使用基因激活型 CRISPR 过表达长链非编码 RNA

摘要

传统的基于cDNA的过表达技术由于长链非编码RNA具有多种可能具有功能的剪接形式，因此在过表达长链非编码RNA方面应用受限。本综述报道了一种利用CRISPR技术过表达长链非编码RNA多种剪接变体的实验方案。

摘要

长链非编码RNA（lncRNA）生物学是一个新兴且充满前景的研究领域，自2007年以来，该领域的出版物数量呈指数级增长。这些研究已证实，lncRNA在几乎所有疾病中均发生改变。然而，由于缺乏蛋白质产物、组织特异性表达、表达水平较低、剪接形式复杂以及在不同物种间缺乏保守性，研究lncRNA在疾病背景下的功能作用仍然十分困难。鉴于lncRNA具有物种特异性表达的特点，疾病过程中的lncRNA研究通常局限于人类研究体系。由于lncRNA在分子水平上发挥作用，解析其生物学功能的一种方法是去除lncRNA或过表达lncRNA，并检测细胞层面的影响。本文提供了一套图文并茂的体外过表达lncRNA的实验方案。作为代表性实验，本文展示了与炎症性肠病相关的长链非编码RNA——干扰素γ反义RNA 1（IFNG-AS1）在Jurkat T细胞模型中的过表达。为实现这一目标，采用激活型成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）技术，在内源性基因组位点上实现lncRNA的过表达。该激活型CRISPR技术可将一组转录因子靶向至基因的转录起始位点，从而有效驱动多种lncRNA剪接异构体的强效过表达。本实验流程分为三个步骤：（i）向导RNA（gRNA）设计与载体构建，（ii）病毒制备与转导，（iii）筛选过表达克隆。在本项代表性实验中，Jurkat T细胞中IFNG-AS1的表达水平提升了20倍以上。

引言

尽管大多数生物医学研究集中于蛋白质编码转录本，但实际上大多数转录的基因属于非编码RNA（Ensembl 93版本）。当前研究正开始探索这一领域，2007年至2017年间关于长链非编码RNA（lncRNA）在疾病过程中作用的出版物数量呈指数增长¹。这些出版物表明，许多lncRNA与疾病相关。然而，由于lncRNA的功能比mRNA更为多样，其分子机制难以研究。此外，lncRNA通常表达水平低于编码RNA，这进一步加剧了理解其在疾病中作用的困难²。同时，lncRNA序列保守性较差，限制了基于人类细胞系的功能研究方法的应用³。研究这些新基因机制的一种方法是在培养细胞中内源性地过表达它们。过表达研究可提供有关特定基因功能的关键信息，并使研究人员能够解析关键的分子通路。

一种激活长链非编码RNA（lncRNA）基因转录的新方法基于最初由Gersbach实验室开发的CRISPR技术⁴。该方案已针对lncRNA生物学研究以及在其他模式系统中表达这些基因的应用进行了优化。在CRISPR过表达技术中，一种名为CRISPR相关蛋白9（Cas9）的蛋白质可通过一段与Cas9识别的反义向导RNA（gRNA）靶向特定DNA序列。通常情况下，Cas9会诱导DNA切割；然而，在过表达技术中所使用的Cas9突变体已失去这....

方案

注意：需要特别注意的是，本方案使用的是复制缺陷型慢病毒。仅可在接受适当的实验室安全培训后进行病毒操作。所有与活病毒接触过的物品和表面，均须用漂白剂处理至少10分钟。操作过程中必须始终穿戴一次性实验服，并佩戴面部/眼部防护装备以及双层手套。病毒相关操作必须在具备病毒认证的生物安全二级以上（BSL-2+）实验室中进行。应指定专用的组织培养超净台和培养箱用于病毒操作。

1. 载体设计 与 构建

注意： 识别 gRNA 序列的最佳方法是使用在线设计工具（例如 http://crispr-era.stanford.edu）（补充图 1：gRNA 设计）。在本示例实验中，gRNA 载体由一家公司设计并构建。dCas9 质粒也通过在线购买获得。

1. gRNA序列位于核苷酸序列“NGG”上游，其中“N”为任意核苷酸，且该位置距离转录起始位点不超过100个碱基对。请通过BLAT等遗传数据库（https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat?command=start）检索gRNA序列，以确保基因组中无其他相似序列位点。补充图2：BLAT）。这将确保gRNA序列对目标....

结果

用于过表达lncRNA IFNG-AS1的双载体系统
本论文中的示例实验是在Jurkat T细胞模型系统中过表达lncRNA IFNG-AS1⁹。IFNG-AS1是一种与炎症性肠病相关的lncRNA，已被发现可调控干扰素γ（Interferon Gamma）¹⁰。IFNG-AS1基因包含三种剪接变体，均使用相同的转录起始位点（图1A）。因此，选择距离转录起始位点10 bp和100 bp、且上游含有“NGG”序列的gRNA序列，以引导Cas9激活复合物至IFNG-AS1的转录位点（图1A）。采用双质粒系统分别将dCas9或gRNA/增强元件导入细胞，因为单个质粒因体积过大而难以有效生成病毒颗粒（图1B）。为了筛选双重转导的细胞，dCas9载体携带嘌呤霉素（ami.......

讨论

本文介绍了一种利用激活型CRISPR在体外过表达长链非编码RNA（lncRNA）的实验方案。该技术在研究长链非编码RNA时尤为重要，因为其转录产物本身就是功能单位。过表达后，研究人员可利用这些细胞提高研究结合伴侣时的信噪比，甚至可检测lncRNA水平升高所引发的细胞效应。此外，由于lncRNA常作用于顺式基因，这种内源性过表达技术使得相关生物学事件得以被研究^11,12。

本文重点介绍了一种通用的gRNA构建、慢病毒制备、转导与筛选的实验方案，并概述了一个在外周血T细胞系中过表达lncRNA的代表性实例。此外，该技术已成功应用于骨髓来源的免疫细胞¹³、神经元⁷、小鼠胚胎干细胞¹⁴以及肾上皮细胞⁴。尽管本方案通常适用于大多数细胞系，但对于难以转导的细胞，可能需要优化各自病毒滴度以提.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
氨苄青霉素	Fisher Scientific	BP1760-5
CaCl2	Sigma Aldrich	C1016
cDNA合成试剂盒（iScript）	BioRad	1708891
dCas9正向引物	Integrated DNA Technologies	n/a	5'-TCGCCACAGCATAAAGAAGA
dCas9反向引物	Integrated DNA Technologies	n/a	5'-CTTTTCATGGTACGCCACCT
dCas9载体	Addgene	50918
DMEM	Corning	10013CM
乙醇	Acros Organics	61509-0010
FBS	Sigma Aldrich	F2442
gRNA质粒	VectorBuilder	VB180119-1195qxv
HEK293T细胞	ATCC	CRL-1573
HEPES	Sigma Aldrich	H3375
HPRT1正向引物	Integrated DNA Technologies	n/a	GACCAGTCAACAGGGGACAT
HPRT1反向引物	Integrated DNA Technologies	n/a	GCTTGCGACCTTGACCATCT
潮霉素B	Corning	MT3024CR
异丙醇	Fisher Scientific	BP2618-500
Jurkat细胞	ATCC	TIB-152	克隆E6-1
L-谷氨酰胺	Corning	25005Cl
LB琼脂	Fisher Scientific	BP1425-500
LB肉汤	Fisher Scientific	BP1426-2
质粒大提试剂盒（质粒纯化试剂盒）	Qiagen	12362
Na2HPO4	Sigma Aldrich	NIST2186II
OptiMem I低血清培养基	Gibco	31985070
p24 ELISA	Perkin Elmer	NEK050B
PBS	Corning	21-040-CMR
青霉素和链霉素	Corning	30-002-Cl
pMDG2.G	Addgene	#12259
pMDLg/pRRE	Addgene	#60488
聚-L-赖氨酸	Sigma Aldrich	P-4832
Polybrene	EMD Millipore	TR-1003
pRSV-REV	Addgene	#12253
嘌呤霉素二盐酸盐	Sigma Aldrich	P8833
RNA纯化试剂盒（Aurum RNA mini）	BioRad	7326820
丁酸钠	Sigma Aldrich	B5887
SYBR Green（iTaq universal）	BioRad	1725122
Triton X-100	Sigma Aldrich	X100