使用基因激活 crispr 过度表达长非编码 rna

摘要

传统的基于 cdna 的过度表达技术由于具有潜在功能的多个拼接形式, 对长非编码 rna 的过度表达的适用性有限。本综述报告了一个协议使用 crispr 技术超细的多个拼接变体的长非编码 rna。

摘要

长非编码 rna (lncrna) 生物学是一个新的和令人兴奋的研究领域, 自2007年以来, 来自该领域的出版物数量呈指数级增长。这些研究证实, 几乎所有疾病的情况都发生了变化。然而, 由于缺乏蛋白质产品、组织特异性表达、表达水平低、拼接形式复杂、物种之间缺乏保护, 研究环境中的环境中的环境中的环境中的环境中的环境中的神经网络的功能作用仍然困难。鉴于物种特异性表达, 在研究疾病过程时, 英克拉研究往往仅限于人类的研究背景。由于 ncrna 在分子水平上发挥作用, 因此解剖而不是去除而不是过度表达而不是超表达而不是超表达而不是超表达而不是多表达的。本文提出了一种在体外超表达英 r a 的书面可视化协议。作为一个有代表性的实验, 与炎症性肠病相关的英卡纳, 干扰素伽玛反义 1 (ifng-as1), 在 jurkat t 细胞模型中被证明是过度表达。为了实现这一目标, 激活聚集定期间隔的短回文重复 (crispr) 技术被用来使内源基因组位点过度表达。激活 crispr 技术的目标是一组转录因子到一个基因的转录起始位点, 使多个 incrna 拼接形式的强大过度表达。这一程序将分为三个步骤, 即 (i) 指导 rna (grna) 设计和载体构建, (ii) 病毒生成和转导, (iii) 菌落筛查过度表达。在这一具有代表性的实验中, jurkat t 细胞的 ifng-as1 增强了20倍以上。

引言

虽然大多数生物医学研究都集中在蛋白质编码转录记录上, 但大多数转录基因实际上是由非编码 rna (ensembl 发布 93) 组成的。目前的研究开始探索这一领域, 2007年至2017年期间, 关于疾病过程中的 inrna 的出版物数量呈指数级增长¹。这些出版物表明, 许多 inrna 与疾病有关。然而, 与 mrna 相比, 这些神经网络的分子机制由于其功能不同而难以研究。使理解信息素的作用的问题更加复杂, 而英特罗 a 的表达水平往往低于编码 rna²。此外, 英特拉 a 的保守程度很低, 这限制了基于人的技术的功能研究³。研究这些新基因机制的一种方法是在培养的细胞中内源过度表达它们。过度表达研究可以提供有关特定基因功能的关键信息, 并使研究人员能够剖析关键的分子途径。

一种激活 lncRNA 基因转录的新方法是基于 gersbach 实验室^最初开发的 crispr 技术。该协议已被改编用于英卡纳生物学和这些基因在其他模型系统中的表达。在 crispr 过度表达技术中, 一种名为 crispr 相关蛋白 9 (cas9) 的蛋白质可以通过 cas9 识别的反义 grna 指向 dna 序列。通常情况下, cas9 会诱导 dna 裂解;然而, 以前为过度表达技术开发的 cas9 中的突变会停用这一步骤⁵。当转录激活剂融合到 "死" cas9 (dcas9) 并转化为细胞系时, 就能实现 ncrna 的内源性过度表达 4^,6。添加了对 grna 的额外修饰, 使额外的转录因子与 grna 结合, 提高了 dcas9 基因激活系统的疗效 10倍^7倍。重要的是, 它表明, 转录激活需要接近 (和 lt;200 bp) 转录起始位基因, 使一个特定的隆起地区⁷。与 crispr 淘汰赛技术不同, dcas9 和 grna 盒式磁带需要集成到基因组中, 以允许细胞在多代人的多代中保持过度表达。实现这一目标的一种方法是使用慢病毒集成含有 dcas9 和 grna 的盒式磁带。整合后, 可以确定英克斯拉基因的表达。

在本文中, 将演示一种在 jurkat t 细胞模型中过度表达的协议。一个循序渐进的过程显示, 也可以适应粘附细胞。

方案

请注意:需要注意的是, 该协议使用复制缺陷的慢病毒。只有在经过适当的实验室安全培训后, 才进行病毒处理。处理后, 将所有接触活体病毒的物品和表面漂白至少10分钟。在任何时候都要使用一次性的实验室外套和面部保护, 以及双手套。在具有病毒认证的生物安全 2 + 级实验室中执行病毒工作。专门的组织培养罩和孵化器的病毒工作。

1. 矢量设计与生成

请注意:识别 grna 序列的最佳方法是使用在线设计工具 (例如, http://crispr-era.stanford.edu) (补充图1:grna 设计)。为了伴随而来的代表性实验, 一家公司设计并创建了具有代表性的实验中使用的 grna 载体。dcas9 质粒也是在网上购买的。

1. grna 序列位于核苷酸序列 "ngg" 的上游, 其中 "n" 是任何核苷酸, 也在转录起始位点的100基对之内。搜索基因数据库 (如 blat (https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat？command=start)) 的 grna 序列, 以确保基因组中没有具有类似序列的其他位点 (补充图 2: blat)。这将确保 grna 序列是感兴趣的基因 (goi) 所独有的。
2. 将作为细菌存根的 grna 和 dcas9 质粒保存在4°c。用氨匹西林 (补充表 1) 在尿液 (lb) 琼脂板上流出大肠杆菌, 并在37°c 下连夜生长细菌。
3. 选择一个菌落, 用氨匹西林 (补充表 1) 在5毫升的 lb 中种植细菌, 在37°c 的孵化器中大力晃动盘子。第二天, 用氨基青霉素在2l 瓶中生长, 在200毫升的 lb 中加入2毫升细菌, 在37°c 的孵化器中大力晃动烧瓶。
4. 将细菌向下旋转, 以 3 724 x g 20分钟. 取出培养基, 将含有细菌的管放在冰上。
5. 根据制造商的协议, 使用质粒纯化试剂盒纯化细菌 dna。
   注:质粒净化试剂盒包含专有的再悬浮液、裂解缓冲液、洗涤缓冲液、平衡缓冲液和洗脱缓冲液。
   1. 将试剂盒中的10毫升再悬浮液加入细菌, 并将细菌输送到溶液中。然后, 从试剂盒中加入10毫升的裂解缓冲液, 加入再悬浮的细菌, 并通过倒置管将其混合。等待 5分钟, 将细菌裂解;然后, 从试剂盒中加入10毫升的冰凉中和缓冲液, 加入裂解的细菌, 并通过倒置管将其混合。
   2. 用10毫升平衡缓冲液平衡试剂盒中的 dna 柱平衡 5分钟, 将样品放入 dna 柱过滤器中, 让溶液通过过滤器。
   3. 用30毫升的洗涤缓冲液清洗样品 2x, 然后用30毫升洗脱缓冲液在15毫升锥形管中洗脱 dna。在室温下将异丙醇慢慢分层 10.5 ml 到洗脱的 dna 上, 倒置管, 并在4°c 下立即以 16, 200 x g的速度将其旋转30分钟。
   4. 去除上清液, 在 dna 颗粒中加入70% 乙醇1毫升。通过轻弹管子重新弹颗粒。在4°c 下, 以 16 , 200 x 克旋转 10分钟, 并使用200μl 管尖去除大部分乙醇。将颗粒风干 5分钟, 在200μl 的水中重新悬浮, 并将 dna 储存在-20°c。预期浓度为 & gt;1 μgμμl。

2. 病毒生成和粒子计数

1. 当准备创建含有 dcas9 的慢病毒时, 用0.01% 的多-l-赖氨酸5毫升覆盖100毫米组织培养皿(补充表 1)。从盘子里彻底取出多余的液体, 让它们在生物安全柜里风干几分钟。
2. 板 5 x 10 6 hek 293t^细胞每盘在10毫升的完整 dulbecco 的修改鹰的介质 (dmem) (补充表 1) 和孵育他们在37°c 与 5% co2.第二天, 从 hek 293t 菜机中取出培养基, 加入10毫升的完整 dmem。
3. 混合含有 gag/pol (病毒成分) 的6.5 微克质粒 pMDLg/pRRE, 含有 vsv-g (病毒的一个组成部分) 的质粒 pmdg2. g 的3.5 微克, 含有 rev (病毒的一个组成部分) 的质粒的 2.5μv-rev, 10 微克长端重复 (含 ltr) 载体或含有 ltr 的 dcas9 载体, 并将水添加到总计450μl。通过连接到注射器上的0.2μm 过滤器尖端对混合物进行过滤。
4. 在每个 dna 转染样本中加入50μl 的 2.5 m cacl 2 (补充表 1), 然后轻轻混合. 通过连接在注射器上的0.2μm 过滤头过滤钙/dna 混合物。将 2x hbs 的500微米升 (补充表 1) 放入5毫升聚苯乙烯管中。加入 500μl DNA/CaCl₂ , 滴向, 轻轻旋涡。在室温下孵化3分钟。
5. 慢慢地在每道菜中加入1毫升的 dnacl₂/hbs 悬浮液。立即旋涡的菜肴, 以均匀地分配的内容。在37°c 的 5% co2 孵化器中孵育每道菜一夜。
6. 第3天, 慢慢取出并丢弃盘子中的介质。用磷酸盐缓冲盐水 (pbs) 仔细清洗细胞1x。加入6毫升的全 dmem, 辅以 20 mm hepes 和 10 mm 丁酸钠。在37°c 的 5% co2 孵化器中孵育细胞 5-6小时.
7. 用 pbs 清洗细胞 1x, 并在 hek 293t 细胞中加入5毫升的完整 dmem 和 20 mm hepes。在37°c 的 5% co2 孵化器中孵育 12小时 。
8. 第4天, 收集 hek 293t 细胞上清液, 并对上清液进行过滤。在-80°c 时冻结1毫升的。
9. 当准备使用病毒时, 在冰上解冻含有条件介质的病毒颗粒的一个 (如步骤2.8 所述)。将所有试剂带到室温下。
10. 使用 p24 酶联免疫吸附检测 (elisa) 试剂盒来量化每毫升的病毒颗粒数量。
    1. 加入19部分蒸馏水, 稀释试剂盒中的洗涤精矿。使用 rmpi 1640 作为稀释剂, 将阳性控制从试剂盒稀释到 200 ngml, 并根据 p24 elisa 稀释表 (补充表 2) 在 1.5 ml 管中对标准曲线进行稀释。
    2. 在除基板空白以外的所有油井中加入20μl 的 5% triton x-100。在负控制井中加入 200μl rpmi 1640。在指定的井中添加每个标准的 200μl (一式两份)。
    3. 使用分光光度计, 使用标准曲线测量样品中的病毒浓度。在1:1000 处开始样品稀释, 并根据需要修改体积, 以便在标准曲线的范围内。用 triton x-100 稀释样品, 最终浓度为 0.5%, 并将 rpmi 1640 中每个样品的200μl 添加到指定的油井中。在37°c 条件下密封盘子并孵育2小时。
    4. 用每口 1 x 的300μl 清洗板6x。通过倒转盘子并在纸巾上敲击来去除多余的液体。从试剂盒中添加100μl 的抗体, 加入除基板空白以外的所有油井。将盘子密封, 在37°c 下孵育1小时。清洗盘子, 然后通过倒转盘子并用纸巾敲击来清除多余的液体。
    5. 为了测定检测物抗体, 在使用15分钟内制备链球菌过氧化物酶 (sa-hrp)。用 sa-hrp 稀释剂在1:100 稀释 sa-hrp。将稀释后的 sa-hrp 充分混合, 在除空白外的所有井中加入100μl。在室温下密封并孵育板30分钟。
    6. 用1x 洗涤缓冲液清洗盘子, 并按照步骤2.10.4 点走多余的液体。使用正苯二胺 (opd) 底物溶液, 该溶液为过氧化物酶提供必要的底物, 在制备后15分钟内产生化学发光。对每个板材使用一片 opd 片, 对11毫升的基材稀释剂使用。
    7. 涡旋 opd 溶液大力溶解它, 并保护它免受光。在包括空白在内的所有井中加入100μl 的 opd 底物溶液。使用分光光度计, 立即读取 450 nm 的吸收率, 每隔1秒重复 10倍, 并进行平均测量。

3. dcas9-vp64 转导

1. 在密度为 2 x 10 6 的 t75 烧瓶中培养完整的 dmem 中的 jurkat t 细胞, 密度为 15 ml 培养基中的 2 x^{10 6}细胞。在具有 5% co2 的37°c 孵化器中培养细胞.
2. 在 233 x g处将细胞向下旋转 5分钟, 然后在减少的血清介质的10毫升中重新悬浮细胞。用血细胞计或自动细胞计数器计数细胞。
3. 在 t75 烧瓶中使用聚乙烯 (补充表 1) 的减少血清培养基 (补充表 1) 中, 在5毫升的5毫升中重新移植和平板 1 x 10 6 jurkat 细胞。加入 hek 293t 调节介质, 含有 1 x¹⁰ 6 dcas9 病毒颗粒。病毒颗粒的数量可以大致从 p24 elisa 计算, 因为 1μgml p24 等于 1 x 10 7 病毒颗粒.将烧瓶放入具有 5% co2 的37°c 孵化器中.

4. 选择和克隆创建

1. 感染后三天, 将 233 x g 的细胞旋转 5分钟 , 并在使用 puromycin 的 dmem 10 毫升中重新悬浮 (补充表 1)。将细胞放入 t75 烧瓶中, 用 5% co2 在37°c 下培养.每隔 3天, 将233xg 的细胞旋转 5分钟, 用完整的 dmem 代替培养基.
2. 使用血细胞计或自动细胞计数器对细胞进行计数。在用组织培养处理的96孔板上, 用 puromycin 在100μl 的 dmem 中的 10, 000 细胞板, 用 puromycin 连续稀释1:1 的下列井的含量。进行24次稀释, 并重复每个盘子 4倍, 以确保每口井有足够数量的细胞。用5% 的 co2 在37°c 下培养细胞.
3. 将克隆细胞膨胀成两个24孔板, 然后膨胀成6孔板, 最终进入 t75 烧瓶。为了专注于其中的三个克隆体, 为其中三个克隆体的6孔板每井 2 x¹⁰ 6 细胞。以非转染 jurkat 细胞为对照, 对其他三口井进行了平板。将细胞放入细胞培养孵化器一夜。
4. 对于 rna 提取, 请使用市售的 rna 隔离试剂盒。在室温下将细胞向下旋转, 在 233 x g处旋转 5分钟, 并取出介质。使用1毫升的移液尖端在350μl 的裂解缓冲液中重新悬浮细胞。在裂解细胞中加入350μl 的70% 乙醇, 与1毫升的管道彻底混合, 并将样品转移到 rna 柱中。
5. 将裂解液以 10, 000 x克的速度旋转 1分钟, 取出流经, 并在试剂盒中添加700μl 的低严格洗涤缓冲液。将裂解液以 10, 000 x克的速度旋转 1分钟, 移除流动, 并将80μl 的 dnase i 溶液从试剂盒添加到色谱柱中;让样品在室温下孵育15分钟。
6. 将裂解液以 10, 000 x克的速度旋转 1分钟, 取出流经, 并在试剂盒中添加700μl 的高须洗涤缓冲液。将裂解液以 10, 000 x克的速度旋转 1分钟, 移开流经, 并在色谱柱上添加700μl 的低强度洗涤缓冲液。
7. 从收集管中取出该柱, 并将其转移到新的收集管。将裂解物以 10, 000 x g的速度旋转 1分钟, 然后将 rna 柱转移到 1.5 ml 管中。在柱中加入50μl 的水, 并以 10, 000 x g的速度旋转1分钟。
8. 使用分光光度计量化 rna 的浓度。预计浓度在 100–500 ngμl 之间, 在1.9–2.1 之间吸收260/280。将 rna 存放在-80°c。
9. 在250μl 管中, 加入1μg 的 rna、4μl 的互补 dna (cdna) 合成缓冲液、1μl 的逆转录酶和水, 最终体积为 20μl. 不包括逆转录酶控制。在热循环器中, 在42°c 合成 cdna 30分钟, 在95°c 合成 5分钟, 以灭活逆转录酶。合成后用60μl 的水稀释 cdna。
10. 制备聚合酶链反应 (pcr), 其中包含5μl 的 sybr 绿色、4μl 的 cdna、0.5μl 的正向引物 (10μm) 和0.5μl 的反向底漆 (10μm)。运行 pcr, 如下所示: 步骤 1 = 95°c 3分钟, 步骤 2 = 95°c 10秒, 步骤 3 = 60°c 为 10秒, 然后重复步骤2和3为30x。
    注: dcas9 正向引物的顺序为 5 '-tcccaccactaagaga, dcas9 反向底漆的顺序为 5 '-ctttgttacccatccct。低黄嘌呤磷甲基转移酶 1 (hprt1) 的正向引物为 5 '-gacccacacaggggggcat, 反向引物为 5 '-gccgcgccctgactactact。

5. grna转导、选择、克隆创造和筛选

1. 用第3节概述的含有 grna 的病毒转化经过验证的 jurkat-dcas9 细胞。选择 dmem 中的细胞与环霉素 (补充表 1) 10天。旋转细胞, 每3天更换一次介质。
2. 对细胞进行连续稀释 (如步骤4.2 所述) 并扩大单个菌落 (如步骤4.3 所述)。完全按照步骤4.5 中所述从菌落中纯化 rna, 并执行步骤4.9 中所述的 cdna 合成。对 goi 和 hprt1 或适当的内部管理基因进行实时 pcr, 类似于步骤4.10 中描述的 pcr, 在这种情况下, 在步骤3之后对每个周期的井进行成像。
3. 使用比较周期阈值 (ct) 方法来确定 goi 8 中的折叠变化。简单地说, 使用下面的公式来计算相对转录水平 (^{rtl): 2-(goi 的平均 ct-家政基因的平均 ct})。然后, 计算控件的平均 rtl, 并将所有 rtl 值除以平均控制 rtl, 以生成与控制样本相比的折叠变化。

结果

一种超微向量系统, 用于超快
本手稿中的示例实验是表示 incrna ifng-as1 9 的 jurkat t 细胞模型系统的过度表达。ifng-as1 是一种与炎症性肠病相关的英卡纳, 被认为可以调节干扰素^{伽玛 10}。ifng-as1 基因包含三个拼接变体, 它们都使用相同的转录起始位点 (图 1a)。因此, grna 序列距离转录起始位点10和 100 bp, 并有一个 "ngg" 序列上游, 用于将 cas9 激活复合体定向到 ifng-as1 的转录位点 (图 1 a)。两个质粒系统被用来将 dcas9 或 grnasp 作为单个质粒单独转化为细胞, 这使得病毒颗粒的产生变得困难, 因为质粒大小 (图 1b)。为了能够选择双转染细胞, dcas9 载体...

讨论

本手稿提出了一种在体外使用激活 crispr 超细的协议。这是研究长期非编码 rna 时的一项特别重要的技术, 因为转录产物是功能单元。在过度表达后, 研究人员可以在研究结合伙伴时使用这些细胞来提高信噪比, 甚至可以测量英 r r a 水平增加对细胞的影响。此外, 由于 incrna 经常作用于顺基因, 这种内源性过度表达技术使这些事件能够被^{研究 11,12.}

这份手稿突出了 grna 生成和慢病毒生成、转导和选择的广义协议, 并概述了在外周血 t 细胞系中的一个典型的 lncRNA 过度表达的例子。此外, 这项技术已经被证明是成功的骨骨髓衍生免疫细胞¹³, 神经元⁷, 小鼠胚胎干细胞¹⁴, 和肾上皮细胞^4.虽然这种协议一般适用于大多数细胞系, 但难以移植的细胞可能需要个别的滴...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
氨苄青霉素	Fisher Scientific	BP1760-5
CaCl2	Sigma Aldrich	C1016
cDNA 合成试剂盒 （iScript）	BioRad	1708891
dCas9 正向引物	Integrated DNA Technologies	n/a	5'-TCGCCACAGCATAAAGAGA
dCas9 反向引物	集成 DNA 技术	n/a	5'-CTTTTCATGGTACGCCACCT
dCas9 载体	Addgene	50918
DMEM	康宁	10013CM
乙醇	Acros Organics	61509-0010
FBS	Sigma Aldrich	F2442
gRNA 质粒	VectorBuilder	VB180119-1195qxv
HEK293T 电池	ATCC&	nbsp;CRL-1573
HEPES	Sigma Aldrich	H3375
HPRT1 正向引物	集成DNA技术	n/a	GACCAGTCAACAGGGGACAT
HPRT1 反向引物	Integrated DNA Technologies	n/a	GCTTGCGACCTTGACCATCT
潮霉素 B	康宁	MT3024CR
异丙醇	Fisher Scientific	BP2618-500
Jurkat 细胞	ATCC&	nbsp;TIB-152	E6-1
L-谷氨酰胺	宁	25005Cl
LB琼脂	Scientific	BP1425-500
LB肉汤	Fisher Scientific	BP1426-2
Maxi制备试剂盒（质粒纯化试剂盒）	Qiagen	12362
Na2< / sub>HPO4< / sub>	Sigma Aldrich
Optimem I 减血清培养基	Gibco	31985070
p24 elisa	Perkin Elmer	NEK050B
PBS	康宁	21-040-CMR
青霉素和链霉素	康宁	30-002-Cl
pMDG2.G	Addgene	#12259
pMDLg/pRRE	Addgene	#60488
聚-L-赖氨酸	Sigma Aldrich	P-4832
聚凝胺	EMD Millipore	TR-1003
pRSV-REV	Addgene	#12253
嘌呤霉素二盐酸盐	Sigma Aldrich	P8833
RNA 纯化试剂盒 （Aurum RNA mini）	BioRad	7326820
丁酸钠	Sigma Aldrich	B5887
SYBR green（iTaq 通用）	BioRad	1725122
Triton X-100	Sigma Aldrich	X100