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方法文章

小鼠耳蜗特定频率区域带状突触的形态学与功能评估

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DOI：

10.3791/59189

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2019年5月10日

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1Department of Otolaryngology-Head and Neck Surgery, Beijing Friendship Hospital, Capital Medical University, 2Department of Otology, Shengjing Hospital of China Medical University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本文描述了一种用于评估正常小鼠带状突触形态特征和功能状态的实验方案。该模型同样适用于噪声诱导和年龄相关性耳蜗突触病变受限模型。文中还讨论了以往小鼠研究的相关结果。

摘要

耳蜗内毛细胞（IHCs）通过带状突触将声学信号传递给螺旋神经节神经元（SGNs）。多项实验研究表明，毛细胞突触可能是感音神经性听力损失（SNHL）的最初作用靶点。这些研究提出了耳蜗"突触病变"的概念，指的是带状突触的数量、结构或功能发生改变，导致IHCs与SGNs之间的突触传递异常。尽管耳蜗突触病变不可逆，但它并不影响听力阈值。在噪声诱导的实验模型中，通过选择特定频率区域的IHC突触局限性损伤，可用于识别特异性引起突触病变的环境因素，以及干扰内耳回路所导致的生理后果。本文介绍了一种用于分析成年小鼠特定频率区域耳蜗突触形态与功能的实验方案。该方案中，结合位置-频率图谱与耳蜗图数据，实现特定频率区域在耳蜗中的定位，随后通过突触免疫染色评估带状突触的形态学特征。再根据听觉脑干反应（ABR）波I的振幅来确定带状突触的功能状态。本报告表明，该方法有助于深入理解耳蜗突触功能障碍的发病机制与作用机理，可能为新型治疗策略的开发提供支持。

引言

人类可感知的频率范围约为 20‒20,000 Hz，这些频率可被感知为听觉刺激。正常人耳对接近 1,000 Hz 的频率最为敏感，此时年轻人的平均声压级为 20 μPa（即 0 分贝声压级 [dB SPL]）。在某些病理状态下，听力损失可能仅局限于特定频率。例如，在噪声性听力损失（NIHL）的早期阶段，听力图在 4 kHz 处可观察到一个“切迹”（即听阈升高）1。在哺乳动物耳蜗的基底膜分区上，其刚度和质量的梯度变化形成了指数型的频率分布图，高频声音在耳蜗底部被检测，低频声音则在顶部被检测2。事实上，基底膜上存在一个耳蜗部位-频率对应关系图，由此形成了所谓的音调拓扑结构（tonotopic organization）2,3。基底膜上每一个特定位置仅对某一个特定频率的声音最敏感，这一频率通常被称为特征频率（characteristic frequency）3,4，尽管也可观察到对其他频率的响应。

迄今为止，已有多种小鼠模型被用于研究听觉系统的正常功能、病理过程及治疗效果。精确掌握小鼠耳蜗的生理参数是开展听力损失相关研究的前提。小鼠耳蜗在解剖结构上分为顶回、中回和底回，分别对应不同的频率区域。Müller 等人通过标记耳蜗核中的听觉神经传入纤维，分析其在外周耳蜗中的支配位点，成功在活体小鼠中建立了耳蜗部位-频率图谱5。在 7.2–61.8 kHz 的频率区间内，该范围对应基底膜全长的 90% 至 10% 位置，小鼠耳蜗的部位-频率关系可用一个简单的线性回归函数描述，表明从耳蜗底端起始的归一化距离与特征频率的对数之间存在关联5。在实验小鼠中，部位-频率图谱可用于探究特定频率范围内的听力阈值与耳蜗图（cochleograms）之间的关系，后者显示了基底膜不同区域缺失毛细胞的数量6。尤为重要的是，部位-频率图谱为研究微细结构损伤提供了定位系统，例如可用于分析外周听觉损伤小鼠在特定耳蜗频率区域毛细胞带状突触的损伤情况7,8。

在哺乳动物耳蜗中，带状突触由突触前带状结构和突触后密度组成。突触前带状结构是一种电子致密的突起，可锚定一圈位于内毛细胞（IHC）内、含有谷氨酸且处于释放准备状态的突触小泡；突触后密度则位于螺旋神经节神经元（SGN）的神经末梢，含有谷氨酸受体9。在耳蜗声音转导过程中，毛细胞束的偏转引起IHC去极化，导致谷氨酸从IHC释放到突触后传入神经末梢，从而激活听觉通路。该通路的激活使得声音引起的机械信号转化为SGN中的放电频率编码10。事实上，IHC带状突触高度特化，能够以数百赫兹的频率、以高时间精度持续不断地传递声音信号，在声音编码的突触前机制中具有关键作用。先前的研究表明，在成年小鼠耳蜗的不同频率区域，带状突触的大小和数量存在显著差异11,12，这可能反映了为满足生存所需的声音编码而发生的结构适应性变化。最近，动物实验研究证实，耳蜗突触病变可导致多种类型的听力障碍，包括噪声性听力损失、老年性听力损失和遗传性听力损失13,14。因此，在听觉发育和内耳疾病研究中，针对特定频率区域突触数量、结构和功能相关变化的检测方法正被 increasingly 广泛地应用于通过遗传或环境因素实验操控所建立的模型中15,16,17。

本报告中，我们介绍了一种用于分析成年小鼠基底膜特定频率区域突触数量、结构及功能的实验方案。通过结合已知的部位-频率图谱与耳蜗图谱，实现耳蜗频率定位。利用突触前和突触后免疫荧光染色评估耳蜗带状突触的正常形态学特征。根据听觉脑干反应波I的超阈值振幅来确定耳蜗带状突触的功能状态。经过少量修改后，该方案也可用于检测其他动物模型（包括大鼠、豚鼠和沙鼠）的生理或病理状态。

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方案

所有操作均依照美国国家研究委员会/实验动物照护与使用指南（第8版）进行。本研究方案已获中国北京首都医科大学机构动物照护与使用委员会批准。

1. 动物选择

  1. 所有实验均使用成年雄性 C57BL/6J 小鼠（8 周龄）作为动物模型。
    注意：携带 Cdh23 剪接变异体的 C57BL/6J 小鼠在听觉系统中表现出加速的衰老现象，表现为在 6 月龄时耳蜗基底回的带状突触损失 40%，中回损失 10%，随后随着年龄增长，整个耳蜗的突触损失迅速增加18,19。因此，建议在听觉研究中谨慎使用 6 月龄以上的 C57BL/6J 小鼠。根据具体的实验目的，也可选用其他品系的小鼠。
  2. 在进行听力评估前，使用专业的诊断用手持耳镜检查小鼠，以排除外耳或中耳病变。可能的体征包括外耳道内有液体或脓液、局部组织发红和肿胀，以及鼓膜穿孔。
    注意：尽管此类情况较为罕见，但一旦发现患有外耳或中耳疾病的小鼠，应予以剔除。

2. 听力评估

  1. 使用盐酸氯胺酮（100 mg/kg）和盐酸赛拉嗪（10 mg/kg）混合物进行腹腔注射，使小鼠麻醉。通过疼痛刺激（例如脚趾夹捏反射）判断麻醉深度。
    注意：当脚趾夹捏反射完全消失时，表明动物已达到听觉测试所需的适当麻醉深度。若双侧ABR记录所需时间较长，可追加原剂量五分之一的麻醉剂以维持原有麻醉水平。需注意避免麻醉过量，否则可能导致小鼠死亡。
  2. 使用温控加热垫将麻醉后小鼠的体温维持在37.5 °C。将麻醉小鼠置于电学和声学屏蔽的房间内，以避免听力测试过程中受到干扰。
    注意：在整个实验过程中直至动物完全苏醒前，均应维持其生理体温，以防止麻醉后低体温导致死亡。
  3. 将皮下针电极（20 mm，28 G）分别插入小鼠头部皮肤下方约3 mm深处：一个置于颅顶（记录电极），一个置于测量耳侧耳廓下方同侧腮腺区（参考电极），另一个置于对侧腮腺区（接地电极）20。
  4. 使用封闭场扬声器通过一根长度为2 cm、尖端呈锥形的塑料管进行声刺激，并将管尖插入外耳道21。
    注意：确保记录电极与参考电极的电学阻抗低于3 kOhm（通常为1 kOhm）。若阻抗过高，应更换电极插入位置，用酒精清洁电极，或更换新电极，以避免ABR波幅发生改变。
  5. 进行ABR记录时，生成短音刺激信号（持续时间3 ms，上升/下降时间各1 ms，刺激速率21.1次/秒，频率范围：4–48 kHz），并以5–10 dB SPL为步长，从90 dB逐步递减至10 dB进行呈现20。在此过程中，信号经放大（10,000倍）、滤波（0.1–3 kHz）和平均处理（每刺激强度采集1,024次样本）。
    注意：ABR反应按10 dB步长采集各刺激强度下的数据，在接近阈值时额外增加5 dB的细步长测试。
  6. 在每个频率下确定ABR阈值，即通过肉眼观察可清晰识别出一个或多个可分辨波形时所对应的最低声压级（SPL）（图1）。
    注意：通常需要在阈值附近的低声压级重复测试，以确认波形的一致性。反应阈值定义为仍能观察到波形的最低刺激强度，当刺激强度再降低5 dB时，波形即消失。

3. 耳蜗组织处理

  1. 完成ABR记录后，通过颈椎脱臼法处死麻醉的小鼠，进行断头操作，从腹侧暴露鼓室，并用锐利的剪刀打开以进入耳蜗。
  2. 使用精细镊子取出颞骨，切断镫骨动脉，从卵圆窗移除镫骨，并刺破圆窗膜。用针尖（13 mm，27 G）轻轻旋转，在耳蜗顶处打一个小孔。
  3. 将分离的骨骼在4%（wt/vol）多聚甲醛的0.1 M磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4）中于4 °C固定过夜。使用细尖移液器，通过卵圆窗或圆窗（作为入口）和顶孔（作为出口），将固定液轻柔地冲洗过前庭淋巴腔。
    注意：某些蛋白质需要较短的固定时间，以避免其抗原表位在免疫标记过程中被破坏。在此类情况下，根据免疫组织化学试剂盒说明书建议，可在室温（RT）下将骨骼在4%多聚甲醛中孵育2小时。也可通过心脏灌注进行固定，以清除耳蜗血液，避免后期出现非特异性染色导致的背景噪声，特别是在耳蜗突触病变小鼠模型中。
  4. 用0.1 M冷PBS清洗骨骼三次，每次5分钟，以去除残留的多聚甲醛。使用10%乙二胺四乙酸（EDTA）在室温下轻轻振荡4小时，或在4 °C下振荡24小时（水平摇床转速20 rpm）进行脱钙处理。EDTA溶液可在中途更换一次。
    注意：脱钙时间取决于EDTA浓度及操作者的偏好。脱钙后的组织应保持一定的韧性，以便于后续步骤中耳蜗整体封片的制备。颞骨可在10% EDTA中旋转脱钙，使研究人员在完成ABR测试和固定实验后可离开实验室。在4 °C条件下，脱钙时间可在20至30小时范围内灵活调整。
  5. 将一块脱钙后的颞骨从EDTA转移至0.1 M PBS中。使用#3、#5 Dumont镊子和27 G针头，在体视解剖显微镜下依次分离耳蜗的顶回、中回和底回区域，并将耳蜗从骨组织中完整解剖出来（如先前所述22）。沿螺旋韧带使用刀片进行一系列小切口，移除盖膜和前庭膜（图2）。
    注意：只要解剖出的耳蜗保持完整，此过程可根据操作者常规方案进行适当调整。
  6. 进一步将剩余的听觉上皮组织（包括螺旋缘）分离为独立的耳蜗回（顶回、中回和含钩区的底回），用于整体封片制备。
  7. 在光学显微镜40倍油镜下，使用置于目镜中的250 μm刻度尺测量基底膜长度，该刻度尺可沿内毛细胞静纤毛方向调整对齐。
  8. 通过累加各段长度（每段250 μm）计算每个耳蜗回的长度，同时通过加总各回长度获得基底膜的总长度。
  9. 将包含钩区在内的基底膜总长度转换为从耳蜗顶点起算的百分比距离（0%表示耳蜗顶点，100%表示耳蜗底端）。
  10. 利用对数函数将该距离转换为耳蜗特征频率（d(%) = 1 - 156.5 + 82.5 × log(f)，频率每倍频程对应斜率为1.25 mm，其中d为从耳蜗顶点起算的归一化百分距离，f为频率，单位为kHz），如先前所述5,6。由此可获得每个耳蜗回基底膜对应区域的频率范围。

4. 免疫荧光染色

  1. 解剖后，将每个耳蜗转置于单独的 2.5 mL 离心管中，并在室温下于旋转仪上用含 10% 山羊血清、PBS 和 0.1% Triton X-100 的溶液孵育 1 小时。
  2. 在解剖显微镜下，使用 200 μL 移液器吸头移除各管中的上述封闭/通透溶液，并在 4 °C 下于含 5% 山羊血清、PBS 和 0.1% Triton X-100 的溶液中加入一抗，于旋转仪上避光孵育过夜。
    注意：对耳蜗突触带进行免疫标记时，使用突触前标记物小鼠抗羧基末端结合蛋白 2 IgG1（CtBP2，标记 RIBEYE 支架蛋白的 B 结构域，1:400）和突触后标记物小鼠抗谷氨酸受体 2 IgG2a（GluR2，标记 AMPA 受体的一个亚基，1:200）23。
  3. 用 0.1 M 冷 PBS 洗涤三次，每次 5 分钟，以去除残留的一抗，然后在室温下于含 5% 山羊血清、PBS 和 0.1% Triton X-100 的溶液中加入二抗，在旋转仪上避光孵育 2‒3 小时。
    注意：使用山羊抗小鼠 Alexa Fluor 568（IgG1，1:500）和山羊抗小鼠 Alexa Fluor 488（IgG2a，1:500）配制适当的二抗混合液，这些二抗与步骤 4.2 中使用的一抗相匹配。为提高突触带标记效率，建议选择特异性二抗。部分实验室延长二抗孵育时间以增强 GluR2 免疫标记24。
  4. 用 0.1 M PBS 洗涤三次，每次 5 分钟，以去除残留的二抗，然后将样本从 2.5 mL 离心管转移至含有 0.1 M PBS 的 35 mm 培养皿中。
  5. 在载玻片上滴加含 4’,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）的封片剂，将样本从 PBS 中转移至封片剂中。将盖玻片的一边接触载玻片，然后缓慢释放，使盖玻片自然落下。
    注意：为确保毛细胞朝上，且在操作过程中耳蜗样本不发生折叠或扭曲，应在体视解剖显微镜下进行耳蜗样本的封片。
  6. 将载玻片放入染色缸盒中，于 4 °C 静置过夜，使样本干燥，随后在激光共聚焦显微镜下成像。

5. 耳蜗带状突触的形态学评估

  1. 使用共聚焦显微镜配合三种激光器进行切片成像：405 nm紫外二极管激光器、488 nm氩离子激光器和561 nm二极管泵浦固态（DPSS）激光器，分别用于激发DAPI（激发光谱409–464 nm）、Alexa Fluor 488（激发光谱496–549 nm）和Alexa Fluor 568（激发光谱573–631 nm）。
  2. 使用63倍高分辨率油浸物镜，对每个耳蜗转位在8 μm范围内采集共聚焦z轴层扫图像。
    ​注意：一旦确定，所有用于数字化显微图像的参数应保存，并统一应用于所有切片。
  3. 对于突触斑点计数，设置z轴层扫（步长0.3 μm）覆盖内毛细胞（IHCs）的全长，以确保所有突触斑点均可被成像。
  4. 将包含斑点的z轴层扫图像合并，获得z轴投影，并导入图像处理软件。
  5. 将每个z轴层扫在特定频率区域的突触总数除以IHC数量（等于DAPI核的手动计数），以计算每个IHC的突触斑点数量。在每个特定频率区域，对三个不同显微视野图像中包含的9–11个IHC的突触斑点数取平均值。
    1. 使用自由选择工具勾画感兴趣区域（ROIs），包括每个IHC的基底外侧区域。使用测量功能自动量化斑点数量，并使用分水岭功能区分紧密相邻的斑点。
    2. 每次自动计数后，进行视觉检查并手动校正，以确保突触斑点计数的可靠性。
      注意：实验操作者应保持盲态，即不清楚切片来自耳蜗的顶回、中回还是底回。
  6. 通过视觉评估突触结构与分布，使用铅笔工具（M） 手动将单个IHC从其邻近细胞中分离，以便更清晰地观察细胞骨架结构及突触定位。
  7. 为检查突触前致密体（CtBP2）与突触后受体斑块（GluR2）的相对位置关系，使用矩形选框工具提取围绕致密体的体素空间，并通过裁剪功能分离单个致密体。通过点击图像 > 图像大小，生成这些微型投影的缩略图阵列，可用于识别配对突触（表现为CtBP2阳性和GluR2阳性斑点紧密相邻成对出现）与孤立致密体（缺乏突触后谷氨酸受体斑块）（图3）。
    注意：正常耳蜗突触表现为毛细胞内突触前致密体（抗CtBP2）与听觉神经末梢上突触后谷氨酸受体斑块（抗GluR2）的共定位免疫标记25。一些实验室结合共聚焦投影与三维建模技术，用于量化突触斑块的大小或体积26,27。在突触致密体显著丢失之前，致密体大小改变或缺乏配对谷氨酸受体斑块的现象可能提示突触功能障碍27,28。

6. 耳蜗带状突触的功能评估

  1. 针对以 90 dB SPL 声压级呈现的每种频率刺激，采集所有 ABR 波形，用于分析超阈值 ABR 波 I 的振幅。
    注意：神经生理学和形态学研究表明，低自发放电率、高阈值的听觉神经纤维特别容易受到衰老和噪声暴露的影响29,30。尽管单纯突触带数量的减少不会影响 ABR 阈值，但通常会导致 ABR 波 I 振幅显著降低，因为这些传入纤维（包括低自发放电率、高阈值纤维以及高自发放电率、低阈值纤维）对耳蜗神经纤维的总和电活动贡献显著28,29,31。因此，本实验选择 90 dB SPL 的超阈值强度。
  2. 使用离线分析程序测定波 I 的峰-峰振幅（图 4）。ABR 测试中的每个波 I 由起始的正向（p）偏转和随后的负向（n）偏转组成。ABR 波 I 振幅定义为波 I 正峰（Ip）与负峰（In）之间的电压差值29。
    注意：在病理状态下，可根据 ABR 波 I 的超阈值振幅来判断耳蜗突触病，该振幅反映了由声音诱发的螺旋神经节神经元（SGN）的总和起始反应。然而，该方法的前提是耳蜗敏感性未因外毛细胞（OHC）功能障碍而受损。

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结果

对10只C57BL/6J小鼠（8周龄）在麻醉状态下进行了听觉脑干反应（ABR）听力测试。使用4、8、16、32和48 kHz的短音刺激诱发ABR。通过识别ABR中至少一个清晰的波形，视觉判断每只动物的听力阈值。所有小鼠均对短音刺激产生ABR阈值，其范围根据刺激频率不同介于25至70 dB SPL之间。我们的结果表明，听力阈值在16 kHz时最低（图1），对应于耳蜗顶点约43%的距离处（图2），提示其他耳蜗区域的声学敏感性显著降低。

在体视解剖显微镜下，从成年小鼠的颞骨中分离出耳蜗全埋片（图2A）。将听觉上皮的全埋片解剖为三段，并测量各段长度，最终转换为距耳蜗顶点的百分比距离。根据先前描述的方法5,6，利用对数函数计算每个耳蜗回旋在基底膜上的频率位置（

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讨论

自从耳蜗突触病首次在成年小鼠中被表征以来——这些小鼠暴露于100 dB SPL、持续2小时的8–16 kHz倍频程带宽噪声后出现暂时性听阈偏移（TTS）31，研究人员已越来越多地探究了突触病在包括猴子和人类在内的多种哺乳动物中的影响32,33。除了噪声暴露外，多种其他情况也与耳蜗突触病相关（例如衰老、耳毒性药物的使用以及基因突变），这些因素可导致阈上听力的短期障碍，随后引发听觉神经的不可逆退变。在耳蜗损伤的早期阶段，突触病常发生在特定频率区域，尤其是在内毛细胞（IHC）突触损伤局限于特定频率区域的实验模型中尤为明显24,31。因此，本实验方案的重要意义在于能够对特定频率区域的突触形态与功能进行研究。

耳蜗的部位-频率图可用于区分正常的和异常的听觉功能，进一步反映内耳中正常与异常的区域。自从首次采用铺片技...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

本工作得到国家自然科学基金（81770997、81771016、81830030）；北京市自然科学基金与北京市教育委员会联合资助项目（KZ201810025040）；北京市自然科学基金（7174291）；以及中国博士后科学基金（2016M601067）的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
盐酸氯胺酮福建古田药业有限公司H35020148100 mg/kg
盐酸赛拉嗪Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯X-125110 mg/kg
TDT生理记录装置Tucker-Davis Technologies，美国佛罗里达州阿拉楚阿听觉生理系统III
SigGen/BioSig软件Tucker-Davis Technologies，美国佛罗里达州阿拉楚阿听觉生理系统III
电热垫Pet Fun11072931136
Dumont 3#镊子Fine Science Tools，加拿大不列颠哥伦比亚省北温哥华0203-3-PO
Dumont 5#镊子Fine Science Tools，加拿大不列颠哥伦比亚省北温哥华0209-5-PO
体视解剖显微镜尼康公司，日本东京SMZ1270
山羊血清中杉金桥生物技术有限公司，中国北京ZLI-9021
抗谷氨酸受体2（细胞外域），克隆6C4Millipore公司，美国马萨诸塞州比勒里卡MAB397mouse 
纯化小鼠抗CtBP2抗体BD Biosciences，美国马萨诸塞州比勒里卡612044mouse 
Alexa Fluor 568 山羊抗小鼠IgG1抗体赛默飞世尔科技公司，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆A21124山羊
Alexa Fluor 488 山羊抗小鼠IgG2a抗体赛默飞世尔科技公司，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆A21131山羊
含DAPI的封片剂中杉金桥生物技术有限公司，中国北京ZLI-9557
共聚焦荧光显微镜徕卡显微系统公司，德国韦茨拉尔TCS SP8 II
Image Pro Plus 软件Media Cybernetics，美国马里兰州贝塞斯达版本 6.0
专业诊断用便携式耳镜上海路德医疗仪器贸易有限公司HS-OT10
针电极西安友谊医学电子有限公司102920 mm，28 G
闭场扬声器Tucker-Davis Technologies，美国佛罗里达州阿拉楚阿CF1

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