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体内应用REMOTE-控制系统调控内源性基因表达

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DOI：

10.3791/59235

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2019年3月29日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Center for Epigenetics, Van Andel Research Institute, 2Amgen

本文内容

摘要

本方案概述了构建一种模型系统所需的步骤，该系统可利用增强型lac阻遏蛋白和/或tet激活蛋白系统，在活体动物或细胞中条件性地调控目的内源基因的转录。

摘要

本文介绍了一种实现 REMOTE-控制系统（Reversible Manipulation of Transcription at Endogenous loci，可逆性调控内源位点转录）的实验方案，该系统可在活体模型系统中对目标内源基因实现可逆且可调节的表达控制。REMOTE-控制系统结合了增强型 lac 抑制系统和 tet 激活系统，可在同一生物体系内实现对目标基因的下调或上调。通过抑制转录延伸，即使在转录起始位点下游较远位置灵活设置阻遏蛋白结合位点，也能实现严密的基因抑制。通过将 tet 转录激活因子靶向至相应的启动子区域，可显著增强内源基因的转录水平，实现强效上调。这种可逆且可调的表达控制可在生物体内反复施加和撤除。本系统所展示的强大功能与广泛适用性（如本文中对内源性 Dnmt1 基因的应用），将有助于更精确地开展体内功能研究，使研究人员能够在不同表达水平下探究基因功能，并验证表型变化的可逆性。

引言

基因敲除或转基因方法已被用于 研究基因功能的有效手段。然而，这些方法对基因表达的调控是二元的（开/关）、非时间特异性的，因此无法揭示基因的全部功能谱。条件性Cre/LoxP 技术已实现基因功能的时空特异性失活或激活，但其二元特性仍存在局限性，例如导致细胞死亡和不可逆性1,2,3为了填补这一空白，已开发出使用条件性敲低方法的策略 四环素受调控的shRNA或miRNA4然而，脱靶效应仍然是RNAi面临的一个问题5 并且在体内难以控制. 近年来，CRISPR/Cas介导的转录调控技术为实现内源性基因表达的上调和下调提供了更为通用的方法，并已证明其应用价值6,7然而，CRISPR/Cas介导的转录调控在体内的有效性尚不明确，基于KRAB的抑制作用是否可逆仍有待观察，因为已有研究表明KRAB及其相互作用蛋白KAP1的强烈抑制可导致基因的永久性沉默8,9.

为了解决这些局限性，我们开发了一种新型转录调控系统，该系统利用经过改造的原核生物双组分转录调控系统，可在小鼠中以可逆且可调节的方式条件性地控制内源基因的表达10。含有调控配体的原核双组分转录调控系统（如lac和tet系统）已实现此类可逆且可调的表达控制11,12,13,14。然而，现有双组分系统抑制效力不足，限制了其在哺乳动物内源基因表达调控中的广泛应用。我们开发了一种增强型lac抑制系统，其抑制能力足以有效抑制内源基因，并采用了一种新策略，将tet转录激活因子直接靶向内源基因的对应启动子，从而实现强效的基因上调（图1）10。利用该技术，我们已在小鼠中实现了对内源Dnmt1基因近两个数量级的可调、可诱导且可逆的表达调控10。本文将以小鼠为模式生物，提供该技术在体内应用于其他基因和其他生物的逐步操作指南。

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图1: REMOTE-control 系统概述 内源性靶基因的转录可通过人工设计的 lac 阻遏蛋白和 四环素 激活系统。目标基因的启动子或内含子被改造以包含紧密结合的LacIGY阻遏蛋白的操作子，和/或 rtTA-M2 激活剂。R 表示 Repron复制表达抑制在)，其中包含12个对称的lac操纵序列（S）以及一段部分兔β-珠蛋白内含子。T表示 四环素 操作者。阻遏蛋白和/或激活蛋白由组织特异性启动子表达。通过给予IPTG（异丙基-β-硫代半乳糖苷），可逆地将目标基因的表达调节至所需的表达水平。 β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷（LacIGY阻遏物的拮抗剂）或强力霉素（Dox）。该图已根据Lee等人的研究修改。10 请点击此处以查看此图的放大版本。

在开始本方案之前，请查阅表1，以确定实现目标基因表达调控的相关步骤。例如，若要构建一只能够可逆性下调“Gene X”表达的小鼠，需完成以下方案中的第1、3和4部分。表1还总结了REMOTE控制系统所需的各个组分。

期望的表达变化仅抑制仅激活同时实现抑制和激活
相关实验步骤部分1, 3-42-41-4
靶基因中所需的REMOTE-control序列Repron（“抑制内含子”；包含12个对称的lac操纵子序列及部分兔β-珠蛋白内含子）Tet操纵子序列Repron和Tet操纵子序列
REMOTE-control序列的位置内含子启动子内含子 & 启动子
实现期望调控所需的激活/抑制蛋白LacIGY抑制蛋白rtTA-M2激活蛋白LacIGY抑制蛋白和rtTA-M2激活蛋白
调控配体IPTG强力霉素IPTG和/或强力霉素

表1： REMOTE-control 组件概述。

方案

所有动物实验均经南加州大学和范安德尔研究所的机构动物护理与使用委员会（IACUC）批准，并符合美国国立卫生研究院《实验动物护理与使用指南》的要求15。

1. 为通过 REMOTE-control 实现基因抑制而改造目标基因

  1. 根据以下指南，选择一个位于目标基因5’端、转录上无活性的内含子，用于插入Repron序列（"复制压抑内含子在"；12个对称的lac操纵子序列以及一段部分兔β-珠蛋白内含子）。需注意目的基因可能存在的其他启动子，并根据需要调控的转录本选择合适的内含子（即选择所有转录本共有的内含子，或特定于某一目标转录本的内含子）。
    注意：对于无内含子或内含子位于3’端的基因，应将Repron序列插入启动子区域（参见Lee等人的研究）10 详细步骤参见相关方法。
    1. 获取目的基因的基因组序列。
      1. 进入 UCSC 基因组浏览器16,17，并选择最新版本的小鼠基因组（发表时为 Mouse GRCm38/mm10），该版本目前位于 基因组 表。
      2. 在搜索栏中输入目标基因的名称或符号，以查看该基因的转录本。点击 开始.
      3. 选择目标基因所需的转录本变体。
      4. 点击目标转录本变体旁边的基因符号（先前所选转录本的符号将以深色显示） 盒
      5. 在……之下 序列及工具与数据库链接 横幅，点击 基因组序列 链接。
      6. 对于 序列获取区域选项，仅选择外显子（5’非翻译区、编码序列和3’非翻译区）、内含子以及默认选项 每个基因一条 FASTA 记录。对于 序列格式化选项，选择 外显子用大写，其余部分用小写 和 将重复序列标记为 N （用于隐藏重复序列）。然后单击 提交.
      7. 保存此序列，保留大小写格式，并存入可进行注释的文档或程序中。
    2. 避免中断CpG岛，因其可能指示具有基因调控功能的区域。
      注意：尽管将Repron序列插入5’内含子较为理想，但首个内含子可能含有转录调控元件，例如CpG岛（本步骤中检测）或增强子元件（步骤1.1.4中检测），这些区域应避免用于Repron序列的插入。
      1. 在……之下 表达与调控 UCSC基因组浏览器横幅，选择 显示 对于 CpG岛 追踪，然后单击 刷新.
      2. 放大查看5’端内含子区域，点击每个CpG岛（若存在，在发表时以绿色显示），并选择 查看此特征的 DNA.
      3. 选择后 将重复序列标记为 N，选择 获取DNA 以获取CpG岛序列。
      4. 将这些序列与原始序列文件进行比对，并将这些区域注释为内含子区域，因其可能具有基因调控功能而应予以避免。
    3. 避免中断非编码RNA，以防其具有调控功能。
      1. 在……之下 基因与基因预测 UCSC基因组浏览器横幅，选择 显示 对于 GENCODE（Ensembl） 追踪，然后单击 刷新.
      2. 放大查看5’端内含子区域，点击每个非编码RNA（若存在，在发表时以绿色显示），并通过点击其染色体坐标获取每个非编码RNA的DNA序列。
      3. 在 查看 下拉菜单，选择 DNA，然后单击 将重复序列标记为 N然后点击 获取DNA.
      4. 将这些序列与原始序列文件进行比对，标注为内含子区域，以避免因可能存在的基因调控功能而产生干扰。
    4. 避免选择在目标组织中具有增强子特征的内含子区域，例如 H3K4me1、H3K27ac 和 DNase I 超敏感位点18,19,20,21以及调控增强子成环的 CTCF 结合位点22,23.
      1. 访问ENCODE数据库24,25，并选择 实验 图标。
      2. 对于检测类型，选择 ChIP-seq 或 DNase-seq，并填充其他类别（生物体, 生物样本类型，等等），具体取决于待改造的细胞类型。
      3. 特征选择后，将鼠标悬停在蓝色图示上，并选择所需的图示 以列表形式查看结果 显示（发布时最左侧的象形图）。
      4. 选择与待改造细胞最匹配的 H3K4me1、H3K27ac、DNase I 和 CTCF 的数据集。
      5. 在每个相关数据集中，滚动至 文件 切片，确认已选择 mm10（或最新基因组版本）和 UCSC，然后单击 可视化 按钮
      6. 现在进入 UCSC 基因组浏览器，定位到目标基因的 5’ 内含子区域，依次点击各自注释峰轨道中的 H3K4me1、H3K27ac、DNase I 和 CTCF 峰。
      7. 通过点击每个峰区域的染色体坐标获取其DNA序列。
      8. 在 查看 下拉菜单，选择 DNA，然后单击 将重复序列标记为 N然后点击 获取 DNA.
      9. 将这些序列与原始序列文件进行比对，并将其注释为内含子区域，以避免因可能存在的基因调控功能而产生干扰。
    5. 避免破坏剪接共识序列，以免干扰外显子的正确剪接。
      注意：尽管剪接所需的序列主要局限于5'端约六个碱基处 内含子26 3'末端约60个碱基27建议选择较大的内含子，以便在这些保守区域周围留出更宽的边界，从而最大限度地降低影响剪接的可能性。可使用内含子分析工具（如SVM-BPfinder）28建议进行更全面的潜在剪接序列分析。
  2. 在确定了符合上述标准的内含子区域后（如下文示例所示） Dnmt1 在补充数据中，使用在线sgRNA设计工具对序列进行筛选，以鉴定出具有高特异性和高预测效率得分的靶向该区域的sgRNA。
    1. 访问一个在线sgRNA设计工具，例如CRISPOR29.
    2. 输入目标内含子区域的序列，指定相关的参考基因组，并选择所需的原型间隔序列邻近基序（PAM）。点击 提交.
    3. 根据特异性评分对预测的sgRNA进行排序，并选择一个或多个同时具有较高预测效率评分的sgRNA29.
      1. 可选：为了最大程度确保使用高效的sgRNA，可先在体外实验中检测若干高分sgRNA的切割效率30，并在体内实验中采用最高效的sgRNA。
  3. 设计一个包含PITT（基于原核显微注射的靶向转基因）着陆位点序列的DNA模板，示例如下 补充图 1A,B，两侧各带有一段60个碱基的同源臂，对应于sgRNA切割位点31.
    注意：着陆垫包含两个异型 loxP 位点（JT15 和 Lox2272），并通过两步法实现大片段序列的靶向插入；需确保该插入的连接处不会形成隐蔽的剪接位点。或者，可采用基于胚胎干细胞（ESC）的基因敲入策略，直接插入 Repron 序列。
  4. 准备用于着陆垫的sgRNA、Cas9蛋白和单链DNA（ssDNA）模板，并按照既定方案将上述成分显微注射至受精卵（来自B6C3F1/J小鼠或其他所需品系）中32,33.
  5. 筛选带有着陆垫基因敲入的小鼠。
    1. 设计与基因组位点互补的PCR引物，但引物结合区域应位于同源臂所靶向区域之外，如所示 Dnmt1 在 补充图1C设计引物时应避免重复的基因组序列。
    2. 根据既定方案从鼠尾组织样本中提取DNA34.
    3. 使用 PCR 和凝胶电泳鉴定带有着陆垫插入的小鼠。
    4. 通过测序PCR产物确认敲入是否成功。
      注意：CRISPR/Cas9 可能导致非预期的大片段缺失和重排35因此，建议在继续实验前仔细筛查脱靶编辑效应35,36,37.
  6. 利用着陆垫小鼠的受精卵，显微注射 iCre mRNA38 以及一个包含Repron序列的转基因质粒，该序列两侧分别为JTZ17和Lox2272重组位点31,39,40,41 根据既定方法38,42,43.
  7. 筛选带有 Repron 插入的小鼠。
    1. 设计与基因组位点互补的PCR引物，引物位置应位于Repron插入片段之外。设计引物时应避开重复的基因组序列。
    2. 根据既定方案从鼠尾组织样本中提取DNA34.
    3. 使用 PCR 和琼脂糖凝胶电泳鉴定携带 Repron 插入片段的小鼠。
    4. 通过测序PCR产物确认敲入成功。

2. 利用REMOTE-control技术对目标基因进行上调修饰

  1. 根据以下指南，确定目标基因启动子中一个区域，该区域在插入tet操纵序列后不太可能干扰启动子功能。需注意目标基因是否存在替代启动子，并根据拟调控的转录本（即所有转录本共用的启动子或特定于某一转录本的启动子）选择合适的启动子。
    1. 获取目标启动子的基因组序列。
      1. 访问 UCSC 基因组浏览器16,17，选择最新版本的小鼠基因组（在本文发表时为 Mouse GRCm38/mm10），该版本位于Genomes标签页下。
      2. 在搜索栏中输入目标基因的名称或符号，以查看该基因的转录本。点击go。
      3. 选择目标基因所需的转录本变体。
      4. 点击目标转录本变体旁边显示的基因符号（先前选定的转录本对应的基因符号将位于深色框内）。
      5. 在Sequence and Links to Tools and Databases横幅下，点击Genomic Sequence链接。
      6. 在Sequence Retrieval Region Options中，仅选择Promoter/Upstream by 1000 bases；在Sequence Formatting Options中，选择Mask Repeats to N（用于遮蔽重复序列）。然后点击submit。
      7. 将此启动子序列保存至可进行注释的文档或程序中。
    2. 选择不含假定转录因子结合位点的区域，因为中断这些序列可能改变内源性基因表达。
      1. 访问 UCSC 基因组浏览器，并打开最新版本的小鼠基因组。
      2. 在Mapping and Sequencing横幅上方，选择track hubs。
      3. 点击JASPAR 2018 TFBS（或最新版本的 JASPAR）集线器名称旁边的mm10。
      4. 在搜索栏中输入目标基因的名称或符号以查看其转录本。点击go。
      5. 选择目标基因所需的转录本变体。
      6. 向下滚动至JASPAR 2018 TFBS横幅，点击下拉箭头以选择轨道的显示方式（如squish），然后点击refresh。
      7. 放大目标基因的启动子区域，根据 JASPAR 轨道识别无（或相对较少）转录因子结合位点的区域，并记录这些区域的染色体坐标。
      8. 将这些染色体坐标输入搜索栏并点击go，以获取其基因组序列。在View下拉菜单中选择DNA，并点击Mask repeats to N，然后点击get DNA。
      9. 将这些序列与原始序列文件进行比对，并标注为理想的靶向启动子区域（因其缺乏转录因子结合位点）。
    3. 在上述序列中，选择一个位于转录起始位点上游但靠近该位点的可插入启动子区域。
      注：插入位点若过于接近转录起始位点，可能增加损害启动子活性的风险；而插入位点过远则可能降低上调水平。已有研究表明，在转录起始位点上游约 200 个碱基对处插入tet操纵序列，可实现两个测试启动子的显著上调（见讨论部分）10。
  2. 使用在线 sgRNA 设计工具对选定的启动子区域进行筛选，以识别出特异性高且预测效率得分高的 sgRNA。
    1. 访问一个在线 sgRNA 设计工具，例如 CRISPOR29。
    2. 输入目标区域的序列，指定相关参考基因组，并选择所需的原间隔序列邻近基序（PAM）。点击Submit。
    3. 按特异性评分对预测的 sgRNA 进行排序，并选择一个或多个同时具有高预测效率评分的 sgRNA29。
      1. 可选：为最大程度确保使用有效的 sgRNA，可先在体外实验中测试多个 sgRNA 的切割效率30，然后在体内实验中使用效率最高的 sgRNA。
  3. 设计一个 DNA 模板，其中包含两侧各带 60 个碱基同源臂的tet操纵序列，同源臂应与 sgRNA 切割位点匹配31,33。
    注：tet操纵序列的数量可根据需要定制；已有研究显示串联插入两个至四个tet操纵序列是有效的，但原则上更多操纵序列更有利于驱动更高表达。此外，也可采用基于胚胎干细胞（ESC）的敲入策略插入tet操纵序列。
    1. 可选：为获得实验证据证明所设计的修饰不太可能破坏目标基因的内源性转录活性，可将改造后的启动子序列克隆至萤光素酶载体（如 pGL3-Basic）中，并通过萤光素酶检测比较其与原始启动子的活性。
  4. 制备包含tet操纵序列的 sgRNA、Cas9 蛋白和单链 DNA（ssDNA）模板，并按照既定方案将其显微注射至受精卵中（来自 B6C3F1/J 小鼠或其他所需品系）32,33。
    注：由于重复序列合成较为复杂，建议采用体外转录/逆转录方法，从双链 DNA（dsDNA）质粒合成 ssDNA 模板44。也可使用 dsDNA 模板进行显微注射，但敲入效率可能降低45。
  5. 筛选成功敲入tet操纵序列的小鼠。
    1. 设计与基因组位点互补的 PCR 引物，引物应位于同源臂靶向区域之外。设计引物时应避免重复的基因组序列。
    2. 根据既定方案从小鼠尾部组织提取 DNA34。
    3. 通过 PCR 和琼脂糖凝胶电泳鉴定成功插入tet操纵序列的小鼠。
    4. 对 PCR 产物进行测序，以确认敲入成功。
      注：CRISPR/Cas9 可能引入非预期的大片段缺失或重排35，因此在继续实验前建议仔细筛查脱靶编辑事件35,36,37。

3. 构建表达激活因子和/或抑制因子的小鼠模型

  1. 确定在目标组织或细胞类型中能够强效表达的启动子。
    注意：通过文献检索以及组织特异性启动子数据库46可能有助于识别此类启动子。
  2. 将提供的增强型 lac 阻遏蛋白或 tet 激活蛋白序列 置于目标启动子的下游，以构建转基因载体。
  3. 采用标准的转基因技术生成转基因小鼠品系42,43,47。或者，也可采用位点特异性转基因方法，以避免位置效应并实现单拷贝转基因插入31,48。
  4. 扩繁原始 founder 小鼠，并确定每个 founder 后代中转基因的表达模式和表达水平。选择在目标组织类型中表达强烈的品系进行后续育种。
    1. 将 founder 小鼠与野生型小鼠交配。
    2. 设计可检测激活蛋白和/或阻遏蛋白插入的 PCR 引物。
    3. 根据已建立的实验方案34，从小鼠断尾样本中提取基因组 DNA。
    4. 利用 PCR 和琼脂糖凝胶电泳鉴定携带转基因插入的小鼠。
    5. 通过测序 PCR 产物确认转基因的正确插入。
    6. 扩增转基因品系。
    7. 处死每个品系的部分仔鼠，收集目标组织，用于 qRT-PCR、免疫组织化学和/或蛋白质印迹分析，以检测目的基因/蛋白在靶组织中的表达情况。
    8. 选择在目标组织中表达最强的品系，用于第 4 节实验。

4. 在体内调控基因表达

  1. 根据既定的繁育方法49，将带有目标修饰基因的小鼠（第1节和/或第2节）与第3节中的转基因小鼠进行交配。为实现最大程度的表达调控，应将小鼠繁育至目标修饰等位基因的纯合状态。
  2. 为逆转或调节目标基因的抑制状态，可在饮水中给予异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）。
    1. 为实验性确定所用IPTG剂量，使用一系列不同浓度的IPTG（推荐起始范围：0 – 400 mM IPTG）处理相应基因型的小鼠及对照组小鼠，处理时间至少持续一周50,51。每组处理至少包含三只小鼠，并选择与后续计划实验最相关的年龄和性别。注：如需使子代在发育阶段暴露于IPTG，可对繁殖用小鼠配对给予含IPTG的饮水13；也可在出生后任意时间开始处理小鼠。
      1. 在给药当天，将所需质量的IPTG溶解于无菌蒸馏水中，使用磁力搅拌器搅拌5分钟或直至完全溶解。
      2. 用铝箔包裹瓶子，并将IPTG水置于避光瓶中给予小鼠。每周更换两次。对于接受0 mM IPTG处理的小鼠，提供 相同来源的饮水。
      3. 处理至少一周后，处死小鼠，并采用qRT-PCR、免疫组织化学和/或蛋白质印迹法分析目标组织中目标基因的表达水平。
      4. 确定能够将目标基因表达恢复至野生型对照水平的IPTG剂量，并在后续实验中使用该剂量以实现基因的正常表达。
  3. 为诱导基因上调表达，可在饲料中给予多西环素（Dox）。
    1. 为实验性确定Dox的给药浓度，使用一系列不同浓度的Dox（推荐起始范围：0 – 5000 mg/kg 盐酸多西环素）处理相应基因型的小鼠及对照组小鼠，处理时间至少持续一周52,53，每组处理至少包含三只小鼠。含Dox的鼠粮应从商业供应商处购买。
      注：如需使子代在发育阶段暴露于Dox，可对繁殖用小鼠配对给予含Dox的饲料54,55；也可在出生后任意时间开始处理小鼠。
    2. 每周更换一次饲料。对于接受无Dox饲料的小鼠，提供相同的基礎饲料。
    3. 处理至少一周后，处死小鼠，并采用qRT-PCR、免疫组织化学和/或蛋白质印迹法分析目标组织中目标基因的表达水平。
    4. 确定能够将目标基因表达提升至预期水平的Dox剂量，并在后续实验中使用该剂量以实现基因的过表达。

结果

迄今为止，REMOTE-控制系统在两种不同策略中均展示了其抑制能力。第一种策略是在Dnmt1基因的内源性启动子区域插入lac阻遏蛋白结合位点。本方案推荐使用第二种策略，即将阻遏蛋白结合位点插入下游内含子中，以避免插入操作可能对启动子功能造成的影响，从而简化REMOTE-控制系统的应用。两种策略均实现了有效的基因抑制（图2A,B 和 图3A-C）10。采用基于启动子的策略时，Dnmt1的表达被抑制至未调控水平的15%（图2A）。这种强效抑制可通过给予不同剂量的IPTG处理小鼠而呈剂量依赖性地逆转（图2A）。通过免疫染色实验在蛋白质水平验证了所观察到的Dnmt1表达抑制效果（图2B）。我们未观察到Dnmt1+/+与Dnmt1LO/LO小鼠之间Dnmt1表达存在明显差异，证实了我们的lac 操纵子插入并未破坏启动子的正常功能10。基于内含子的策略通过削弱转录延伸，在距转录起始位点数个千碱基下游的操纵子位置实现了超过90%的抑制效率（图3A, B）10。该基于内含子的策略还在另外七个强效启动子上得到了进一步验证（图3C）。在所有测试的启动子中均实现了稳定且强效的抑制。残余表达水平与启动子强度之间未观察到相关性，表明我们基于内含子的抑制系统的抑制能力超过了所测试的所有强效启动子的转录活性（图3C）。

REMOTE-控制系统的体内上调能力也在Dnmt1基因上得到验证。我们在Dnmt1基因启动子中引入了两份tet操纵序列，并同时加入lac操纵序列，从而可根据存在的效应蛋白实现基因表达的上调或下调。在携带修饰后内源性Dnmt1等位基因（Dnmt1LGT）的胚胎干细胞（ESCs）中，实现了对Dnmt1表达的显著上调和下调，变化幅度接近两个数量级（10%至650%）（图4A）10。两种调控均可逆，并分别通过IPTG和Dox处理实现诱导（图4A）。随后，我们将Dnmt1LGT修饰引入小鼠生殖系，以检测REMOTE-控制系统在体内的上调能力。在肝脏、脾脏和肾脏中均观察到Dnmt1的强烈上调，而在心脏中未检测到明显的上调（图4B）7。这种组织差异可能与Dnmt1基因表达的细胞周期依赖性模式以及心脏中增殖细胞数量稀少有关10,56。这一局限性是否能通过提高激活蛋白的表达水平或增加其结合位点数量来克服，仍有待进一步研究。

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图 2：LacIGY 抑制因子在体内对 Dnmt1 的抑制作用。（A）将含有插入 Dnmt1 启动子区的 lac 操纵序列（LO）且表达或不表达 LacIGY 的小鼠，用不同剂量的 IPTG 进行处理。通过 qRT-PCR 分析 Dnmt1 的表达水平，结果显示 IPTG 处理可剂量依赖性地逆转体内 Dnmt1 的抑制状态。每根柱状图代表来自不同小鼠的数据。数据以均值 ± 标准误表示（n = 3）。（B）给予小鼠饮用含或不含 160 mM IPTG 的水持续 3 周后，对其结肠隐窝中 Dnmt1 蛋白进行免疫染色检测。该图经 Lee 等人10 修改。 请点击此处查看此图的放大版本。

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图3: 在体 以及REMOTE-control系统对多种启动子的体外抑制作用。 (A) 一种早期版本的Repron序列（R*）被插入到外显子下游的一个内含子中 Villin 启动子在一个 Villin-mKate2 转基因小鼠VilmKate2）。qRT-PCR 分析 mKate2 小鼠小肠中基因或蛋白的表达情况，无论是否存在特定条件或基因型 LacIGY 阻遏蛋白的表达情况如图所示。每根柱状图代表来自不同小鼠的数据。B) 小肠有无 mKate2 的共聚焦图像 LacIGY 表达。C在不同启动子与荧光素酶报告基因之间插入了六个对称的lac操纵序列（S）。将报告基因质粒（每孔50 ng，96孔板）与阻遏质粒以1:1的摩尔比瞬时转染入NIH/3T3细胞。转染24小时后检测荧光素酶活性。这些 体外数据表示荧光素酶表达的百分比 LacIGY表达非功能性蛋白的细胞相比，表达目标蛋白的细胞 LacI (NFlacI). t检验 用于确定统计学显著性。数据表示为均值 ± 扫描电子显微镜（SEM）n = 3). *P ≤ 0.05, **P ≤ 0.01。该图改编自 Lee 等人。10 请点击此处以查看此图的放大版本。

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图 4：体外和体内Dnmt1表达的下调和/或上调。(A) 通过基因靶向和电穿孔方法，在培养的胚胎干细胞（ESCs）中构建了完整的REMOTE-控制体系。在无任何处理条件下，Dnmt1表达达到最大程度的抑制；而在IPTG和Dox处理下，则实现最大程度的激活。数据表示为均值 ± 标准误（n = 3）。*P ≤ 0.05，**P ≤ 0.01（Welch’s t-检验）。(B) REMOTE-控制系统在体内对Dnmt1的激活作用，通过REMOTE-控制小鼠多种组织中Dnmt1蛋白的免疫染色得以证实。LGT等位基因代表Dnmt1启动子经修饰后含有lac操纵子序列和tet激活因子结合位点。小鼠接受正常饮食或含Dox饮食（5000 mg/kg 盐酸多西环素）处理一个月。本图经Lee等10修改请点击此处查看此图的放大版本

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补充图1：着陆平台插入小鼠Dnmt1第一内含子的示例。（A）用于插入着陆平台的DNA模板示意图，改编自Quadros等（2015）31。异型loxP位点JT15和Lox2272之间由一段短的间隔序列（sp）分隔，并在两侧各带有60 bp与目标基因组区域同源的DNA序列。（B）将着陆平台插入Dnmt1内含子的示例DNA模板，所用sgRNA序列为：CTAGTACCACTCCTGTACCG（靶向反义链）。所选内含子区域由步骤1.1通过生物信息学分析确定，sgRNA序列使用CRISPOR29工具筛选获得。（C）用于检测着陆平台插入的PCR引物设计示例。PCR引物设计在模板同源臂之外，以确认着陆平台已整合至内源性Dnmt1基因座。野生型PCR扩增产物为213 bp；插入成功后扩增产物变为291 bp。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

REMOTE-控制系统的关键步骤及潜在局限性在于，插入阻遏蛋白和/或激活蛋白结合位点时可能会影响目标基因的表达。我们最初针对 Dnmt1 基因所采用的阻遏策略，是在启动子的转录关键区域插入 lac 阻遏蛋白结合位点。为了降低影响启动子功能的风险，从而提高 REMOTE-控制系统的一般适用性，我们开发了一种基于内含子的阻遏策略。我们改进后的 lac 系统具有很强的阻遏能力，能够在转录起始位点下游数百至数千碱基对处的操纵子位置，有效抑制所有测试强启动子的转录（图3A–C）10。重要的是，阻遏水平与启动子的转录强度无关（图3A–C）10，这表明我们基于内含子的阻遏系统的阻遏能力超过了所测试启动子的转录强度。在这种基于内含子的策略中，阻遏作用很可能是通过转录延伸机器与lac阻遏蛋白之间的物理干扰介导的57。这种简单的阻遏机制以及基于内含子方法已证实的稳健性，使其可能广泛适用于不同的基因、组织和生物体。

远程控制系统对基因的上调作用需要转录激活因子结合序列位于目标基因启动子附近，这有可能影响启动子功能。然而，我们发现结合序列的位置可位于转录关键区域之外。两者 Dnmt1 和 EF1α 启动子被显著上调 四环素 位于转录起始位点上游几百个碱基处的操纵子10这种宽松的限制条件大大降低了在缺乏转录激活因子的情况下影响目标基因启动子功能的可能性。增加 结合位点的数量增加和/或使用更强的转录激活因子可能有助于进一步降低风险，从而实现对远离转录起始位点的区域进行上调。

我们的 REMOTE-控制 系统能够优雅地调控内源基因表达的水平、时间和空间位置，从而可检验表型的可逆性以及不同表达水平所导致的生物学后果，而这些目标是目前现有的体内基因表达调控技术难以实现的。需要指出的是，在包括本研究在内的大多数基因表达分析中，表达值代表的是细胞群体的平均值，而该群体内部存在显著的异质性。这种异质性可能影响细胞命运决定过程，例如分化或凋亡58。尽管通过进一步的基因线路工程设计，基因表达调控的精确性有望进一步提高59，但本系统当前所展现的强大效能已足以在多种生物学背景下有效探究基因功能。此外，由于操纵子序列的复杂性以及调控元件来源物种与哺乳动物之间较大的进化距离，预期该系统具有高度的靶向特异性60。同时，还可针对任意内源基因构建并利用表达阻遏蛋白或激活蛋白的转基因小鼠品系。例如，现有的 tet 转录激活因子小鼠模型可被改造，以实现目标基因在特定小鼠组织中的上调表达。我们近期构建了一种转基因小鼠品系，通过将 lacIGY 基因插入 Hipp11 位点，并在 Lox-STOP-Lox 元件的控制下（未发表），结合现有的 Cre 小鼠品系，可在多种组织类型中驱动增强型 lac 阻遏蛋白的强效、组织特异性表达48。该品系将极大促进 REMOTE-控制 系统在组织特异性研究中的应用。

与现有的可诱导转基因方法相比，REMOTE-控制系统在基因上调方面具有多项优势。该方法利用内源性基因座，无需构建多个转基因品系以检测插入位点的位置效应。此外，由于该方法可在原本即具有较强活性的启动子上进一步增强基因表达，因此特别适用于基础表达水平较高的基因上调；而传统的转基因模型则依赖于较弱的病毒最小启动子。最后，本方法在基因上调过程中可保留目标基因的组织特异性、细胞周期调控以及剪接变异体等特征，因为它保留了天然的调控元件，例如内源性的cis-调控元件。随着CRISPR/Cas介导的基因靶向技术的发展，该技术将在多种模式系统中得到更广泛的应用。

披露

PWL 任职于 AnchorDx 和 Progenity, Inc. 的科学咨询委员会。

致谢

我们感谢已故的Heidi Scrable博士（梅奥诊所，美国明尼苏达州罗切斯特）慷慨赠送哺乳动物lacI基因构建体，感谢Daniel Louvard博士（法国巴黎居里研究所）提供Villin启动子，以及感谢Laurie Jackson-Grusby博士（美国马萨诸塞州波士顿儿童医院）在该技术开发早期阶段所做出的贡献。我们感谢Nancy Wu博士和Robert Maxson博士在构建转基因和基因敲除小鼠过程中提供的帮助。我们感谢Laird实验室成员给予的有益讨论与支持。本研究由美国国立卫生研究院资助［R01 CA75090、R01 DA030325、R01 CA157918 和 R01 CA212374 至 P.W.L.，以及 1F31CA213897-01A1 至 N.A.V.S］。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
B6C3F1/J杰克逊实验室100010https://www.jax.org/strain/100010
Cas9蛋白PNA BioCP04http://www.pnabio.com/products/CRISPR_Cas9.htm?gclid=EAIaIQobChMIsoG8pLL33QIVBr7ACh0naQ4dEAAYAiAAEgKyHvD_BwE
CRISPORHaeussler 等，2016http://crispor.tefor.net/
含多西环素的小鼠饮食Envigo因浓度而异https://www.envigo.com/products-services/teklad/laboratory-animal-diets/custom-research/doxycycline-diets/
ENCODE 数据库斯坦福大学https://www.encodeproject.org/
iCre mRNA合成质粒（pBBI）Addgene65795https://www.addgene.org/65795/
IPTGGoldBioI2481Chttps://www.goldbio.com/search?isSearch=Y&q=IPTG
pGL3-BasicPromegaE1751https://www.promega.com/products/reporter-assays-and-transfection/reporter-vectors-and-cell-lines/pgl3-luciferase-reporter-vectors/?catNum=E1751
SVM-BPfinder调控基因组学，庞培法布拉大学http://regulatorygenomics.upf.edu/Software/SVM_BP/
TiProD：组织特异性启动子数据库生物信息学系，UMG， 中国台湾大学öttingen http://tiprod.bioinf.med.uni-goettingen.de
UCSC基因组浏览器加利福尼亚大学圣克鲁兹分校https://genome.ucsc.edu/

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Lac Tet IPTG
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