本文描述了一种用于评估正常小鼠带状突触形态特征和功能状态的实验方案。该模型同样适用于噪声诱导和年龄相关性耳蜗突触病变受限模型。文中还讨论了以往小鼠研究的相关结果。
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方法文章
小鼠耳蜗特定频率区域带状突触的形态学与功能评估
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
耳蜗内毛细胞（IHCs）通过带状突触将声学信号传递给螺旋神经节神经元（SGNs）。多项实验研究表明，毛细胞突触可能是感音神经性听力损失（SNHL）的最初作用靶点。这些研究提出了耳蜗"突触病变"的概念，指的是带状突触的数量、结构或功能发生改变，导致IHCs与SGNs之间的突触传递异常。尽管耳蜗突触病变不可逆，但它并不影响听力阈值。在噪声诱导的实验模型中，通过选择特定频率区域的IHC突触局限性损伤，可用于识别特异性引起突触病变的环境因素，以及干扰内耳回路所导致的生理后果。本文介绍了一种用于分析成年小鼠特定频率区域耳蜗突触形态与功能的实验方案。该方案中，结合位置-频率图谱与耳蜗图数据，实现特定频率区域在耳蜗中的定位，随后通过突触免疫染色评估带状突触的形态学特征。再根据听觉脑干反应（ABR）波I的振幅来确定带状突触的功能状态。本报告表明，该方法有助于深入理解耳蜗突触功能障碍的发病机制与作用机理，可能为新型治疗策略的开发提供支持。
引言
人类可感知的频率范围约为 20‒20,000 Hz，这些频率可被感知为听觉刺激。正常人耳对接近 1,000 Hz 的频率最为敏感，此时年轻人的平均声压级为 20 μPa（即 0 分贝声压级 [dB SPL]）。在某些病理状态下，听力损失可能仅局限于特定频率。例如，在噪声性听力损失（NIHL）的早期阶段，听力图在 4 kHz 处可观察到一个“切迹”（即听阈升高）1。在哺乳动物耳蜗的基底膜分区上，其刚度和质量的梯度变化形成了指数型的频率分布图，高频声音在耳蜗底部被检测，低频声音则在顶部被检测2。事实上，基底膜上存在一个耳蜗部位-频率对应关系图，由此形成了所谓的音调拓扑结构（tonotopic organization）2,3。基底膜上每一个特定位置仅对某一个特定频率的声音最敏感，这一频率通常被称为特征频率（characteristic frequency）3,4，尽管也可观察到对其他频率的响应。
迄今为止，已有多种小鼠模型被用于研究听觉系统的正常功能、病理过程及治疗效果。精确掌握小鼠耳蜗的生理参数是开展听力损失相关研究的前提。小鼠耳蜗在解剖结构上分为顶回....
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方案
所有操作均依照美国国家研究委员会/实验动物照护与使用指南（第8版）进行。本研究方案已获中国北京首都医科大学机构动物照护与使用委员会批准。
1. 动物选择
- 所有实验均使用成年雄性 C57BL/6J 小鼠（8 周龄）作为动物模型。
注意：携带 Cdh23 剪接变异体的 C57BL/6J 小鼠在听觉系统中表现出加速的衰老现象，表现为在 6 月龄时耳蜗基底回的带状突触损失 40%，中回损失 10%，随后随着年龄增长，整个耳蜗的突触损失迅速增加18,19。因此，建议在听觉研究中谨慎使用 6 月龄以上的 C57BL/6J 小鼠。根据具体的实验目的，也可选用其他品系的小鼠。 - 在进行听力评估前，使用专业的诊断用手持耳镜检查小鼠，以排除外耳或中耳病变。可能的体征包括外耳道内有液体或脓液、局部组织发红和肿胀，以及鼓膜穿孔。
注意：尽管此类情况较为罕见，但一旦发现患有外耳或中耳疾病的小鼠，应予以剔除。
2. 听力评估
- 使用盐酸氯胺酮（100 mg/kg）和盐酸赛拉嗪（10 mg/kg）混合物进行腹腔注射，使小鼠麻醉。通过疼痛刺激（例如....
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结果
对10只C57BL/6J小鼠（8周龄）在麻醉状态下进行了听觉脑干反应（ABR）听力测试。使用4、8、16、32和48 kHz的短音刺激诱发ABR。通过识别ABR中至少一个清晰的波形，视觉判断每只动物的听力阈值。所有小鼠均对短音刺激产生ABR阈值，其范围根据刺激频率不同介于25至70 dB SPL之间。我们的结果表明，听力阈值在16 kHz时最低（图1），对应于耳蜗顶点约43%的距离处（图2），提示其他耳蜗区域的声学敏感性显著降低。
在体视解剖显微镜下，从成年小鼠的颞骨中分离出耳蜗全埋片（图2A）。将听觉上皮的全埋片解剖为三段，并测量各段长度，最终转换为距耳蜗顶点的百分比距离。根据先前描述的方法5,6，利用对数函数计算每个耳蜗回旋在基底膜上的频率位置（
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讨论
自从耳蜗突触病首次在成年小鼠中被表征以来——这些小鼠暴露于100 dB SPL、持续2小时的8–16 kHz倍频程带宽噪声后出现暂时性听阈偏移（TTS）31，研究人员已越来越多地探究了突触病在包括猴子和人类在内的多种哺乳动物中的影响32,33。除了噪声暴露外，多种其他情况也与耳蜗突触病相关（例如衰老、耳毒性药物的使用以及基因突变），这些因素可导致阈上听力的短期障碍，随后引发听觉神经的不可逆退变。在耳蜗损伤的早期阶段，突触病常发生在特定频率区域，尤其是在内毛细胞（IHC）突触损伤局限于特定频率区域的实验模型中尤为明显24,31。因此，本实验方案的重要意义在于能够对特定频率区域的突触形态与功能进行研究。
耳蜗的部位-频率图可用于区分正常的和异常的听觉功能，进一步反映内耳中正常与异常的区域。自从首次采用铺片技.......
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本工作得到国家自然科学基金（81770997、81771016、81830030）；北京市自然科学基金与北京市教育委员会联合资助项目（KZ201810025040）；北京市自然科学基金（7174291）；以及中国博士后科学基金（2016M601067）的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 盐酸氯胺酮 | 福建古田药业有限公司 | H35020148 | 100 mg/kg |
| 盐酸赛拉嗪 | Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯 | X-1251 | 10 mg/kg |
| TDT生理记录装置 | Tucker-Davis Technologies，美国佛罗里达州阿拉楚阿 | 听觉生理系统III | |
| SigGen/BioSig软件 | Tucker-Davis Technologies，美国佛罗里达州阿拉楚阿 | 听觉生理系统III | |
| 电热垫 | Pet Fun | 11072931136 | |
| Dumont 3#镊子 | Fine Science Tools，加拿大不列颠哥伦比亚省北温哥华 | 0203-3-PO | |
| Dumont 5#镊子 | Fine Science Tools，加拿大不列颠哥伦比亚省北温哥华 | 0209-5-PO | |
| 体视解剖显微镜 | 尼康公司，日本东京 | SMZ1270 | |
| 山羊血清 | 中杉金桥生物技术有限公司，中国北京 | ZLI-9021 | |
| 抗谷氨酸受体2（细胞外域），克隆6C4 | Millipore公司，美国马萨诸塞州比勒里卡 | MAB397 | mouse |
| 纯化小鼠抗CtBP2抗体 | BD Biosciences，美国马萨诸塞州比勒里卡 | 612044 | mouse |
| Alexa Fluor 568 山羊抗小鼠IgG1抗体 | 赛默飞世尔科技公司，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆 | A21124 | 山羊 |
| Alexa Fluor 488 山羊抗小鼠IgG2a抗体 | 赛默飞世尔科技公司，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆 | A21131 | 山羊 |
| 含DAPI的封片剂 | 中杉金桥生物技术有限公司，中国北京 | ZLI-9557 | |
| 共聚焦荧光显微镜 | 徕卡显微系统公司，德国韦茨拉尔 | TCS SP8 II | |
| Image Pro Plus 软件 | Media Cybernetics，美国马里兰州贝塞斯达 | 版本 6.0 | |
| 专业诊断用便携式耳镜 | 上海路德医疗仪器贸易有限公司 | HS-OT10 | |
| 针电极 | 西安友谊医学电子有限公司 | 1029 | 20 mm，28 G |
| 闭场扬声器 | Tucker-Davis Technologies，美国佛罗里达州阿拉楚阿 | CF1 |
参考文献
- Lie, A., Skogstad, M., Johnsen, T. S., Engdahl, B., Tambs, K. The prevalence of notched audiograms in a cross-sectional study of 12,055 railway workers. Ear and Hearing. 36 (3), 86-92 (2015).
- Fettiplace, R. Hair cell transduc....
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重印与许可
