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使用基因激活型 CRISPR 过表达长链非编码 RNA

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DOI：

10.3791/59233

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2019年3月1日

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1Vatche and Tamar Manoukian Division of Digestive Diseases, Department of Medicine, University of California, Los Angeles, 2Vatche and Tamar Manoukian Division of Digestive Diseases, Integrated Molecular Technologies (IMT) Core, Department of Medicine, University of California, Los Angeles, 3Division of Hematology and Oncology, Department of Medicine, University of California, Los Angeles

本文内容

摘要

传统的基于cDNA的过表达技术由于长链非编码RNA具有多种可能具有功能的剪接形式，因此在过表达长链非编码RNA方面应用受限。本综述报道了一种利用CRISPR技术过表达长链非编码RNA多种剪接变体的实验方案。

摘要

长链非编码RNA（lncRNA）生物学是一个新兴且充满前景的研究领域，自2007年以来，该领域的出版物数量呈指数级增长。这些研究已证实，lncRNA在几乎所有疾病中均发生改变。然而，由于缺乏蛋白质产物、组织特异性表达、表达水平较低、剪接形式复杂以及在不同物种间缺乏保守性，研究lncRNA在疾病背景下的功能作用仍然十分困难。鉴于lncRNA具有物种特异性表达的特点，疾病过程中的lncRNA研究通常局限于人类研究体系。由于lncRNA在分子水平上发挥作用，解析其生物学功能的一种方法是去除lncRNA或过表达lncRNA，并检测细胞层面的影响。本文提供了一套图文并茂的体外过表达lncRNA的实验方案。作为代表性实验，本文展示了与炎症性肠病相关的长链非编码RNA——干扰素γ反义RNA 1（IFNG-AS1）在Jurkat T细胞模型中的过表达。为实现这一目标，采用激活型成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）技术，在内源性基因组位点上实现lncRNA的过表达。该激活型CRISPR技术可将一组转录因子靶向至基因的转录起始位点，从而有效驱动多种lncRNA剪接异构体的强效过表达。本实验流程分为三个步骤：（i）向导RNA（gRNA）设计与载体构建，（ii）病毒制备与转导，（iii）筛选过表达克隆。在本项代表性实验中，Jurkat T细胞中IFNG-AS1的表达水平提升了20倍以上。

引言

尽管大多数生物医学研究集中于蛋白质编码转录本，但实际上大多数转录的基因属于非编码RNA（Ensembl 93版本）。当前研究正开始探索这一领域，2007年至2017年间关于长链非编码RNA（lncRNA）在疾病过程中作用的出版物数量呈指数增长1。这些出版物表明，许多lncRNA与疾病相关。然而，由于lncRNA的功能比mRNA更为多样，其分子机制难以研究。此外，lncRNA通常表达水平低于编码RNA，这进一步加剧了理解其在疾病中作用的困难2。同时，lncRNA序列保守性较差，限制了基于人类细胞系的功能研究方法的应用3。研究这些新基因机制的一种方法是在培养细胞中内源性地过表达它们。过表达研究可提供有关特定基因功能的关键信息，并使研究人员能够解析关键的分子通路。

一种激活长链非编码RNA（lncRNA）基因转录的新方法基于最初由Gersbach实验室开发的CRISPR技术4。该方案已针对lncRNA生物学研究以及在其他模式系统中表达这些基因的应用进行了优化。在CRISPR过表达技术中，一种名为CRISPR相关蛋白9（Cas9）的蛋白质可通过一段与Cas9识别的反义向导RNA（gRNA）靶向特定DNA序列。通常情况下，Cas9会诱导DNA切割；然而，在过表达技术中所使用的Cas9突变体已失去这一功能5。当将转录激活因子与一种"失活"的Cas9（dCas9）融合，并将其导入细胞系时，可实现内源性lncRNA的过表达4,6。对gRNA进行额外修饰，使其能够结合更多的转录因子，可使dCas9基因激活系统的效率提高10倍7。重要的是，研究证明转录激活需要与转录起始位点非常接近（<200 bp），从而可在基因密集区域实现特异性上调7。与CRISPR基因敲除技术不同，dCas9和gRNA表达盒需要整合到基因组中，以确保细胞在多代传代过程中维持过表达状态。实现这一目标的一种方法是利用慢病毒将含有dCas9和gRNA的表达盒整合至基因组。整合完成后，即可检测lncRNA基因的表达水平。

本文将展示在Jurkat T细胞模型中进行lncRNA过表达的实验方案。文中提供了详细的分步操作流程，该流程也可适用于贴壁细胞。

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方案

注意：需要特别注意的是，本方案使用的是复制缺陷型慢病毒。仅可在接受适当的实验室安全培训后进行病毒操作。所有与活病毒接触过的物品和表面，均须用漂白剂处理至少10分钟。操作过程中必须始终穿戴一次性实验服，并佩戴面部/眼部防护装备以及双层手套。病毒相关操作必须在具备病毒认证的生物安全二级以上（BSL-2+）实验室中进行。应指定专用的组织培养超净台和培养箱用于病毒操作。

1. 载体设计 与 构建

注意： 识别 gRNA 序列的最佳方法是使用在线设计工具（例如 http://crispr-era.stanford.edu）（补充图 1：gRNA 设计）。在本示例实验中，gRNA 载体由一家公司设计并构建。dCas9 质粒也通过在线购买获得。

  1. gRNA序列位于核苷酸序列“NGG”上游，其中“N”为任意核苷酸，且该位置距离转录起始位点不超过100个碱基对。请通过BLAT等遗传数据库（https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat?command=start）检索gRNA序列，以确保基因组中无其他相似序列位点。补充图2：BLAT）。这将确保gRNA序列对目标基因（GOI）具有唯一性。
  2. 将作为细菌菌种提供的gRNA和dCas9质粒于4 °C保存。划线接种 大肠杆菌 在含氨苄青霉素的LB琼脂平板上补充表1并在37 °C下过夜培养细菌。
  3. 挑取单菌落，在5 mL含氨苄青霉素的LB培养基中培养细菌补充表 1在37 °C培养箱中剧烈振荡培养过夜。次日，将2 mL菌液加入含氨苄青霉素的200 mL LB培养基中，置于2 L摇瓶内，在37 °C培养箱中剧烈振荡培养过夜。
  4. 3,724 x g 离心细菌 g 孵育20分钟。移除培养基，将含有细菌的试管置于冰上。
  5. 使用质粒纯化试剂盒，按照制造商提供的方案纯化细菌DNA。
    注意：     质粒纯化试剂盒包含专有的重悬缓冲液、裂解缓冲液、洗涤缓冲液、平衡缓冲液和洗脱缓冲液。
    1. 向细菌中加入试剂盒提供的10 mL重悬缓冲液，用移液器将细菌转移至溶液中。然后，向重悬的细菌中加入试剂盒提供的10 mL裂解缓冲液，通过倒置离心管混合。静置5 min以裂解细菌；随后，向裂解后的细菌中加入试剂盒提供的10 mL冰浴中预冷的中和缓冲液，通过倒置离心管混合。
    2. 使用平衡缓冲液将试剂盒中的DNA柱平衡10 mL，孵育5分钟。将样品倒入DNA柱过滤器中，使溶液通过滤膜。
    3. 用30 mL洗涤缓冲液将样品洗涤2次，然后在15 mL圆底离心管中用30 mL洗脱缓冲液洗脱DNA。将10.5 mL室温异丙醇缓慢铺加到洗脱的DNA上，倒置离心管，立即在16,200 x g条件下离心 g 4 °C 下孵育 30 分钟。
    4. 移除上清液，向DNA沉淀中加入1 mL 70%乙醇。通过轻弹管壁使沉淀重悬。在16,200 x g 在4 °C下离心10分钟，用200 μL移液枪吸头吸出大部分乙醇。将沉淀在空气中干燥5分钟，然后重悬于200 μL水中，将DNA储存于-20 °C。预期浓度为 >1 μg/μL

2. 病毒的生成 与 颗粒计数

  1. 准备制备含 dCAS9 的慢病毒时，用 5 mL 0.01% 多聚赖氨酸（补充表 1）包被 100 mm 组织培养皿。彻底去除平板中多余的液体，并在生物安全柜中静置数分钟使其自然风干。
  2. 每皿加入 10 mL 完全杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）（补充表 1），接种 5 × 106 个 HEK 293T 细胞，于 37 °C、5% CO2 条件下培养过夜。次日，弃去 HEK 293T 培养皿中的培养基，每皿加入 10 mL 完全 DMEM。
  3. 取含有 gag/pol（病毒组分）的质粒 pMDLg/pRRE 6.5 μg、含有 VSV-G（病毒组分）的质粒 pMDG2.G 3.5 μg、含有 Rev（病毒组分）的质粒 pRSV-Rev 2.5 μg，以及含长末端重复序列（LTR）的 gRNA 载体或含 LTR 的 dCas9 载体 10 μg，加水至总体积为 450 μL。使用连接在注射器上的 0.2 μm 滤膜滤头过滤该混合物。
  4. 向每份 DNA 转染样品中加入 50 μL 2.5 M CaCl2（补充表 1），轻轻混匀。将钙-DNA 混合物通过连接在注射器上的 0.2 μm 滤膜滤头过滤。用移液器将 500 μL 2x HBS（补充表 1）加入 5 mL 聚苯乙烯管中。将 500 μL DNA/CaCl2 混合液逐滴加入其中，轻轻涡旋混匀。室温孵育 3 分钟。
  5. 将 1 mL DNA/CaCl2/HBS 悬液缓慢加入每皿中。立即轻轻旋转培养皿使液体均匀分布。将各培养皿置于 37 °C、5% CO2 培养箱中过夜孵育。
  6. 第 3 天，缓慢吸弃并丢弃各皿中的培养基。用磷酸盐缓冲液（PBS）小心洗涤细胞一次。每皿加入 6 mL 完全 DMEM，补充 20 mM HEPES 和 10 mM 丁酸钠。将细胞在 37 °C、5% CO2 培养箱中孵育 5–6 小时。
  7. 用 PBS 洗涤细胞一次，向 HEK 293T 细胞中加入 5 mL 含 20 mM HEPES 的完全 DMEM。在 37 °C、5% CO2 培养箱中孵育 12 小时过夜。
  8. 第 4 天，收集 HEK 293T 细胞的上清液并过滤上清。将 1 mL 分装样品于 -80 °C 冻存。
  9. 使用病毒前，将含病毒颗粒的条件培养基分装样品（按步骤 2.8 所述方式储存）置于冰上解冻。将所有试剂恢复至室温。
  10. 使用 p24 酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒定量每毫升中的病毒颗粒数量。
    1. 将试剂盒中的洗涤浓缩液用 19 份去离子蒸馏水稀释。使用 RMPI 1640 作为稀释液，将试剂盒中的阳性对照稀释至 200 ng/mL，并根据 p24 ELISA 稀释表（补充表 2）在 1.5 mL 离心管中配制标准曲线所需各稀释度样品。
    2. 除底物空白孔外，向所有孔中加入 20 μL 5% Triton X-100。向阴性对照孔中加入 200 μL RPMI 1640。向指定孔中加入各标准品（每个浓度设复孔），每孔 200 μL。
    3. 使用分光光度计，根据标准曲线测定样品中病毒的浓度。起始样品稀释比例为 1:1,000，必要时调整体积以确保结果落在标准曲线范围内。用 Triton X-100 将样品稀释至终浓度为 0.5%，每孔加入 200 μL 样品（溶于 RPMI 1640）至指定孔。密封酶标板，在 37 °C 孵育 2 小时。
    4. 每孔加入 300 μL 1x 洗涤缓冲液，洗板 6 次。将酶标板倒置并在纸巾上轻拍以去除多余液体。除底物空白孔外，向所有孔中加入 100 μL 试剂盒提供的检测抗体。密封酶标板，在 37 °C 孵育 1 小时。洗板后，再次将酶标板倒置并在纸巾上轻拍以去除多余液体。
    5. 为检测检测抗体，在使用前 15 分钟内配制链霉亲和素-辣根过氧化物酶（SA-HRP）。用 SA-HRP 稀释液将 SA-HRP 按 1:100 稀释。充分混匀稀释后的 SA-HRP，除空白孔外，每孔加入 100 μL。密封酶标板，在室温孵育 30 分钟。
    6. 用 1x 洗涤缓冲液洗板，并如步骤 2.10.4 所述轻拍去除多余液体。在配制后 15 分钟内使用邻苯二胺（OPD）底物溶液，该溶液为过氧化物酶提供产生化学发光所需的底物。每块酶标板使用一片 OPD 片剂溶于 11 mL 底物稀释液中。
    7. 剧烈涡旋 OPD 溶液使其完全溶解，并避光保存。向所有孔（包括空白孔）加入 100 μL OPD 底物溶液。立即使用分光光度计在 450 nm 波长处读取吸光度，每隔 1 秒重复读数 10 次，取平均值作为最终测定结果。

3. dCas9-VP64 转导

  1. 在T75培养瓶中，以每15 mL完全DMEM培养基含2 × 106 个细胞的密度培养Jurkat T细胞。将细胞置于37 °C、5% CO2的培养箱中培养。
  2. 以233 × g 离心5分钟沉淀细胞，然后将其重悬于10 mL低血清培养基中。使用血细胞计数板或自动细胞计数仪对细胞进行计数。
  3. 在T75培养瓶中，将1 × 106 个Jurkat细胞重悬并接种于5 mL含polybrene（补充表1）的低血清培养基中。加入含有1 × 106 个携带dCas9的病毒颗粒的HEK 293T条件培养基。病毒颗粒数量可通过p24 ELISA粗略计算，因为1 μg/mL p24相当于1 × 107 个病毒颗粒。将培养瓶置于37 °C、5% CO2的培养箱中培养。

4. 筛选 与 克隆构建

  1. 感染后三天，以233 x g离心细胞 g 5 分钟后，用含有嘌呤霉素的 10 mL 完全 DMEM 重悬细胞补充表1)。将细胞接种于T75培养瓶中，在37 °C、5% CO₂条件下培养2每三天一次，共9天，以233 x g 5 分钟后更换为含嘌呤霉素的完全 DMEM 培养基。
  2. 使用血细胞计数板或自动细胞计数仪对细胞进行计数。在经组织培养处理的96孔板中，于第一孔加入含嘌呤霉素的完全DMEM培养基100 μL，接种10,000个细胞，随后使用含嘌呤霉素的完全DMEM培养基对后续各孔内容物进行1:1连续稀释。每块板进行24次稀释，并重复4次，以确保每孔中含有足够数量的细胞。将细胞置于37 °C、5% CO₂条件下培养。2.
  3. 将克隆细胞扩增至两个24孔板，随后转入6孔板，最终转入T75培养瓶。为集中培养其中三个克隆，接种量为2 x 106 每孔接种6孔板中的三个克隆，每个孔接种适量细胞。另三个孔接种未转导的Jurkat细胞作为对照。将细胞放入细胞培养箱中孵育过夜。
  4. 用于RNA提取时，使用市售的RNA提取试剂盒。在233 x g下离心收集细胞。 g 室温孵育5分钟，弃去培养基。用1 mL移液器吸头将细胞重悬于350 μL裂解缓冲液中。向裂解后的细胞中加入350 μL 70%乙醇，用1 mL移液器充分混匀，然后将样品转移至RNA柱中。
  5. 将裂解液在10,000 x g 1分钟，弃去流出液，向柱中加入700 μL试剂盒中的低严谨性洗涤缓冲液。以10,000 x g 孵育1分钟，弃去流穿液，向柱中加入80 µL试剂盒中的DNase I溶液；室温孵育15分钟。
  6. 将裂解液在10,000 x g 1 分钟后，弃去流穿液，向柱中加入 700 µL 试剂盒中的高严谨性洗涤缓冲液。以 10,000 x g 孵育1分钟，弃去流穿液，向柱中加入700 µL低严谨性洗涤缓冲液。
  7. 将柱子从收集管中取出，转移至新的收集管中。以10,000 x g离心裂解液 g 1分钟，然后将RNA柱转移至1.5 mL离心管中。向柱中加入50 µL水，于10,000 x g 1 分钟。
  8. 使用分光光度计测定RNA浓度。预期浓度为100–500 ng/µL，A260/A280吸光度比值在1.9–2.1之间。将RNA于-80 °C保存。
  9. 在250 µL离心管中，加入1 µg RNA、4 µL互补DNA（cDNA）合成缓冲液、1 µL逆转录酶，加水至终体积为20 µL。设置不含逆转录酶的对照组。在PCR仪中，于42 °C孵育30分钟合成cDNA，再于95 °C孵育5分钟以灭活逆转录酶。合成完成后，加入60 µL水稀释cDNA。
  10. 配制聚合酶链式反应（PCR）体系，包含 5 µL SYBR Green、4 µL cDNA、0.5 µL 正向引物（10 µM）和 0.5 µL 反向引物（10 µM）。PCR 扩增程序如下：第一步 95 °C 预变性 3 分钟；第二步 95 °C 变性 10 秒；第三步 60 °C 退火 10 秒；然后重复第二步和第三步共 30 个循环。
    注意：dCas9 正向引物序列为 5'-TCGCCACAGCATAAAGAAGA，dCas9 反向引物序列为 5'-CTTTTCATGGTACGCCACCT。次黄嘌呤磷酸核糖转移酶 1（HPRT1）的正向引物序列为 5'-GACCAGTCAACAGGGGACAT，反向引物序列为 5'-GCTTGCGACCTTGACCATCT。

5. gRNA 转导、筛选、克隆构建与筛选

  1. 按照第3节所述，用含有gRNA的病毒对已验证的Jurkat-dCas9细胞进行再转导。在含潮霉素的DMEM培养基中（补充表1）筛选细胞10天。每3天离心细胞并更换培养基。
  2. 对细胞进行连续稀释（如步骤4.2所述），并扩增单个克隆（如步骤4.3所述）。按照步骤4.5中完全相同的方法从克隆中提取RNA，并按照步骤4.9所述进行cDNA合成。针对目的基因（GOI）和HPRT1或适当的看家基因进行实时PCR，操作类似于步骤4.10中所述的PCR，但在此情况下，每个循环在步骤3之后对孔板成像。
  3. 采用比较循环阈值（Ct）法确定目的基因（GOI）的倍数变化8。简言之，使用以下公式计算相对转录水平（RTL）：2-(目的基因平均Ct值 – 看家基因平均Ct值)。然后，计算对照组的平均RTL，并将所有RTL值除以对照组的平均RTL，从而得到相对于对照样本的倍数变化。

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结果

用于过表达lncRNA IFNG-AS1的双载体系统
本论文中的示例实验是在Jurkat T细胞模型系统中过表达lncRNA IFNG-AS19。IFNG-AS1是一种与炎症性肠病相关的lncRNA，已被发现可调控干扰素γ（Interferon Gamma）10。IFNG-AS1基因包含三种剪接变体，均使用相同的转录起始位点（图1A）。因此，选择距离转录起始位点10 bp和100 bp、且上游含有“NGG”序列的gRNA序列，以引导Cas9激活复合物至IFNG-AS1的转录位点（图1A）。采用双质粒系统分别将dCas9或gRNA/增强元件导入细胞，因为单个质粒因体积过大而难以有效生成病毒颗粒（图1B）。为了筛选双重转导的细胞，dCas9载体携带嘌呤霉素（ami...

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讨论

本文介绍了一种利用激活型CRISPR在体外过表达长链非编码RNA（lncRNA）的实验方案。该技术在研究长链非编码RNA时尤为重要，因为其转录产物本身就是功能单位。过表达后，研究人员可利用这些细胞提高研究结合伴侣时的信噪比，甚至可检测lncRNA水平升高所引发的细胞效应。此外，由于lncRNA常作用于顺式基因，这种内源性过表达技术使得相关生物学事件得以被研究11,12。

本文重点介绍了一种通用的gRNA构建、慢病毒制备、转导与筛选的实验方案，并概述了一个在外周血T细胞系中过表达lncRNA的代表性实例。此外，该技术已成功应用于骨髓来源的免疫细胞13、神经元7、小鼠胚胎干细胞14以及肾上皮细胞4。尽管本方案通常适用于大多数细胞系，但对于难以转导的细胞，可能需要优化各自病毒滴度以提...

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披露

作者无任何利益冲突披露。

致谢

C.P. 由 RO1 DK60729 和 P30 DK 41301-26 资助。D.P. 获得克罗恩病与结肠炎基金会（Crohn's & Colitis Foundation, CCFA）职业发展奖、CURE：消化系统疾病研究中心（DDRC）DK41301 以及加州大学洛杉矶分校临床与转化科学研究所（CTSI）UL1TR0001881 的支持。加州大学洛杉矶分校病毒学核心实验室由艾滋病研究中心（CFAR）资助项目 5P30 AI028697 提供经费。加州大学洛杉矶分校整合分子技术核心实验室由 CURE/P30 资助项目 DK041301 支持。本工作还得到了加州大学洛杉矶分校艾滋病研究所的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
氨苄青霉素Fisher ScientificBP1760-5
CaCl2Sigma AldrichC1016
cDNA合成试剂盒（iScript）BioRad1708891
dCas9正向引物Integrated DNA Technologiesn/a5'-TCGCCACAGCATAAAGAAGA 
dCas9反向引物Integrated DNA Technologiesn/a5'-CTTTTCATGGTACGCCACCT
dCas9载体Addgene50918
DMEMCorning10013CM
乙醇Acros Organics61509-0010
FBSSigma AldrichF2442
gRNA质粒VectorBuilderVB180119-1195qxv
HEK293T细胞ATCC CRL-1573
HEPESSigma AldrichH3375
HPRT1正向引物Integrated DNA Technologiesn/aGACCAGTCAACAGGGGACAT 
HPRT1反向引物Integrated DNA Technologiesn/aGCTTGCGACCTTGACCATCT
潮霉素BCorningMT3024CR
异丙醇Fisher ScientificBP2618-500
Jurkat细胞ATCC TIB-152克隆E6-1
L-谷氨酰胺Corning25005Cl
LB琼脂Fisher ScientificBP1425-500
LB肉汤Fisher ScientificBP1426-2
质粒大提试剂盒（质粒纯化试剂盒）Qiagen12362
Na2HPO4Sigma AldrichNIST2186II
OptiMem I低血清培养基 Gibco31985070
p24 ELISAPerkin ElmerNEK050B
PBSCorning21-040-CMR
青霉素和链霉素Corning30-002-Cl
pMDG2.GAddgene  #12259
pMDLg/pRREAddgene #60488
聚-L-赖氨酸Sigma AldrichP-4832
PolybreneEMD MilliporeTR-1003
pRSV-REVAddgene#12253
嘌呤霉素二盐酸盐Sigma AldrichP8833
RNA纯化试剂盒（Aurum RNA mini）BioRad7326820
丁酸钠Sigma AldrichB5887
SYBR Green（iTaq universal）BioRad1725122
Triton X-100Sigma AldrichX100

参考文献

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CRISPR RNA PCR IFNG AS1 Jurkat T dCas9 RNA

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