在体钙成像技术在 C. elegans 体壁肌肉中的应用

摘要

该方法提供了一种将光遗传学与基因编码的钙离子传感器相结合的技术，用于成像模式生物 C. elegans 体壁肌肉中胞质钙离子的基础水平以及刺激诱导的钙瞬变动态变化。

摘要

模式生物 C. elegans 为进行活体钙成像提供了优良的实验体系。其透明的身体结构和可进行遗传操作的特性，使得基因编码的钙离子传感器能够在特定细胞中靶向表达。本实验方案概述了利用这些传感器对目标细胞（特别是线虫体壁肌细胞）中钙离子动态进行活体成像的方法。通过共表达突触前通道视紫红质，可使用蓝光脉冲刺激兴奋性运动神经元释放乙酰胆碱，从而引起肌肉去极化及胞质钙离子水平的可重复变化。本文讨论了两种不同难度的线虫固定技术。对这两种技术的比较表明，两种方法均能保持神经肌肉接头的生理状态，并可对钙瞬变信号进行可重复的定量分析。结合光遗传学与功能性钙成像技术，可在多种突变体背景下评估突触后钙处理与钙稳态的变化。所展示的数据验证了两种固定方法的有效性，并重点研究了 C. elegans 肌浆（内质）网钙离子ATP酶以及钙激活的BK钾离子通道在体壁肌钙调节中的作用。

引言

本文介绍了利用光遗传学神经刺激对C. elegans体壁肌肉进行活体钙成像的方法。通过在肌肉中表达基因编码的钙指示剂（GECI），并结合蓝光诱导的神经元去极化，可建立一个能够清晰观察诱发性突触后钙瞬变的系统。该方法避免了电刺激的使用，从而实现了对影响突触后钙动力学的突变体进行非侵入性分析。

单荧光蛋白基因编码的钙离子指示剂（GECIs），例如 GCaMP，其结构包含一个荧光蛋白分子，在N端融合肌球蛋白轻链激酶的M13结构域，C端融合钙调蛋白（CaM）。当结合钙离子后，对钙具有高亲和力的CaM结构域发生构象变化，进而诱导荧光蛋白产生构象改变，导致荧光强度增强¹。GCaMP的激发波长为488 nm，因此不适合与通道视紫红质（channelrhodopsin）联合使用，因为后者具有相近的激发波长（473 nm）。因此，为了将钙离子检测与通道视紫红质刺激相结合，需要将GCaMP中的绿色荧光蛋白替换为红色荧光蛋白mRuby，从而形成RCaMP。利用在肌肉中表达的RCaMP，结合胆碱能运动神经元中表达的通道视紫红质，可在同一只线虫中实现光遗传学操控与功能成像的同步应用，用于研究神经肌肉接头（NMJ）的功能²。

使用通道视紫红质可绕过对 C. elegans 神经肌肉接头进行去极化所需的电刺激，后者只能在离体标本中实现，因此该技术在针对特定组织时更易于操作且更为精确。例如，通道视紫红质此前已在 C. elegans 中用于可逆地激活特定神经元，从而引发兴奋性或抑制性神经元的显著激活^3,4。使用光刺激诱导去极化还可避免因直接电刺激导致的神经元损伤问题。这为研究多种不同刺激方案（包括持续性和重复性刺激）对突触后钙动力学的影响提供了机会⁴。

C. elegans 的透明特性使其成为荧光成像功能分析的理想模型。然而，在刺激神经肌肉接头（NMJ）处的兴奋性乙酰胆碱神经元时，线虫通常会立即发生肌肉收缩⁴，因此在观察离散的钙信号变化时，固定线虫至关重要。传统上，常使用药理学试剂使动物麻痹。其中一种常用药物是左旋咪唑（levamisole），它是一种胆碱能乙酰胆碱受体激动剂^5,6,7。由于左旋咪唑会导致兴奋性肌细胞受体亚型持续激活，因此该试剂不适用于肌肉钙动力学的研究。左旋咪唑的作用会引起突触后去极化，升高胞质钙离子浓度，从而掩盖突触前刺激后所引发的钙信号变化。为了避免使用麻痹类药物，我们考察了两种替代方法来固定 C. elegans。一种方法是将线虫粘附固定后进行解剖，暴露体壁肌，类似于现有的 C. elegans 神经肌肉接头电生理学方法⁸；另一种方法是使用纳米磁珠固定完整的线虫个体⁹。这两种方法均能实现对静息状态及刺激诱发的肌肉钙瞬变进行可重复且易于定量的测量。

本文所述方法可用于测量秀丽隐杆线虫（C. elegans）突触后体壁肌细胞中的基础胞质钙水平及钙瞬变。文中提供了采用两种不同固定技术所获得的数据示例。这两种技术均利用光遗传学手段使肌细胞去极化，而无需使用电刺激。这些示例证明了该方法在评估影响线虫突触后钙处理功能突变方面的可行性，并指出了两种固定方法各自的优缺点。

方案

1. 显微镜设置

1. 使用具备荧光功能的复式显微镜。本研究中，数据采集采用配备LED激发光源的直立显微镜（材料表）。
2. 为清晰观察体壁肌肉中的荧光变化，应使用高倍物镜。
   1. 对于解剖制备样本，使用60倍、数值孔径（NA）1.0的水浸物镜（材料表）。
   2. 对于使用纳米珠的制备样本，使用60倍、数值孔径（NA）1.4的油浸物镜（材料表）。该放大倍数可确保肌肉结构在相机传感器上获得足够的分辨率。
3. 将高灵敏度相机连接至显微镜，以高帧率采集图像，以便追踪钙离子水平的快速变化。本研究中采用sCMOS成像系统（材料表），可在全帧模式下以100 Hz进行成像，因为Ca²⁺信号的上升时间可短至数十毫秒。
4. 使用运行于ImageJ¹⁰中的Micro-Manager软件，按照制造商说明控制相机采集和LED荧光激发（材料表）。
5. 使用一个开源电子平台插件，该插件连接一个外部开源微控制器板（材料表），用于管理外部时序脉冲以控制荧光激发。
   注：数字引脚8至13提供数字输出位0至5，可按二进制值1、10、100等进行寻址。串口设置详见表1，相关信息可在Micro-Manager官网（材料表）获取。微控制器板的固件亦可在该网站下载。
6. 为控制时序逻辑，按照制造商说明在软件中启动Micro-Manager采集协议（材料表）。
   注：此操作将同时启动预设的相机帧持续时间与帧数，以及逻辑快门和预设的琥珀色LED用于荧光激发。在此情况下，琥珀色LED的固态开关由微控制器第1位输出通过引脚9控制。相机帧输出TTL信号（背板输出3接口）触发刺激器，从而在成像序列启动后的设定时间精确控制蓝光LED的激活，以激发视蛋白（channelrhodopsin）。
7. 为通过蓝光刺激视蛋白并记录RCaMP信号变化，使用两个LED。使用峰值发射波长为470 nm、带通滤光片（455–490 nm）的LED激活视蛋白，使用峰值发射波长为594 nm、带通滤光片（570–600 nm）的LED激发RCaMP。
8. 为同时激活视蛋白并捕获RCaMP荧光水平的变化，需共照射两个LED，并使用二向色分光合束器将光线导入同一光路。
9. 使用由TTL信号控制的固态开关（材料表）调节LED照明时序（最大额定开启时间1 ms，关闭时间0.3 ms：0至90%开启与关闭时间< 100 µs）。
10. 通过电流控制的低噪声线性电源（材料表）设置LED强度。
11. 为确保蓝光LED的精确时序，通过刺激器输出的TTL脉冲直接激活固态继电器。将蓝光刺激程序设定于刺激器（材料表）中，使其作为从图像采集开始到蓝光LED照明之间的精确计时装置。本实验中，在仅采集2秒RCaMP荧光后启动蓝光刺激，采用一组5次、每次2 ms的蓝光脉冲，脉冲间隔50 ms，以激活视蛋白。
    注：蓝光脉冲前的延迟时间、脉冲持续时间、脉冲间隔以及脉冲序列中的脉冲数量均可在此设定，应根据具体实验需求调整参数。

2. C. elegans 样品制备与数据采集

1. 为了光学刺激突触前神经元，需获取在兴奋性胆碱能神经元中表达光敏通道蛋白（channelrhodopsin）的动物模型，该表达由特定启动子驱动 unc-17 启动子区域，以及在所有体壁肌肉中由该启动子驱动表达的RCaMP myo-3 启动子区域².
   注意：仅建议使用整合了转基因且荧光表达水平稳定的动物，因为相应细胞类型中表达的变异性可能影响数据采集的可靠性。
2. 配制所有物质的工作液转 视网膜素，通过稀释视网膜素粉末（材料表) 溶于乙醇中，配制成终浓度为 100 mM 的溶液，于 -20 °C 保存。该工作液可稳定保存约一年。
3. 制备OP50菌种储备液 E. coli，于LB培养基中培养，并补充全转录 步骤2.2中制备的工作液中加入视黄醛，终浓度为80 µM。OP50加视黄醛储备液的使用体积取决于实验所需平板的数量。
4. 在NGM平板上加入约300 µL OP50+视黄醛储备液，于室温避光条件下静置过夜，使其自然干燥。
5. 培养 秀丽隐杆线虫 在20 °C避光条件下，于含OP50和视黄醛的NGM平板上培养至所需年龄。本实验使用成虫期线虫。
   1. 对于使用离体标本的实验，仅使用带有卵的成年蠕虫，因为在更年轻、更小的个体上进行解剖操作极具挑战性。将动物置于OP50-视黄醛平板上至少3天，以实现有效的光敏通道蛋白激活。
6. 若使用解剖制备样本^8,11 (图1A在弱光条件下进行解剖操作。
   1. 将动物置于装有硅胶涂层盖玻片底面的解剖皿中，皿内充满1 mM Ca²⁺ 由150 mM NaCl、5 mM KCl、1 mM CaCl₂组成的细胞外溶液₂，4 mM MgCl₂10 mM 葡萄糖、5 mM 蔗糖和 15 mM HEPES（pH 7.3，-340 Osm）。
   2. 使用带蓝色染料的液体外用皮肤黏合剂将动物固定，在蠕虫背侧沿黏合剂边缘用玻璃针在黏合剂与蠕虫交界处做侧向角质层切口。
   3. 使用口吸移液管清除虫体腔内的内脏。
   4. 将动物的角质层瓣固定，以暴露腹侧中线体壁肌肉，便于成像。
7. 如果使用纳米珠制备方法（图1B)
   1. 使用ddH₂O配制5%的熔融琼脂糖溶液₂加水至终体积为 100 mL。
   2. 使用巴斯德移液管，将一滴熔融的琼脂糖溶液滴加到一块载玻片上，立即用另一块载玻片垂直覆盖在第一块载玻片上，轻轻施压以形成均匀的琼脂糖垫。使用前移除上方的载玻片。
   3. 加入约 4 µL 聚苯乙烯纳米微珠（材料表) 加到琼脂糖垫的中央。
   4. 在弱光条件下，选取4-6个 秀丽隐杆线虫 加入纳米微珠溶液，确保动物个体不相互重叠，然后小心地盖上盖玻片。
8. 将制备好的载玻片或解剖皿置于显微镜下，使用10倍物镜和较弱的明场照明找到线虫并调焦。
9. 切换至60倍放大倍数，并使用RCaMP荧光激发，以识别位于阴门前方且处于正确焦平面的腹侧体壁肌。
   注意：选择阴门前侧的肌肉，因为这些肌肉反映了电生理实验中常用的刺激部位。
10. 将图像路径从目镜切换至相机，方法是拉出拨杆并点击确认 活体 在数据采集软件内（材料表).
    注意：此时务必关闭蓝光刺激通路，以确保在采集图像之前通道视紫红质不会被激活。
11. 使用显微镜微调焦旋钮，在数据采集软件中对图像进行聚焦。
12. 当肌肉清晰对焦后，通过取消勾选关闭实时图像 实时 按钮。
13. 点击 感兴趣区域 在数据采集软件中点击按钮，并在目标肌肉周围创建一个框。
14. 打开刺激器上已在步骤1.10中预设的蓝光刺激通路。
15. 点击 获取 在成像软件中通过CMOS相机采集图像。设置曝光时间为10 s，采集帧数为1,000帧， binning为2×。

3. 数据分析

1. 在成像软件（材料表）中打开数据文件，并使用多边形工具勾画出目标肌肉区域。此区域即为感兴趣区域（ROI）。
2. 依次点击图像 | 堆栈 | 绘制Z轴轮廓，并将生成的数据点导出至电子表格软件（材料表）。该功能将绘制ROI选区的平均值随时间变化的曲线。
3. 将使用多边形工具创建的肌肉ROI移至动物体外区域，按照3.2步骤所述方法获取背景荧光值。将所得数据导出至电子表格工作簿中。
4. 在电子表格工作簿中，从每个时间点的肌肉荧光值中减去相应的背景荧光值。由此获得经背景校正后的荧光信号。
5. 对前2秒数据点的背景校正后荧光值取平均，得到基线荧光强度F。
6. 利用基线荧光强度计算每个时间点的归一化荧光水平。计算公式为(ΔF/F)+1，其中ΔF表示F(t)−F，F(t)为任意时间点的荧光测量值，F为基线值。+1作为Y轴偏移量加入。
7. 对每一张采集的肌肉图像重复执行步骤3.2–3.6。每张图像中可选择单个或多个肌细胞，由研究人员自行决定。实验的样本量n可通过功效分析确定。
8. 使用步骤3.2–3.6处理后的数据，根据图形软件的制造商说明（材料表），在绘图软件中绘制荧光值的变化轨迹。
9. 根据该轨迹，利用绘图软件提供的工具并依照制造商说明，测量钙瞬变的动力学参数，如达峰时间与半衰减时间。

结果

该技术用于评估影响钙处理或肌肉去极化的突变体中的变化。通过可视化基础荧光水平和荧光瞬变信号，对肌肉中静息状态下的胞质钙浓度及钙动力学进行分析。重要的是，动物需在全反式视黄醛中培养至少三天，以确保视黄醛成功整合，从而激活通道视紫红质（图2A）。若动物未暴露于全反式视黄醛，则不会触发肌肉钙瞬变（图2B）。尽管这些动物仍可用于评估基础胞质钙水平，但无法捕捉到钙的任何动态变化。此外，作为动物状态或解剖完整性的内部对照，动物在蓝光刺激后应出现肌肉收缩。当使用纳米磁珠进行固定时，应选择仅引起线虫身体轻微整体移动的肌肉收缩记录用于数据采集。若用于采集原始荧光值的肌肉发生强烈收缩，导致线虫全身明显移动，则瞬变曲线将反映出此类运动伪影（图2C），该数据应排除在定量分析之外。

讨论

C. elegans 神经生物学研究中，基因编码的钙离子指示剂（GECIs）是一种强大的工具。以往的研究利用钙成像技术，通过多种刺激方法，广泛考察了神经元和肌细胞的多种功能，包括感觉和行为反应。一些研究采用化学刺激物来诱导感觉神经元ASH中的钙瞬变^22,23，或在咽部肌肉中引发钙波²⁴。另一些研究则在将线虫固定于微流控芯片中的同时施加机械刺激，以检测触觉感受神经元中的钙反应²⁵。此外，还有研究使用电刺激来观察神经元²⁶和体壁肌肉²⁷中的钙变化。这些研究的共同点在于，均依赖外部刺激（如溶液或设备）来触发钙瞬变。本文所述方案则充分利用了光遗传学刺激所带来的控制优势，该方法具有神经元特异性，并在同一实验体系中结合了对肌肉表达的GECIs²进行功能分析。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
全-反式视黄醛	Sigma-Aldrich	R2500	激活通道视紫红质所必需
琥珀色LED			RCaMP照明
Arduino UNO	Mouser	782-A000066	控制荧光照明
蓝色LED			通道视紫红质照明
BX51WI显微镜	Olympus		固定式复合显微镜
电流控制低噪声线性电源	Ametek	Sorenson	控制LED强度
Igor Pro	Wavemetrics	Wavemetrics.com	绘图软件
ImageJ	NIH	imagej.nih.gov	图像处理软件
LUMFLN 60x 水镜 NA 1.4	Olympus		用于离体样本的水浸物镜
Master-8刺激器	A.M.P.I		图像采集与LED照明的主控定时器
Micro-Manager		micro-manager.org	控制相机采集与LED激发
Microsoft Excel	Microsoft		电子表格软件
pco.edge 4.2 CMOS相机	pco.	4.2	高速相机
PlanApo N 60x 油镜 NA 1.4	Olympus		用于纳米小球样本的油浸物镜
Polybead微球	Polysciences, Inc.	00876-15	用于线虫固定
固态开关	Sensata Technologies	Crydom CMX100D6	控制LED照明时序
转基因品系，sca-1(tm5339)；[zxIs6{Punc17::chop-2 (h134R)::yfp,lin-15(+)}; Pmyo3::RCaMP35]	Richmond实验室	SY1627	表达兴奋性神经元通道视紫红质和体壁肌RCaMP、携带SERCA突变等位基因的线虫品系
转基因品系，slo-1 (eg142)；[zxIs6{Punc17::chop-2 (h134R)::yfp,lin-15(+)}; Pmyo3::RCaMP35]	Richmond实验室		表达兴奋性神经元通道视紫红质和体壁肌RCaMP、携带钙激活BK钾通道突变等位基因的线虫品系
转基因品系，[zxIs6{Punc17::chop-2 (h134R)::yfp,lin-15(+)}; Pmyo3::RCaMP35]	Gottschalk实验室	ZX1659	表达兴奋性神经元通道视紫红质和体壁肌RCaMP的线虫品系