小鼠耳蜗特定频率区域带状带突起的形态和功能评估

Summary

本手稿描述了用于评估正常小鼠带状突触的形态特征和功能状态的实验协议。本模型也适用于噪声诱发和与年龄相关的耳蜗性突触性受限模型。讨论了以往小鼠研究的相关结果。

Abstract

耳蜗内毛细胞 (IHC) 通过带状突触将声学信号传输到螺旋型神经神经元 (SGNs)。几项实验研究表明,毛细胞突触可能是感觉神经性听力损失(SNHL)的初始靶点。这些研究提出了耳蜗"突触"的概念,它是指在色带突触数、结构或功能上发生改变,导致IHCs和SGN之间异常突触传播。虽然耳蜗性突触是不可逆的,但它不影响听力阈值。在噪声诱导的实验模型中,对特定频率区域的IHC突触的有限损伤被用来识别特别引起突触性的环境因素,以及干扰内耳的生理后果电路。在这里,我们提出了一个协议,用于分析耳蜗突触形态和功能在成年小鼠的特定频率区域。在此协议中,使用位置频率映射与耳蜗图一起执行特定频率区域的耳蜗定位,然后通过突触评估色带突触的形态特征免疫染色。然后根据听觉脑干响应 (ABR) 波 I 的振幅确定带状突触的功能状态。本报告表明,这种方法可用于加深我们对耳蜗突触功能障碍的发病机制和机制的理解,这可能有助于开发新的治疗干预措施。

Introduction

频率在大约 20μu201220,000 Hz 的范围内,人类可视为听觉刺激。人的听力通常最敏感,接近1,000赫兹,其中平均声压水平为20μPa在年轻人(即0分贝的声压水平[dB SPL])。在某些病理条件下,听力损失仅限于特定频率。例如,在噪声引起的听力损失 (NIHL) 的早期阶段,可在 4 kHz¹的音频图中观察到"切口"(即听力阈值高程)。沿着哺乳动物耳蜗分区,其刚度和质量的梯度产生一个指数频率图,在耳蜗底部进行高频声音检测,在尖^点2进行低频检测。事实上,有一个耳蜗位置频率图沿巴西拉膜,导致所谓的同位素组织2,3。在巴西拉膜上每个给定的位置对只有一个特定的声音频率具有最高的灵敏度,这通常称为特征频率3,4,尽管也可以观察到对其他频率的响应。

迄今为止,各种小鼠模型已被应用于研究听觉系统的正常功能、病理过程和疗效。准确了解小鼠耳蜗的生理参数是听力损失研究的先决条件。小鼠耳蜗在解剖学上分为锥形、中间和基底转弯,对应于不同的频率区域。通过在耳蜗核上标记听觉神经关联,以分析耳蜗中相应的周围内侧位点,Müller等人成功地在体内正常小鼠中建立了耳蜗位置频率图。在 7.2~61.8 kHz 的间隔内,对应于巴西拉膜全长 90% 到 10% 之间的位置,鼠标耳蜗位置频率图可以通过简单的线性回归函数来描述,这表明与耳蜗基的标准化距离和特征^频率5的对数。在实验鼠中,位置频率图可用于探索特定频率范围内的听觉阈值与显示沿巴西拉^膜6相对区域缺失毛细胞数量的耳蜗图之间的关系。重要的是,位置频率图提供了一个定位系统,用于调查最小的结构损伤,例如毛细胞在周围听觉创伤的特定耳蜗频率位置的带状突触^{损伤7 ,8}.

在哺乳动物耳蜗中,带状突触由先发前带、电子密集投影组成,在IHC内系上含有谷氨酸的释放就绪突触囊泡的光环,以及SGN神经端端的贴片密度谷氨酸受体9。在耳蜗声音转导过程中,发细胞束的偏转导致IHC去极化,导致谷氨酸释放从IHC释放到鼻后发泡端,从而激活听觉通路。此通路的激活导致声音诱导的机械信号在 SGN¹⁰中转换为速率代码。事实上,IHC 色带突触高度专业化,能够以数百赫兹的速度以高时间精度进行不知疲倦的声音传输,并且对于声音编码的预突触机制至关重要。先前的研究表明,在成年小鼠耳蜗11、12的不同频率区域,带状突触在大小和数量上差异很大,可能反映对特定声音编码的结构适应。生存需求。最近,实验动物研究表明,耳蜗突触导致多种形式的听力损伤,包括噪音引起的听力损失,年龄相关的听力损失,和遗传性听力损失13^14.因此,利用通过基因或环境变量15、16、17的实验操作。

在本报告中,我们提出了一个协议,用于分析成年小鼠巴西拉膜的特定频率区域的突触数、结构和功能。耳蜗频率定位使用给定的位置频率映射与耳蜗图结合执行。通过前突触和午睡免疫染色评估耳蜗带突触的正常形态特征。耳蜗带突触的功能状态是根据ABR波I的超阈值振幅确定的。通过细微的改动,此协议可用于检查其他动物模型(包括大鼠、豚鼠和老年病)的生理或病理状况。

Protocol

所有程序均按照《NRC/ILAR实验室动物护理和使用指南》(第8版)进行。研究规程经首都医科大学动物护理与使用委员会批准。

1. 动物选择

1. 对于所有实验,使用成年C57BL/6J雄性小鼠(8周大)作为动物模型。
   注:C57BL/6J 小鼠携带Cdh23的拼接变体,在听觉系统中表现出加速衰老,在耳蜗的基底转处表现为带状突触损失 40%,在 6 个月大时中间转时损失 10%,随后迅速增加这个损失在整个耳蜗与18,19岁。因此,我们建议谨慎使用超过6个月的C57BL/6J小鼠进行听觉研究。根据特定的实验目标,可以使用小鼠的其他菌株。
2. 在听力评估之前,使用专业的诊断口袋耳镜检查小鼠,以排除外耳或中耳疾病。潜在迹象可能包括外部听觉管中的液体或脓液、局部组织发红和肿胀以及鼓膜穿孔。
   注:虽然这种情况很少遇到,但一旦发现,患有外耳或中耳疾病的小鼠应排除在外。

2. 听力评估

1. 使用盐酸氯胺酮(100毫克/千克)和盐酸西兰津(10毫克/千克)混合物的腹内注射麻醉小鼠。通过痛苦的刺激(例如,脚趾捏反射)判断麻醉的深度。
   注:当脚趾捏反射完全不存在时,动物已经达到足够的麻醉深度,用于听觉测试。如果需要更多的时间进行双边ABR录音,请管理较低的麻醉剂剂量(原剂量的五分之一),以恢复原来的麻醉平面。小心避免麻醉过量,因为这可能导致小鼠死亡。
2. 使用热调节加热垫将麻醉动物的体温保持在37.5°C。将麻醉动物放在电气和隔音室中,以避免在整个听力测试中受到干扰。
   注:在整个过程中保持生理温度,直到动物完全清醒,以防止麻醉后体温过低导致死亡。
3. 将下皮针电极(20 mm,28 G)放置在头骨的顶点(记录电极)、测量耳(参考电极)下方的边面边形区域,以及相对侧视面区域(接地电极),深度为 3 mm在老鼠头的皮肤下,^分别20。
4. 使用闭场扬声器通过带锥形尖端的 2 厘米塑料管进行声学刺激。将尖端放入外耳道^{21 。}
   注:确保记录和参考电极中的电阻抗小于 3 k Ohm(通常为 1 kOhm)。如果阻抗高,请更改电极的插入位点,用酒精清洁电极,或更换电极以避免 ABR 波振幅发生变化。
5. 对于 ABR 录制,生成音调点(3 毫秒持续时间,1 ms 上升/下降时间,速率为 21.1/s,频率:4-48 kHz),并在 5\u201210 dB SPL 步 20^中将其从 90 dB 递减到 10 dB 。在此步骤中,响应被放大(10,000 次)、过滤(0.1~3 kHz)和平均值(1,024 个样本/刺激水平)。
   注:以 10 dB 步长收集每个刺激级别的 ADR,并在阈值附近增加 5 dB 步长。
6. 在每个频率下,确定 ABR 阈值,该阈值是指最小 SPL,从而产生可靠的 ABR 记录,具有一个或多个可分辨的波,可以通过目视检测清楚地识别(图 1)。
   注:通常需要在阈值附近重复低 SPL 的过程,以确保波形的一致性。响应阈值是可以观察到波形的最低刺激水平,当 5 dB 的减小将导致波形消失时。

3. 耳蜗组织处理

1. 在ABR记录后,通过宫颈脱位对麻醉小鼠实施安乐死,将其斩首,从腹侧露出公牛,用锋利的剪刀打开,以进入耳蜗。
2. 使用精细的钳子,取出时骨骼,切断带子动脉,从椭圆形窗口中取出胶带,并破裂圆形窗户膜。轻轻旋转针尖(13 mm,27 G),在耳蜗顶处打一个小孔。
3. 在 4°C 下用 0.1 M 磷酸缓冲盐水 (PBS, pH 7.4) 中固定 4%(wt/vol) 甲醛的分离骨骼。使用细尖移液器,通过应用到椭圆形或圆形窗户(作为入口)和顶点开口(作为出口),轻轻冲洗固定器。
   注:有些蛋白质需要较短的固定持续时间,以避免破坏其表位进行免疫标记。在这种情况下,根据制造商的免疫组织化学说明,在室温(RT)下在4%的甲醛中孵育骨骼2小时。修复也可通过心脏灌注来去除耳蜗血,避免后期因非特异性染色引起的背景噪音,特别是在耳蜗突触病的小鼠模型中。
4. 用0.1M冷PBS冲洗骨骼3次5分钟,以去除残留的甲醛。在 RT 下用 10% 乙烯二甲酸 (EDTA) 在 RT 处或 4 °C 在 24 小时下,在 20 rpm 的水平摇摇器中轻轻摇动,使骨骼分度为 24 小时。EDTA 可以中途刷新。
   注:分化时间取决于 EDTA 的集中度和用户的偏好。去衣组织应保持一定的韧性,这有利于在以后的步骤中操作孤立的耳蜗全支座。临时骨骼可在 10% EDTA 中经旋转进行去化,使研究人员可以在 ABR 测试和固定实验后离开实验室。在4°C下,脱钙时间是灵活的,在20至30小时范围内。
5. 将一个去分化时间骨从 EDTA 转移到 0.1 M PBS。使用#3,#5杜蒙特钳子和27G针依次解剖耳蜗、中耳蜗和基底耳蜗区域,然后在立体解剖显微镜下从骨中解剖耳蜗(如前^所述22)。使用剃刀刀片沿螺旋韧带进行一系列小切口,并去除膜膜和里斯纳膜(图2)。
   注:只要解剖的耳蜗完好无损,这个过程就可以根据单个操作员的通常协议进行修改。
6. 进一步解剖剩余的听觉上皮,包括螺旋边缘成单个耳蜗转(顶,中间,和基与钩区)为全安装准备。
7. 在光学显微镜的 40 倍油镜下,测量在目镜中放置 250 μm 刻度的巴西拉膜长度,该比例可沿 IMC 的立体膜进行调整。
8. 通过添加所有段长度(每个段 250 μm),计算每个耳蜗转弯的长度,同时通过对每个转弯的长度求和,获得罗勒膜的总长度。
9. 根据与耳蜗顶的距离(0% 指耳蜗顶,100% 与耳蜗基底)将罗勒膜的总长度(包括钩部区域)转换为百分比。
10. 使用对数函数 (d(%) = 1 - 156.5 = 82.5 = 对数 (f),将此距离转换为耳蜗特征频率,其斜率为 1.25 mm/倍频程,其中d是耳蜗顶的标准化距离(百分比),f is频率(以 kHz 为单位),如前所述 5,6 。因此,可以在每个耳蜗转动时获得罗勒膜相应区域的频率范围。

4. 免疫荧光染色

1. 解剖后,将每个耳蜗转在单独的2.5 mL离心管中,孵育耳蜗在10%山羊血清/PBS/0.1%Triton X-100中,在RT旋转器上1小时。
2. 在解剖显微镜下使用200μL移液器尖端从每个管子中取出上述阻滞/渗透溶液,并在旋转器上4°C处用5%山羊血清/PBS/0.1%Triton X-100稀释原抗体孵育标本。
   注:对于耳蜗突触带的免疫标记,使用前突触标记小鼠抗血碱基端结合蛋白 2 IgG1 (CtBP2,标记 RIBEYE 支架蛋白的 B 域,1:400) 和贴贴标记小鼠抗谷氨酸受体 2IgG2a (GluR2,标出AMPA受体的亚单位,1:200)²³。
3. 用0.1M冷PBS冲洗3次,以去除残留原抗体,并在RT的2\u20123 h的黑暗中,在黑暗中用旋转器在5%山羊血清/PBS/0.1%Triton X-100中稀释二级抗体,孵育标本。
   注:使用山羊抗小鼠 Alexa Fluor 568 (IgG1, 1:500) 和山羊抗小鼠 Alexa Fluor 488(IgG2a, 1:500)制备适当的二级抗体混合物,与步骤 4.2 中使用的初级抗体相辅相成。为了提高突触带的标记效率,我们建议选择特定的二级抗体。一些实验室延长孵育与二级抗体,以增加GluR2免疫^标签24。
4. 用 0.1 M PBS 冲洗 3 次 5 分钟,以去除残留的二次抗体,并将样品从 2.5 mL 离心管转移到含有 0.1 M PBS 的 35 mm 板中。
5. 将一滴含有 4',6-二酰胺-2-苯胺(DAPI)的安装介质放在滑轨上,并将试样从PBS转移到安装介质。将盖玻片的一条边缘放在滑轨上,然后松开,让盖玻片轻轻落下。
   注:为确保毛细胞朝上,并且在手术过程中不发生耳蜗标本的折叠或扭曲,请将耳蜗标本安装在立体解剖显微镜下。
6. 将幻灯片放在 4°C 的滑动盒中过夜,让幻灯片干燥,然后在激光共聚焦显微镜下进行图像。

5. 科利耳丝带突起的形态评价

1. 使用三个激光的共聚焦显微镜(一个 405 nm UV 二极管、一个 488 nm 的氧化铝激光器和一个 561 nm 二极管泵送固态 (DPSS) 激光来激发 DAPI(激励光谱 409–464 nm)、Alexa Fluor 488(激励光谱 496-549 nm)和 Alexa Fluor 568 的图像幻灯片(激励光谱 573~631 nm)。)。
2. 使用 63 倍高分辨率油浸透镜,从每个耳蜗转弯获得 8 μm 的距离内共聚焦 z 堆栈。
   注:一旦定义,所有用于数字化显微照片的参数都应保存并统一应用于所有幻灯片。
3. 对于突触双发计数,将 z 堆栈(0.3 μm 步长)设置为跨越 IMC 的整个长度,从而确保所有突触双发都可以成像。
4. 在 z 堆栈中合并包含 puncta 的图像以获取 z 轴投影,然后导入图像处理软件。
5. 将特定频率区域的每个 z 堆栈中的突触总数除以 IHC 数(等于 DAPI 核手册计数),以计算每个 IHC 的突触双发数。在每个特定频率区域,在包含 9-11 IHC 的不同显微场的三个图像中平均所有突触双发。
   1. 使用手绘按钮概述兴趣区域 (ROI),包括每个 IHC 的边面区域。使用测量函数自动量化双角,使用分水岭函数来区分紧密相邻的点。
   2. 每次自动计数后,使用手动修正执行目视检查,以确保双点计数可靠。
      注:实验者应该保持盲目,因为滑道是来自耳蜗的顶点、中间或基底转弯。
6. 通过铅笔工具 (M ) 直观地评估突触结构和分布,通过铅笔工具(M ) 手动从邻居中分离单个 IMC,以更好地可视化细胞骨骼结构和突触定位。
7. 要检查预突触色带 (CtBP2) 和贴后受体贴片 (GluR2) 的并列,通过矩形选取器工具提取色带周围的体素空间,并通过裁剪分离单个色带。通过单击"图像 > 图像大小",获取这些微型投影的缩略图数组,然后可用于识别配对突触(以紧密并列的 CtBP2 阳性和 GluR2 阳性双发)与孤儿带状(缺乏鼻后谷氨酸受体贴片) (图3)。
   注:正常耳蜗突触出现作为头发细胞(抗CtBP2)和听觉神经端(抗GluR2)上脱酸谷氨酸受体贴片内前突触带的组合免疫^标记。一些实验室使用共聚焦投影与3D建模相结合,以量化突触补丁大小或体积26,27。在丝带突触显著损失之前,丝带显示大小的变化或没有成对谷氨酸受体补丁可能是突触功能障碍27,28。

6. 科利耳丝带突起的功能评估

1. 收集在 90 dB 的 SPL 下显示的每个频率刺激的所有 ABR 波,以分析超阈值 ABR 波 I 振幅。
   注:神经生理学和形态学研究表明,低自发率、高阈值的纤维特别容易受到老化和噪音暴露^的影响。虽然丝带突触的简单损失不会影响ABR阈值,但它通常会导致ABR波I振幅的显著降低,因为这些亲和力包括低自发率、高阈值纤维和高自发率,低阈值纤维对耳蜗神经纤维的共和活动贡献很大,28、29、31。此处选择 90 dB SPL 的超阈值强度。
2. 使用离线分析程序确定峰值到峰值波 I 振幅 (图 4)。ABR 测试中的每个波 I 包括起始正 (p) 偏转和随后的负 (n) 偏转。ABR波I振幅定义为Ip(波I的正峰值)和In(波I的负^峰值)29之间的电压差。
   注:在病理条件下,耳蜗突触可以根据ABR波I的超阈值振幅来确定,该振幅反映了声音引起的SGN的共启动反应。然而,耳蜗敏感性不会因OHC功能障碍而受到损害,这是这种方法的先决条件。

Results

在麻醉下对10只C57BL/6J小鼠(8周大)进行了ABR听力测试。AVR在4、8、16、32和48 kHz下使用音调突发刺激引起。通过区分ABR中至少一个清晰的波形,可以直观地检测出每个动物的听觉阈值。所有小鼠都表现出ABR阈值,以响应音调爆裂,范围在25至70分贝SPL之间,取决于刺激的频率。我们的结果表明,听力阈值最低,为16 kHz(图1),相当于与耳蜗顶约43%的距离(图2),表明其他耳蜗的声学灵敏度显著降低地区。

在立体解剖显微镜下,从成年小鼠的骨骼中分离出科利耳全身骨(图2A)。听觉上皮的整个坐骑被分解成三块,其长度被测量,并最终转换为百分比距离耳蜗顶。如前所述5、6(图 2

Discussion

由于耳蜗突触病首先在成年小鼠中具有临时阈值偏移(TTS)的特征,由8\u201216 kHz八度频带噪声在100 dB SPL为2 h^31,研究人员已经越来越多地研究突触病在各种哺乳动物,包括猴子和人类32,33。除了噪音暴露,其他几个条件与耳蜗性突触病变(例如,老化,使用耳毒性药物和基因突变),导致超阈值试镜的短期中断,其次是不可逆转的听觉神经的退化。在耳蜗侮辱的早期阶段,突触病通常发生在特定的频率位置,特别是在实验模型中,对IHC突触的损害仅限于选择频率区域24,31。因此,我们的协议具有重要意义,因为它能够研究特定频率区域的突触形态和功能。

耳蜗位置频率图可用于区分正常和异常听觉功能,进一步反映内耳的正常和异常区域。由于表面处理技术首次用于绘制不同耳蜗轮中完整和缺失的毛细胞,耳蜗图已成为量化发细胞...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
盐酸氯胺酮	古田制药有限公司，中国福建	H35020148	100 mg/kg
盐酸甲苯噻嗪	Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易	X-1251	10 mg/kg
TDT 生理学仪	Tucker-Davis Technologies，美国佛罗里达州阿拉楚阿	觉生理学系统 III
SigGen/BioSig 软件	Tucker-Davis Technologies，阿拉楚阿，美国佛罗里达州	听觉生理学系统 III
电动垫	宠物乐趣	11072931136
杜蒙镊子 3#	精细科学工具，加拿大不列颠哥伦比亚省北温哥华	0203-3-PO
杜蒙镊子 5#	精细科学工具，加拿大不列颠哥伦比亚省北温哥华	0209-5-PO
立体解剖显微镜	尼康公司，日本东京	SMZ1270
山羊血清	ZSGB-BIO，中国北京	ZLI-9021
抗谷氨酸受体 2，细胞外，克隆 6C4	Millipore Corp.，美国马萨诸塞州比尔里卡	MAB397	小鼠
纯化小鼠抗 CtBP2	BD Biosciences，美国马萨诸塞州比尔里卡	612044	小鼠
Alexa Fluor 568 山羊抗小鼠 IgG1 抗体	Thermo Fisher Scientific Inc.，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆	A21124	山羊
Alexa Fluor 488 山羊抗小鼠 IgG2a 抗体	Thermo Fisher Scientific Inc.，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆	A21131	山羊
ZSGB-BIO	封固剂	ZLI-9557
共聚焦荧光显微镜	Leica Microsystems，Wetzlar，德国	TCS SP8 II
Image Pro Plus 软件	Media Cybernetics，美国马里兰州贝塞斯达	版本 6.0
专业诊断袖珍耳镜	路德医疗器械贸易有限公司，中国上海	HS-OT10
针电极	友谊医疗电子有限公司，中国习安	1029	20 mm，28 G
闭场演讲者	Tucker-Davis Technologies，美国佛罗里达州阿拉楚阿	CF1