- 将高灵敏度相机连接至显微镜，以高帧率采集图像，以便追踪钙离子水平的快速变化。本研究中采用sCMOS成像系统（材料表），可在全帧模式下以100 Hz进行成像，因为Ca2+信号的上升时间可短至数十毫秒。
- 使用运行于ImageJ10中的Micro-Manager软件，按照制造商说明控制相机采集和LED荧光激发（材料表）。
- 使用一个开源电子平台插件，该插件连接一个外部开源微控制器板（材料表），用于管理外部时序脉冲以控制荧光激发。
注：数字引脚8至13提供数字输出位0至5，可按二进制值1、10、100等进行寻址....
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结果
该技术用于评估影响钙处理或肌肉去极化的突变体中的变化。通过可视化基础荧光水平和荧光瞬变信号，对肌肉中静息状态下的胞质钙浓度及钙动力学进行分析。重要的是，动物需在全反式视黄醛中培养至少三天，以确保视黄醛成功整合，从而激活通道视紫红质（图2A）。若动物未暴露于全反式视黄醛，则不会触发肌肉钙瞬变（图2B）。尽管这些动物仍可用于评估基础胞质钙水平，但无法捕捉到钙的任何动态变化。此外，作为动物状态或解剖完整性的内部对照，动物在蓝光刺激后应出现肌肉收缩。当使用纳米磁珠进行固定时，应选择仅引起线虫身体轻微整体移动的肌肉收缩记录用于数据采集。若用于采集原始荧光值的肌肉发生强烈收缩，导致线虫全身明显移动，则瞬变曲线将反映出此类运动伪影（图2C），该数据应排除在定量分析之外。
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讨论
C. elegans 神经生物学研究中，基因编码的钙离子指示剂（GECIs）是一种强大的工具。以往的研究利用钙成像技术，通过多种刺激方法，广泛考察了神经元和肌细胞的多种功能，包括感觉和行为反应。一些研究采用化学刺激物来诱导感觉神经元ASH中的钙瞬变22,23，或在咽部肌肉中引发钙波24。另一些研究则在将线虫固定于微流控芯片中的同时施加机械刺激，以检测触觉感受神经元中的钙反应25。此外，还有研究使用电刺激来观察神经元26和体壁肌肉27中的钙变化。这些研究的共同点在于，均依赖外部刺激（如溶液或设备）来触发钙瞬变。本文所述方案则充分利用了光遗传学刺激所带来的控制优势，该方法具有神经元特异性，并在同一实验体系中结合了对肌肉表达的GECIs2进行功能分析。
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者感谢 Alexander Gottschalk 博士提供 ZX1659、含 RCaMP 和光敏通道蛋白的线虫品系，感谢 Hongkyun Kim 博士提供 slo-1(eg142) 线虫品系，以及感谢日本国家生物资源计划提供 sca-1(tm5339) 线虫品系。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 全-反式视黄醛 | Sigma-Aldrich | R2500 | 激活通道视紫红质所必需 |
| 琥珀色LED | RCaMP照明 | ||
| Arduino UNO | Mouser | 782-A000066 | 控制荧光照明 |
| 蓝色LED | 通道视紫红质照明 | ||
| BX51WI显微镜 | Olympus | 固定式复合显微镜 | |
| 电流控制低噪声线性电源 | Ametek | Sorenson | 控制LED强度 |
| Igor Pro | Wavemetrics | Wavemetrics.com | 绘图软件 |
| ImageJ | NIH | imagej.nih.gov | 图像处理软件 |
| LUMFLN 60x 水镜 NA 1.4 | Olympus | 用于离体样本的水浸物镜 | |
| Master-8刺激器 | A.M.P.I | 图像采集与LED照明的主控定时器 | |
| Micro-Manager | micro-manager.org | 控制相机采集与LED激发 | |
| Microsoft Excel | Microsoft | 电子表格软件 | |
| pco.edge 4.2 CMOS相机 | pco. | 4.2 | 高速相机 |
| PlanApo N 60x 油镜 NA 1.4 | Olympus | 用于纳米小球样本的油浸物镜 | |
| Polybead微球 | Polysciences, Inc. | 00876-15 | 用于线虫固定 |
| 固态开关 | Sensata Technologies | Crydom CMX100D6 | 控制LED照明时序 |
| 转基因品系，sca-1(tm5339)；[zxIs6{Punc17::chop-2 (h134R)::yfp,lin-15(+)}; Pmyo3::RCaMP35] | Richmond实验室 | SY1627 | 表达兴奋性神经元通道视紫红质和体壁肌RCaMP、携带SERCA突变等位基因的线虫品系 |
| 转基因品系，slo-1 (eg142)；[zxIs6{Punc17::chop-2 (h134R)::yfp,lin-15(+)}; Pmyo3::RCaMP35] | Richmond实验室 | 表达兴奋性神经元通道视紫红质和体壁肌RCaMP、携带钙激活BK钾通道突变等位基因的线虫品系 | |
| 转基因品系，[zxIs6{Punc17::chop-2 (h134R)::yfp,lin-15(+)}; Pmyo3::RCaMP35] | Gottschalk实验室 | ZX1659 | 表达兴奋性神经元通道视紫红质和体壁肌RCaMP的线虫品系 |
参考文献
- Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca2+ probe composed of a single green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 19 (2), 137-141 (2001).
- Akerboom, J., et al. G....
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重印与许可
